传染性法氏囊病病毒非结构蛋白VP5的原核表达及多克隆抗体的制备

利用PCR技术,从传染性法氏囊病病毒（IBDV）Gx,Gt毒株中分别扩增出VP5基因,将其克隆到表达载体pET30a、pET28a中。经PCR、酶切和序列分析鉴定获得重组质粒命名为pET28a-GtVP5、pET30a-GxVP5。将pET30a-GxVP5、pET28a-GtVP5分别转化宿主菌BL21(DE3),在IPTG诱导下均成功表达约24 kDa的Gx-VP5及23kDa的Gt-VP5融合蛋白,并都以包涵体形式存在。将Gx-VP5纯化后的蛋白免疫8周龄BALB/c雌鼠,ELISA分析表明制备的抗血清效价在1:25600以上,Western blot分析VP5表达产物能与抗6×His mAb及抗IBDV多克隆抗血清发生反应,具有良好的免疫反应特异性。     

传染性法氏囊病病毒多聚蛋白基因在家蚕中的表达

将传染性法氏囊病病毒(IBDV)细胞致弱株(JD1株)的基因组A节段基因重组于家蚕杆状病毒转移载体pAcHLT-C中,获得的重组转移载体pAcHLT-C-A与线性化病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕培养细胞,获得重组病毒BacPAK-A。DIG标记的DNA点杂交证实重组病毒基因组中含有A节段基因,重组病毒感染家蚕5龄幼虫进行表达, ELISA和Western blotting等结果表明多聚蛋白基因在蚕体内得到了表达,表达产物具有免疫反应性,表达量在感染后5～6 d达到最高。家蚕生物反应器表达IBDV多聚蛋白具有我国的资源优势,为今后研制低成本、实用化的IBDV基因工程疫苗打下基础。     

鸡传染性法氏囊病病毒Gt株VP5基因缺失株感染性克隆的构建

传染性法氏囊病病毒 (IBDV)是双链,双节段RNA病毒,其基因组由A、B两个节段组成,编码结构蛋白VP1-VP4和非结构蛋白VP5。【目的】利用反向遗传操作构建拯救VP5基因缺失重组IBDV。【方法】利用体外定点突变技术,缺失IBDV Gt株VP5基因,通过多重PCR在基因组两端分别引入锤头状核酶序列(HamRz)和丁肝病毒核酶序列(HdvRz)。将带有核酶序列的IBDV基因组插入载体pCAGG的b肌动蛋白启动子下游,构建了IBDV感染性克隆pCAGGmGtA △VP5HRT,将该感染性克隆与pCAGGmGtBHRT共转染DFⅠ细胞。【结果】RT-PCR和间接免疫荧光均显示获得重组病毒,将其命名为rmGtA △VP5。IBDV VP5基因缺失感染性克隆的成功构建为从分子水平上深入研究vp5基因功能奠定了基础。     

传染性法氏囊病病毒野毒株的致病性及其vp2基因比较

对4个IBDV野毒株的致病性和它们的vp2基因高变区序列同时做了比较分析.结果表明,4个IBDV毒株在致病性程度上存在较大差异.其中有一个是真正的超强毒,即GX8/99,其他几个虽然达不到真正超强毒的毒力,但也比经典的标准毒的致死性高得多.在vp2基因高变区,这4个IBDV野毒株与超强毒参考株HK46同源性很高,在DNA水平为96.8%～99.5%,在氨基酸(aa)水平为96.6%～100%.而与疫苗毒D78有很大差异,分别只有91.7%～93.6%和91.8%～93.2%.说明IBDV毒株的vp2基因高变区确实与其致病性有一定关系.特别是SD-1/97、SD-3/98、JS-30/99株之间及其与HK46在DNA和aa水平的同源性高达98.4%和98.6%以上,SD-3/99、JS-30/99株之间及其与HK46的氨基酸同源性为100%.然而,致病性特别高的GX8/99株病毒与其他3个野毒株及HK46在DNA和氨基酸水平的同源性相对较低,在DNA和aa水平的同源性只有96.8%～97.2%和96.6%～97.9%.相对于国内的流行毒株和香港超强毒参考株HK46,GX8/99株在致病性和VP2高变区都已发生了一定的变异.     

传染性法氏囊病病毒VP4蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

传染性法氏囊病病毒(IBDV)蛋白VP4在抑制宿主免疫应答中起重要作用,为制备IBDV VP4的单克隆抗体,以实验室保存的融合蛋白His-VP4免疫BALB/c小鼠,经过细胞融合、筛选、亚克隆后获得4株能稳定分泌抗VP4的单抗杂交瘤细胞株,分别命名为3B3、3H11、4C8和4G6,经间接ELISA测定4株单抗的亲和力解离常数分别为4.61×10–11、1.71×10–10、4.26×10–11和5.02×10–11,均为高亲和力抗体。4株单抗的重链类型分别为Ig G1、Ig G1、Ig G2b和Ig G1。进一步以Western blotting鉴定,该4株单抗均能特异地识别IBDV的VP4蛋白,间接免疫荧光和Western blotting试验表明4株单抗均能识别IBDV感染DF-1细胞后产生的VP4蛋白。该单抗为检测IBDV以及研究IBDV VP4的生物学作用奠定了基础。     

法氏囊病病毒vp2基因在酵母中的分泌表达及鉴定

应用Pichia酵母表达系统高效分泌表达了传染性传染性法氏囊病病毒vp2基因片段。首先用Primer5．0设计1对引物P1、P2,以插入IBDV vp2基因的PMDl8-T-VP2载体为模板,扩增出带有终止密码子的1.4kb片段,将此片段正向亚克隆到酵母表达载体pPICZα-A上,将构建好的重组载体pPICZα-A-VP2用Sac Ⅰ内切酶线性化后,电击转化整合入Pichia PastorisX-33酵母菌,经高浓度Zeocin^TM筛选、表型鉴定、诱导表达及表达产物的鉴定,得到高效表达vp2基因的酵母工程菌X-33／pPICZα-A-VP2。工程菌72h培养上清的SDS-PAGE电泳与免疫印迹结果显示,vp2基因表达产物大小约为55kDa,比预期的41kDa大。凝胶薄层扫描结合Bradford蛋白质总含量测定结果表明,表达产物占工程菌培养上清总蛋白的28％,表达量可达23mg／L。间接ELISA结果表明重组表达产物能够有效地区分法氏囊病病毒标准阳性与阴性血清。     

鸡传染性法氏囊病病毒研究进展

传染性法氏囊病(Infection bursal disease, IBD)是由鸡传染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV)引起的鸡和火鸡的一种高度接触性传染病,给世界各国的禽养殖业带来了巨大损失。自IBDV发现至今新的变异株不断出现,分子结构的改变导致病毒致病力的改变及宿主对疫苗应答的改变,使得传统的疫苗已不能控制其流行,因此各国学者对其基因组结构和功能进行了广泛深入的研究,并积极研制新型有效的疫苗以达到防治的目的。 1 基因组结构和功能 IBDV基因组由A(3.2kb)、B(2.8kb)两个双链RNA节段构成。A编码形成VP2蛋白(37-40k…     

传染性法氏囊病病毒VP3结构蛋白基因在大肠杆菌中的高效表达

传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）是危害养鸡业的重要病原之一,属双股双节段ＲＮＡ病毒科成员,由Ａ和Ｂ两个片段的ｄｓＲＮＡ构成,大小分别约３３００－３４００ｂｐ和２８００－２９００ｂｐ。基因片段Ａ首先编码ＶＰ２－ＶＰ４－ＶＰ３聚合蛋白,然后再断裂成ＶＰ３、...     

法氏囊病病毒vp2基因在酵母中的分泌表达及鉴定

应用Pichia酵母表达系统高效分泌表达了传染性传染性法氏囊病病毒vp2基因片段.首先用Primer5.0设计1对引物P1、P2,以插入IBDV vp2基因的PMD18-T-VP2载体为模板,扩增出带有终止密码子的1.4kb片段,将此片段正向亚克隆到酵母表达载体pPICZα-A上,将构建好的重组载体pPICZα-A-VP2用Sac Ⅰ内切酶线性化后,电击转化整合入Pichia PastorisX-33酵母菌,经高浓度ZeocinTM筛选、表型鉴定、诱导表达及表达产物的鉴定,得到高效表达vp2基因的酵母工程菌X-33/pPICZα-A-VP2.工程菌72h培养上清的SDS-PAGE电泳与免疫印迹结果显示,vp2基因表达产物大小约为55 kDa,比预期的41kDa大.凝胶薄层扫描结合Bradford蛋白质总含量测定结果表明,表达产物占工程菌培养上清总蛋白的28%,表达量可达23 mg/L.间接ELISA结果表明重组表达产物能够有效地区分法氏囊病病毒标准阳性与阴性血清.     

禽IL-2与传染性法氏囊VP2融合蛋白免疫学特性

为研究禽细胞因子IL-2与IBDV主要保护性抗原VP2基因融合蛋白的免疫学特性,将重组的rVP2-IL-2融合蛋白免疫鸡,通过IBDV-VP2 ELISA抗体效价、抗体亚型(IgG1和IgG2a)、淋巴细胞增殖、INF-γ和IL-4细胞因子的分泌水平、中和抗体以及动物攻毒试验检测评价其对鸡体免疫水平的影响。抗体滴度测定和淋巴细胞增殖试验结果显示,rVP2-IL-2融合蛋白免疫鸡体的体液和细胞免疫应答水平均明显高于单独的VP2蛋白免疫组。抗体亚型测定结果显示,rVP2-IL-2融合蛋白免疫组鸡体能产生一个平衡的IgG1和IgG2a抗体反应。细胞因子ELISA试验结果表明rVP2-IL-2融合蛋白能有效平衡Th1(γ-IFN)和Th2(IL-4)类型的细胞免疫反应。动物攻毒试验rVp2-IL-2融合蛋白免疫组鸡体获得了85%的保护率,表明构建的rVP2-IL-2融合蛋白对IBDV的攻击具有较好的免疫保护作用。本研究为进一步研制IBD高效的基因工程疫苗奠定了基础。     

传染性法氏囊病病毒多表位模拟肽串联基因的表达与免疫原性分析

用5株传染性法氏囊病病毒(IBDV)单克隆抗体(mAb)从噬菌体随机肽库中得到了5个含有不同IBDV抗原表位的模拟肽序列。在此基础上,将5个抗原表位用GGGS四肽连接构建多表位基因5epis。将该基因合成、克隆后,构建原核表达质粒pET-5epis,在大肠杆菌中表达重组多表位蛋白r5EPIS,经SDS-PAGE分析,r5EPIS占菌体总蛋白的15%、分子量10kDa。用IBDV单克隆抗体和多克隆抗体对r5EPIS进行免疫印迹对比分析,结果表明,r5EPIS具有IBDV特异性和免疫反应性。将r5EPIS经皮下注射免疫兔,400μg/只/次,免疫2次,间隔7d,用IBDV间接ELISA检测血清抗体,第一次免疫7d后抗体效价为1∶4000,第二次免疫14d后抗体效价升高到1∶256000,说明r5EPIS可诱导机体产生IBDV特异性抗体。用r5EPIS加免疫佐剂经肌肉注射免疫鸡,50μg/只/次,免疫2次后,血清抗体效价可达到1∶12800,用200个ELD50IBDV超强毒株GX8/99攻击实验鸡,r5EPIS免疫组全部存活,而单用佐剂对照组的死亡率为86.7%(13/15),证明r5EPIS可诱导机体产生抗IBDV感染的保护性免疫应答,预示构建的5epis可作为IBD多表位疫苗研究的候选基因。     

羊口疮024基因的表达、多抗制备及亚细胞定位

目的 克隆表达羊口疮病毒（Orf virus,ORFV）024基因,制备多克隆抗体,检测其免疫原性,并对其进行亚细胞定位分析。方法 根据GenBank中羊口疮病毒024基因序列设计引物,进行PCR扩增。将其亚克隆至表达载体,构建原核重组质粒pGEX-6P-1-024以及真核重组质粒pEGFP-N1-024。将原核重组质粒转化Rosetta(DE3)细胞,IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定024蛋白的表达情况。纯化后的024蛋白免疫BALB/c雌鼠,获得血清并制备多克隆抗体,进行Western-blot分析。将构建的真核质粒转染MDBK细胞,24 h后通过免疫荧光观察其在细胞中的表达及亚细胞定位。结果 SDS-PAGE结果表明,羊口疮病毒024基因在Rosetta(DE3)细胞中正确表达,大小为59 kDa。Western-blot结果表明024蛋白能与制备的多抗发生特异性反应,具有良好的反应原性。荧光显微镜下结果表明024蛋白转染MDBK细胞后主要在细胞质中表达。结论 本实验为后续深入研究ORFV 024基因功能和致病机制奠定了基础。     

游仆虫Rab家族成员Eorab1f基因的克隆、表达及多克隆抗体制备

Rab家族蛋白在真核细胞囊泡转运过程中起关键作用。为进一步研究该家族成员的功能, 本研究从八肋游仆虫(Euplotes octocarinatus) 大核基因组中克隆得到Rab蛋白家族中一个新Rab蛋白基因(命名为Eorab1f)的编码区。该开放读框长624 bp, 含有两个通用终止密码子TGA。通过定点突变将TGA突变为TGC。突变后的Eorab1f克隆入原核表达载体pRSETc 中, 工程菌E coli BL21 (DE3) /pRSETc Eorab1f 经IPTG诱导表达,SDS- PAGE分析表明, 有一分子量约为26 kD的特异蛋白条带出现。表达产物经IMAC金属螯合亲和层析及Re source- Q阴离子交换层析纯化, 获得电泳纯的蛋白。Brandford法检测表明每升发酵液中可获得纯化的目的蛋白1 353 mg。Western blotting印迹分析表明该蛋白为融合有6个His的Eorab1f蛋白。纯化的Eorab1f融合蛋白免疫大鼠制备多克隆抗体, ELISA法测得抗体效价为1∶5 000。用制备的多克隆抗体检测八肋游仆虫的蛋白提取物,表明Eorab1f蛋白在游仆虫细胞内表达, 同时表明所得的多克隆抗体特异性良好。     

High-level expression, polyclonal antibody preparation and sub-cellular localization analysis of mouse Rhox5 protein

Mouse reproductive homeobox on the X chromosome (Rhox) is a novel homeobox gene cluster. Rhox5, also called Pem, belongs to the beta subcluster of Rhox. Codon analysis indicated that the cDNA contains 16% of codons rarely used in Escherichia coli. To achieve high-level expression of Rhox5, the coding sequence of Rhox5 was amplified and subcloned into the prokaryotic expression vector pET22b (+) in order to produce 6His-tagged fusion protein in the modified BL21 (DE3) cells, namely Rosetta2 (DE3) cells. The 6His-tagged Rhox5 was expressed efficiently in Rosetta2 (DE3), compared with marginal expression in BL21 (DE3). The fusion protein amounted to 16% of the total bacterial proteins after induction with 0.4mM IPTG for 1.5h at 37 degrees C. After purification, Rhox5-6His was used to immunize New Zealand white rabbits following standard protocol. The homemade antiserum could detect both endogenous Rhox5 protein expressed in eukaryotic cells (Cos-7) and exogenous GFP-Rhox5 protein. Furthermore, the antiserum was used to determine the localization of Rhox5 in NIH3T3 cells using an immunofluorescence technique. The results demonstrated that Rhox5 was localized predominantly in the nucleus. Preparation of the anti-Rhox5 polyclonal antibody will facilitate further functional study of Rhox5.     

传染性法氏囊病不同代次细胞毒免疫效果的研究

将从山东省东营分离到的1株传染性法氏囊病病毒(IBDV)野毒(暂命名 IBDV SDDY株,经鉴定该株与 IB DV STC株具有较高的同源性)经 SPF 鸡胚传代,然后转为细胞培养,取第 20 代、21 代、25 代毒,以 1 倍剂量(3000TCID50/0.2mL )和5倍剂量不同的免疫剂量,分别在7日龄、14日龄对商品代海蓝褐蛋鸡进行免疫,并于免疫前用 IBD ELISA试剂盒检测 IBDV母源抗体水平,于 35 日龄用传染性法氏囊病病毒超强毒 (very virulent In fectious Bursal Disease Virus, vvIBDV )GX 8/99攻毒,在攻毒前再次检测IBDV的抗体水平,攻毒后观察记录各分组鸡的致病率和死亡率,并计算免疫器官体重指数,观察免疫器官的组织损伤情况。试验结果表明:3 代毒都具有较高免疫原性,但是20代毒仍具有较大的毒性,7 日龄接种会引起法氏囊的萎缩,造成持续的组织损伤;21 代毒、25代毒保护率高,无免疫抑制,是比较理想的疫苗来源;7日龄免疫较14日龄免疫更易造成组织损伤和免疫抑制,14日龄免疫较为合适。     

JC病毒衣壳蛋白VP1多克隆抗体的制备

目的制备pET-32a(+)-VP1蛋白的多克隆抗体。方法用纯化后的VP1蛋白分4次免疫兔子,颈动脉插管法取血,制得多克隆抗体。结果用ELISA法和Western blot鉴定多克隆抗体的效价得1?320000。该抗体可以用Western blot法检测出59 kD左右的VP1蛋白。结论成功制备高效价的JC病毒衣壳蛋白VP1多克隆抗体。     

表达IBDV VP2融合蛋白的重组MDV的构建及其免疫特性

将增强型绿色荧光蛋白基因(eGFP)与鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)的VP2基因融合,插入马立克氏病毒(MDV)CVI988/Rispens的非必需区US10片段中,成功构建表达VP2融合蛋白的MDVCVI988转移载体pUC18-US10-VP2。将转移载体质粒与CVI988/Rispens疫苗毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),筛选获得表达VP2融合蛋白的重组MDV(rMDV)。聚合酶链式反应(PCR)和间接免疫荧光实验(IFA)证明,rMDV传至第31代仍能稳定表达VP2融合蛋白。用rMDV免疫SPF鸡,进行IBDV攻毒保护试验,1日龄SPF鸡分别用1000PFU、2000PFU、5000PFU的rMDV进行免疫,33日龄用100LD50的IBDVJS超强毒进行攻毒,鸡的免疫保护率分别为50%、60%、80%。值得注意的是,5000PFU的rMDV一次免疫1日龄SPF鸡,其法氏囊组织病理损伤等级与IBD中等毒力活疫苗常规二次免疫相当(2·0/1·5),其保护效果无显著差异(p>0·05),而与非重组病毒免疫组相比较,保护效果差异显著(P<0·01),这表明构建的表达IBDVVP2融合蛋白的rMDV可以有效地为SPF鸡提供免疫保护作用。     

传染性法氏囊病病毒五个抗原表位短肽的鉴定与序列分析

以5株传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)单克隆抗体HNF1、HNF7、B34、2B1和2G8作为筛选分子,对噬菌体展示12肽库进行3轮"吸附-洗脱-扩增"淘洗,从每株单克隆抗体筛选到的噬菌斑中随机挑取12个单克隆蓝色噬菌斑,合计60个,用间接ELISA检测,A值大于1.00;用竞争抑制ELISA分析,单克隆抗体和IBDV抗原均能竞争抑制筛选12肽与固相包被单克隆抗体的反应,抑制率大于40%,表明在该12肽内含有IBDV抗原表位。选取35个单克隆噬菌斑,测定噬菌体gIII部分基因的核苷酸序列,确定了这5个含有不同IBDV抗原表位12肽的核苷酸和氨基酸序列。进一步将其与GenBank中IBDV基因组编码蛋白的氨基酸序列进行比较,发现2B1筛选肽有4个连续氨基酸残基Leu-Ala-Ser-Pro与IBDV基因组A片段编码多聚蛋白的第536-599氨基酸残基一致,推测2B1为线性表位;而HNF1、HNF7、B34和2G8筛选肽均没找到有3个以上连续氨基酸残基与IBDV蛋白序列相同之处,推测可能是构象依赖性表位。