基因谱系示踪技术揭示小鼠Tbx18+心脏祖细胞向心系细胞分化的潜能

心脏祖细胞(cardiac progenitor cells,CPCs)的研究对阐明先天性心脏病的机制及治疗心血管疾病具有重要意义.哺乳动物的心脏组织由多种不同CPCs分化形成.转录因子Tbx18在发育中的心外膜中表达,对心脏的发育形成起重要的调节作用.为了在组织及活体细胞水平检测和阐明Tbx18+CPC的分化潜能,应用Cre-LoxP系统建立Tbx18+CPCs基因命运谱系示踪模型:Tbx18-Cre/Rosa26R-EYFP和Tbx18-Cre/Rosa26R-LacZ双杂合基因敲入小鼠.该双杂合基因敲入小鼠通过Cre的表达能有效地示踪Tbx18+细胞在胚胎和成年小鼠中的分化命运.Tbx18-Cre/Rosa26R-EYFP双杂合小鼠心脏能非常容易地利用流式细胞分选系统(FACS)分离出YFP+细胞,也可在倒置共聚焦显微镜下观察.应用X-gal染色分析其表达模式,揭示Tbx18命运谱系参与心房肌、室间隔、心室肌、冠状动脉、瓣膜等的形成.应用免疫荧光技术初步揭示Tbx18+CPCs向心脏肌钙蛋白T(cTNT)阳性心肌细胞和平滑肌肌球蛋白重链11(MYH11)阳性血管平滑肌细胞分化的潜能.心脏是一个由多种肌肉和非肌肉组织细胞构成的复杂器官.推测Tbx18可能在心脏祖细胞向肌源性细胞分化的信号通路中起重要调节作用.在上述研究中应用基因谱系示踪技术,验证Tbx18可作为一类CPCs的标志,为更深入揭示心脏祖细胞向心系细胞的分化潜能打下基础.     

基因谱系示踪揭示小鼠Tbx18+肾脏间质祖细胞分化为输尿管平滑肌

本文旨在研究Tbx18+肾脏间质祖细胞分化为输尿管平滑肌细胞的命运及转录因子Tbx18在小鼠输尿管平滑肌发育形成中起到的作用．实验建立Tbx18:Cre/R26REYFP和Tbx18:Cre/R26RLacZ两种谱系示踪系统和Tbx18:Cre/Cre 敲除模型．该示踪模型通过cre重组酶的表达能有效地示踪Tbx18+肾脏间质祖细胞在泌尿系统的发育命运．通过免疫荧光染色和X-gal染色,同时发现Tbx18+肾脏间质祖细胞可分化为输尿管平滑肌细胞,但不分化为输尿管移行上皮细胞．在Tbx18:Cre/Cre基因突变模型中,泌尿系统出现明显的肾积水和输尿管积水,肾盏、肾盂扩张,输尿管明显缩短和扩张．实验结果揭示,Tbx18+ 肾脏间质祖细胞可以分化为输尿管平滑肌细胞,且转录因子Tbx18在哺乳动物输尿管平滑肌的发育中起到重要的作用．     

Tbx18+心外膜祖细胞参与成年小鼠部分心脏组织形成

转录因子Tbx18在胚胎心脏发育过程中起重要调控作用,是心外膜祖细胞标记之一|故以Tbx18为标记的阳性祖细胞群被称为：Tbx18+心外膜祖细胞(epicardial progenitor cells, EPCs)。小鼠胚胎、新生和成年期心脏组织细胞的特性区别较大,成年小鼠的心脏属于终末分化组织。但是,Tbx18+EPCs对成年小鼠心脏组织的贡献大小尚存争议。本研究拟定量分析Tbx18+EPCs对成年小鼠心脏组织的贡献大小。采用整体和组织切片X-gal染色检测成年心脏组织LacZ的表达|荧光激活细胞分选法(fluorescence activated cell sorting,FACS)分离成年Tbx18Cre/R26EYFP小鼠心脏组织EYFP+细胞。结果显示,在Tbx18+EPCs遗传谱系示踪小鼠,报告基因LacZ和EYFP在成年小鼠心脏的心室、心房、冠状动脉、室间隔等处表达|成年Tbx18Cre/R26EYFP小鼠心脏组织细胞用FACS分离,分选的EYFP+细胞比例平均约为33.94%。由此可见,成年小鼠心脏的心室、心房、冠状动脉、室间隔等心脏组织均可来源于Tbx18+EPCs|约1/3成年小鼠心脏组织细胞来源于Tbx18+EPCs。故Tbx18+EPCs参与成年小鼠心脏组织的部分形成。     

基因谱系示踪揭示Tbx18+祖细胞的多分化潜能

为探讨Tbx18+祖细胞在小鼠生长发育过程中的多分化潜能及分化的组织类型,本工作建立了Tbx18：Cre/Rosa26RLacZ谱系示踪小鼠.该示踪小鼠基于Cre/LoxP系统,能够准确及有效地示踪Tbx18+祖细胞的分化命运,通过整体胚胎及组织X-gal染色,检测分析报告基因LacZ在其中的表达情况.结果显示,在Tbx18：Cre/Rosa26RLacZ双杂合小鼠胚胎发育早期,报告基因LacZ主要在脊柱、四肢及心外膜表达|而在胚胎发育晚期则分别表达于皮肤、毛囊、肾脏、输尿管、膀胱、睾丸、输精管、椎间盘、肋软骨、心耳、心肌、冠状动脉.结果阐明,Tbx18+祖细胞在小鼠生长发育过程中具有强大的多器官及组织分化潜能,包括分化形成表皮系统,泌尿生殖系统,骨骼系统,心血管系统,并在其生长发育中发挥重要作用.     

遗传谱系示踪技术揭示小鼠胚胎前体心外膜向心外膜转化过程

心外膜的形成是胚胎心脏发育的关键生理过程之一。利用遗传谱系示踪技术示踪观察前体心外膜向心外膜细胞转化过程,具有重要的科学研究价值。本研究拟利用Tbx18+前体/心外膜祖细胞遗传谱系示踪模型,揭示胚胎心外膜的起源及前体心外膜向心外膜转化的过程。利用整胚和切片原位杂交技术揭示,Tbx18 mRNA特异性表达于胚龄（E）9.5 d小鼠胚胎前体心外膜;故Tbx18是前体心外膜的特异性标记基因。利用整胚X-Gal染色,揭示报告基因Lacz在E9.5 d遗传谱系示踪模型鼠胚前体心外膜中大量表达,此时报告基因从前体心外膜逐渐迁移并开始少量表达于心外膜。Lacz在E10～E10.5 d双杂合鼠胚前体心外膜中表达逐渐减少,而在心外膜组织中逐渐增多;在E11.5 d,报告基因在前体心外膜中表达基本消失,而在心外膜组织中大量表达。切片进行X-Gal染色也揭示,报告基因Lacz定位于早期胚胎前体心外膜及心外膜。免疫荧光染色证实,早期胚胎心外膜细胞呈现未分化的祖细胞状态。通过报告基因的表达变化模式揭示,胚胎心外膜的形成经历了启动、转化、完成3个阶段;E9.5～11.5 d左右这个时间段发生的前体心外膜向心外膜转化,可能是心外膜形成的主要来源和形式。     

谱系示踪技术揭示Tbx18~+肾祖细胞分化为脂肪细胞的潜能

转录因子Tbx18在泌尿系发育中发挥重要作用。利用遗传谱系示踪模型,揭示了Tbx18~+肾祖细胞具有向多种肾系细胞分化的潜能。但尚无文献报道其是否具有向脂肪细胞分化的潜能。本研究通过对Tbx18Cre/Rosa26~(LacZ)双杂合小鼠泌尿系组织进行整体X-gal染色发现,肾包膜、输尿管及肾周脂肪组织能特异性表达β-gal蛋白,说明肾包膜、输尿管及肾周脂肪组织可能来源于Tbx18+祖细胞。对Tbx18Cre/Rosa26~(EYFP)双杂合小鼠泌尿系组织进行免疫荧光染色,发现部分脂滴相关蛋白~+(perilipin)脂肪细胞能表达标记蛋白EYFP,说明部分泌尿系脂肪细胞来源于Tbx18~+祖细胞。本研究揭示了Tbx18~+祖细胞具有分化为脂肪细胞的潜能,进一步证实了Tbx18~+肾祖细胞的多分化潜能。结合本研究结果,若进一步研究肾损伤时,来源于Tbx18~+祖细胞的泌尿系脂肪细胞是否进一步增多,将会为肾损伤的再生修复提供一些思路和启发。     

Tbx18对小鼠心脏冠状血管及室壁结构发育的影响

利用Tbx18谱系示踪小鼠模型及Tbx18条件性基因敲除小鼠模型,探讨转录因子Tbx18对小鼠心血管结构发育的影响.实验建立Tbx18-Cre/Rosa26R-EYFP和Tbx18-Cre/Rosa26R-Lac Z两种基因敲入谱系示踪小鼠模型和Tbx18:Cre/Cre基因敲除小鼠模型;通过免疫荧光及X-gal染色技术,示踪Tbx18在心血管系统结构形成中的命运;通过小鼠心脏整体血管免疫组化及切片HE染色、免疫组化、免疫荧光技术,比较Tbx18:Cre/Cre基因敲除小鼠与野生型对照小鼠心脏室壁结构及冠状血管结构发育情况.示踪结果提示,Tbx18参与小鼠冠状血管及室间隔结构的形成,并与冠脉平滑肌细胞共表达;对Tbx18基因敲除小鼠及野生型小鼠的心脏结构比较提示,Tbx18基因敲除后,仍能形成形态正常的冠状血管系统,小鼠心室肌及室间隔厚度较野生型无明显差异.结果表明,Tbx18参与小鼠心脏血管平滑肌及室间隔结构的形成,但其在小鼠心脏腔室结构及冠状血管结构形成过程中不是必需的.     

Tbx18通过下调EMT信号分子参与调控心脏发育

转录因子Tbx18(Tbx18)在小鼠胚胎心外膜上皮细胞表达并调控心外膜上皮细胞向心系细胞分化.上皮间充质转化(EMT)过程是器官发育和形成的重要机制.为阐述Tbx18通过调控下游EMT关键信号分子参与心外膜上皮细胞分化和心脏发育,本研究运用Tbx18-Cre/Rosa26R-EYFP双杂合基因敲入小鼠和免疫荧光共聚焦,证实Tbx18+心系细胞和EMT关键信号分子Snail1、Smad、Slug、Twist在发育后期胚鼠心外膜和心外膜下间充质发生共聚焦.同时还发现,Tbx18在胚鼠不同发育阶段的表达模式和Tbx18+心系细胞内上述EMT关键信号分子的表达模式相似.Tbx18和EMT关键信号分子在发育心脏存在相似的时空表达模式,因此,它们之间可能存在相互调控作用.运用Tbx18突变技术揭示了Tbx18突变型胚鼠心脏EMT关键信号分子表达水平均较野生型显著下调,直接证实了上述4个EMT信号分子是Tbx18的可能靶点.理解Tbx18参与心脏发育的下游靶点有助于改善成年心脏损伤后的再生修复.     

Tbx18 能使兔脂肪干细胞向心肌样细胞分化

目的:研究Tbx18是否能成功转染脂肪干细胞并使脂肪干细胞向心肌细胞分化。方法:分离培养来源于日本大耳兔腹股沟部脂肪的兔脂肪干细胞,用搭载有Tbx18的腺病毒载体转染脂肪干细胞,诱导分化后检测向心肌细胞的分化情况,同时将转染了含GFP的腺病毒组与未转染组作为对照。采用用流式细胞仪检测转染效率,采用免疫荧光法检测平滑肌肌动蛋白α-SMA,采用实时定量PCR法检测兔肌钙蛋白TNNT2的表达。结果:转染后荧光显微镜下可观察到荧光表达,且持续时间较长。流式细胞仪检测转染效率为70%左右;诱导分化后,脂肪干细胞内出现了α-SMA和TNNT2的表达。结论:Tbx18可成功转染入脂肪干细胞,且能在细胞内稳定表达;Tbx18可诱导脂肪干细胞向心肌样细胞分化。     

Tbx18-Cre基因敲入小鼠的繁殖、鉴定及其应用

为了探讨Tbx18-Cre基因敲入小鼠(Tbx18:Cre knock-in Mus musculus)的繁殖、鉴定及Tbx18基因敲除小鼠和遗传示踪小鼠模型的应用,将Tbx18-Cre基因敲入杂合子小鼠进行繁殖,应用PCR法鉴定其子代基因型。将子代雌雄杂合子小鼠互交,应用H.E染色观察Tbx18基因敲除胚鼠心的形态学变化。将杂合子小鼠与RosaEYFP报告小鼠交配,应用心冰冻切片技术观察Tbx18:Cre/Rosa26REYFP双转基因遗传示踪胚鼠心内Tbx18阳性心外膜祖细胞发育命运。结果表明,用于繁殖、基因敲除研究及基因遗传示踪的子代基因型均符合孟德尔遗传规律。同时心H.E染色和心冰冻切片发现,Tbx18敲除小鼠心窦房结发育存在缺陷,而Tbx18阳性心外膜祖细胞是心发育重要的祖细胞来源。研究结果揭示,Tbx18-Cre基因敲除小鼠是研究先天性心脏病发病机制的理想模式动物,Tbx18阳性心外膜祖细胞可能是心脏病患者心脏修复和再生潜在的种子细胞。     

Bone Morphogenetic Protein 4 (BMP4) Enhances the Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Limbal Progenitor Cells

Corneal epithelium maintains visual acuity and is regenerated by the proliferation and differentiation of limbal progenitor cells. Transplantation of human limbal progenitor cells could restore the integrity and functionality of the corneal surface in patients with limbal stem cell deficiency. However, multiple protocols are employed to differentiate human induced pluripotent stem (iPS) cells into corneal epithelium or limbal progenitor cells. The aim of this study was to optimize a protocol that uses bone morphogenetic protein 4 (BMP4) and limbal cell-specific medium. Human dermal fibroblast-derived iPS cells were differentiated into limbal progenitor cells using limbal cell-specific (PI) medium and varying doses (1, 10, and 50 ng/mL) and durations (1, 3, and 10 days) of BMP4 treatment. Differentiated human iPS cells were analyzed by real-time polymerase chain reaction (RT-PCR), Western blotting, and immunocytochemical studies at 2 or 4 weeks after BMP4 treatment. Culturing human dermal fibroblast-derived iPS cells in limbal cell-specific medium and BMP4 gave rise to limbal progenitor and corneal epithelial-like cells. The optimal protocol of 10 ng/mL and three days of BMP4 treatment elicited significantly higher limbal progenitor marker (ABCG2, ∆Np63α) expression and less corneal epithelial cell marker (CK3, CK12) expression than the other combinations of BMP4 dose and duration. In conclusion, this study identified a successful reprogramming strategy to induce limbal progenitor cells from human iPS cells using limbal cell-specific medium and BMP4. Additionally, our experiments indicate that the optimal BMP4 dose and duration favor limbal progenitor cell differentiation over corneal epithelial cells and maintain the phenotype of limbal stem cells. These findings contribute to the development of therapies for limbal stem cell deficiency disorders.