红色红曲菌M7中色素聚酮合酶基因敲除突变体的鉴定

摘要:【目的】研究红色红曲菌(Monascus ruber) M7中控制红曲色素合成的聚酮合酶基因(pksPT)的功能。【方法】对M7 中pksPT进行了生物信息学分析;借助农杆菌介导的红曲菌转化技术敲除M7中pksPT,获得pksPT缺失突变体(ΔpksPT),比较M7和ΔpksPT菌落形态、产孢能力、生长速度、色素和桔霉素产量的差异。【结果】pksPT全长8687 bp,编码蛋白含有2690个氨基酸,属于非还原Ⅲ型聚酮合酶,包括β-酮酯酰基合成酶(KS)、酰基载体蛋白(ACP)、酰基转移酶(AT)和甲基转移酶(ME)四种结构域,组合形式为KS-AT-ACPACP-ME。ΔpksPT的分析结果显示,pksPT的敲除不影响其产分生孢子和闭囊壳的能力;ΔpksPT不能产生任何一种红曲色素;其生长速度明显快于野生菌株M7;桔霉素产量较M7 提高了2.8倍。【结论】pksPT是M7中控制红曲色素合成的关键基因,红曲色素的合成显著影响红曲菌产桔霉素能力和生长速度。     

红色红曲菌M7核型分析与桔霉素、色素基因簇的染色体定位

以红色红曲菌Monascus ruber M7菌株为研究对象,对其核型进行分析,并将桔霉素与色素合成基因簇定位于染色体。通过原生质体制备,以脉冲场凝胶电泳进行核型分析。在此基础上,通过Southern杂交将桔霉素与色素合成基因簇定位于染色体。脉冲场凝胶电泳结果显示,红色红曲菌M7包含大小依次为4.9,4.3,3.7,3.4,3.0,2.3,2.1Mb的7条(I-VII)染色体,基因组大小约为23.7Mb。Southern杂交结果表明,桔霉素合成基因簇位于第IV条染色体上,色素合成基因簇位于第V条染色体上。     

合成酮内酯类3-脱氧-3-羰基-红霉内酯B糖多孢红霉菌M的构建

大环内酯类抗生素基因工程是近年来研究的一个新领域,迄今已合成了100多种新的聚酮类化合物。以糖多孢红霉菌A226基因组DNA为模板,用重叠PCR方法扩增出去除KR6酶域DNA的约32kb DNA片段,克隆于pWHM3载体,构建了同源重组质粒pWHM2201。PEG介导原生质体转化法将pWHM2201转入糖多孢红霉菌A226,并整合于染色体红霉素合成基因位点。整合体在R3M斜面上生长两代后,制备原生质体涂R3M平皿。利用PCR鉴定筛选出8株KR6敲除的突变体糖多孢红霉菌M(1-8)。ZabsPec Fab质谱鉴定,证实糖多孢红霉菌M1合成了3-脱氧-3-羰基-红霉内酯B,一种新的酮内酯类化合物。 〖HJ0     

茉莉酸甲酯诱导大戟三萜类代谢的研究

京大戟是多年生草本药用植物,入药部分是其干燥根,但可入药的京大戟资源由于生长缓慢以及环境污染的加剧而越发匮乏,因此解决大戟资源日益紧张的问题是当今药用植物资源开发与利用方向的重要课题。京大戟含有三萜类、二萜类、黄酮类等丰富的活性成分,一些常见药用植物的有效成分是三萜类化合物,其在抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等方面具有很好的活性。对植物萜类物质代谢起重要作用的关键酶,如3-羟基,3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(hmgr)、鲨烯合酶(sqs)、法尼基焦磷酸合酶(fps)的基因克隆及活性研究取得了进展和突破,但通过调控萜类物质代谢途径中关键酶基因的表达来诱导终产物合成的研究鲜有报道。通过研究大戟萜类物质代谢途径进而利用基因工程手段提升目的物质的产量来解决京大戟药源短缺问题具有重要意义。该研究以大戟愈伤组织为材料,使用茉莉酸甲酯分别按时间梯度和浓度梯度进行诱导,将诱导后的愈伤组织分为两部分:一部分提取其总RNA,以actin为内参基因进行反转录,实时定量RT-PCR分析大戟三萜类代谢途径中hmgr、sqs与fps基因的相对表达差异;另一部分用于提取其总三萜并使用分光光度法进行含量测定。实时定量RT-PCR分析结果表明,茉莉酸甲酯可诱导3个基因的表达,但其表达模式不一样。相应的京大戟愈伤组织中总三萜的含量明显提高,最高可较未处理样品增加27%。研究结果可为茉莉酸甲酯促进药用植物大戟三萜类物质积累的分子机制研究提供参考。     

虎杖中一种新的2-吡喃酮合酶基因的克隆和功能研究

4-羟基-6-甲基-2-吡喃酮(2-吡喃酮)及其衍生物是一类重要的植物次生代谢产物,具有抗虫、抗真菌等功能,在工业上可用于生产可再生化学平台间苯三酚和1,3,5-三氨基-2,4,6-三硝基苯. 2-吡喃酮合酶(2PS),一种Ⅲ型聚酮合酶(PKSs),是合成2-吡喃酮的关键酶.本研究以中药材虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc)为材料,从中分离鉴定了一种新的2-吡喃酮合酶(Pc2PS). Pc2PS与已知的几种2PSs的氨基酸序列相似性为54%～56%.通过体外酶促反应鉴定功能发现,Pc2PS可以催化1分子乙酰-CoA与2分子丙二酰-CoA,缩合生成4-羟基-6-甲基-2-吡喃酮;也可以只利用3分子丙二酰-CoA,以相同的效率缩合生成2-吡喃酮.由此可以看出,乙酰-CoA存在与否并不影响该酶的催化效率.随后,我们测定了Pc2PS以丙二酰-CoA为单一底物时的酶动力学参数.虽然之前报道的2PSs也可以只利用丙二酰-CoA生成2-吡喃酮,但与Pc2PS不同的是,乙酰-CoA的缺失会大大降低催化效率.另外,对Pc2PS基因的组织表达特异性检测结果表明,该基因主要在虎杖根中表达,在叶中的表达量很低.本研究丰富了2PS的种类,并为2-吡喃酮的生物合成提供了基因资源.     

荷叶碱对bel-7402细胞胆固醇代谢的影响

目的:探讨荷叶主要单体成分荷叶碱对Bel-7402细胞株胆固醇吸收、合成及酯化的影响。方法:体外培养Bel-7402细胞株,待细胞长满80%后无血清培养基饥饿细胞24h,分别加入1uM、10uM、100uM的荷叶碱及10uM的阿托伐他订,实时定量PCR和Western blotting法分别检测给药24小时后细胞内低密度脂蛋白受体(LDLR)、β-羟β-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGCR)、酰基辅酶A胆固醇酰基转移酶(ACAT)的基因表达和蛋白质水平。结果:与对照组相比,荷叶碱各剂量组均能明显升高LDLR、HMGCOAR基因表达及蛋白水平,且呈剂量依赖性(P<0.01),阿托伐他汀组LDLR、HMGCOAR基因表达及蛋白水平高于荷叶碱各组(P<0.01),荷叶碱、阿托伐他汀均能降低细胞内ACAT基因表达及蛋白含量,荷叶碱中剂量组ACAT基因表达及蛋白含量均高于阿托伐他汀组(P<0.01,P<0.05),荷叶碱高剂量组ACAT基因表达高于阿托伐他汀组(P<0.05),蛋白水平两组没有显著性差异。结论:荷叶碱可能是通过抑制细胞内胆固醇的合成、抑制胆固醇酯酶的活性及升高低密度脂蛋白受体的量而起到降血脂作用。     

家蚕3-羟酰辅酶A脱氢酶基因全长cDNA克隆及其在质型多角体病毒感染家蚕的差异表达

家蚕质型多角体病毒(Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus,BmCPV)是家蚕的重要病毒病原之一,往往给养蚕业生产造成极大危害。我们以前的研究运用基因芯片技术在感染质型多角体病毒的家蚕中肠中鉴定出一个差异表达的3-羟酰辅酶A脱氢酶蛋白基因(Bombyx mori3-hydroxyacyl-CoA dehyrogenase protein gene-Bm3HAD)。本研究利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆了该基因,其全长cDNA序列为1168bp,包含一个83bp5’端非翻译区序列(5’-UTR)、一个930bp的开放阅读框(ORF)和一个155bp的3’端非翻译区序列(3’-UTR);基因结构分析发现该基因由5个外显子和4个内含子组成。RT-PCR结果显示该基因在家蚕中肠、脂肪体、血液、丝腺及生殖体中均有表达。荧光定量PCR结果表明该基因在BmCPV感染初期为上调表达,随着病毒感染的进展,该基因的表达水平逐渐降低,并转变为下调表达。研究结果为进一步研究BmCPV对家蚕致病的分子机制提供了有益的信息。     

球形红杆菌积累聚β-羟基链烷酸(PHA)的研究

通过对球形红杆菌(Rhodobacter sphaeroides)生长和积累聚卢-羟基链烷酸(PHA)条件的研究,确定采用两段培养法提高PHA的产量。第一阶段提供适合菌体生长的条件:以葡萄糖作碳源,尿素为氮源,光照微好氧培养。第二阶段则提供使菌体积累PHA的条件:补加乙酸钠厌氧光照培养。经两段培养后菌体PHA含量可占细胞干重的45％,PHA产量每升发酵液可达1.7g。     

球形红杆菌积累聚β-羟基链烷酸(PHA)的研究

通过对球形红杆菌(Rhodobacter sphaeroides)生长和积累聚卢-羟基链烷酸(PHA)条件的研究,确定采用两段培养法提高PHA的产量。第一阶段提供适合菌体生长的条件:以葡萄糖作碳源,尿素为氮源,光照微好氧培养。第二阶段则提供使菌体积累PHA的条件:补加乙酸钠厌氧光照培养。经两段培养后菌体PHA含量可占细胞干重的45％,PHA产量每升发酵液可达1.7g。     

球形红杆菌积累聚β-羟基链烷酸(PHA)的研究

通过对球形红杆菌(Rhodobacter sphaeroides)生长和积累聚卢-羟基链烷酸(PHA)条件的研究,确定采用两段培养法提高PHA的产量。第一阶段提供适合菌体生长的条件:以葡萄糖作碳源,尿素为氮源,光照微好氧培养。第二阶段则提供使菌体积累PHA的条件:补加乙酸钠厌氧光照培养。经两段培养后菌体PHA含量可占细胞干重的45％,PHA产量每升发酵液可达1.7g。     

基于AlphaFold 2和分子对接探讨非还原型聚酮合酶的碳甲基化程序

【目的】探讨非还原型聚酮合酶(non-reducing polyketide synthase, NR-Pks)的碳甲基化程序差异的原因。【方法】以红色红曲菌(Monascus ruber) M7中红曲色素和桔霉素的NR-Pks为研究对象，采用生物信息学方法和AlphaFold 2软件，分析了这两种NR-Pks及其各结构域的序列和结构差异。再基于分子对接等技术，比较了它们的碳甲基转移酶结构域(C-methyltransferase domain,CMeT)分别与其他结构域及其中间产物的结合特征。【结果】两种NR-Pks各结构域的序列和结构相似性高，但其整体结构差异大，表明碳甲基化差异可能源于结构域互作差异。进一步分析发现，桔霉素Pks的CMeT比红曲色素Pks的更容易结合携带底物的酰基载体蛋白结构域(acylcarrier protein,ACP)，使其中间产物更容易受到CMeT催化。CMeT和β-酮酰基合成酶结构域(β-ketosynthase domain, KS)相比，与甲基受体底物的结合自由能更低。【结论】NR-Pks中的CMeT能通过与KS竞争，从而影响其产物的碳甲基化程度。...     

色素生物合成相关PigE基因的缺失对紫色红曲霉Mp-21黄色素种类和产量的影响

红曲色素（MPs）是红曲霉次生代谢过程中产生的具有多种生物活性的天然色素,广泛应用于食品、化妆品和保健品行业。[目的]本研究从紫色红曲霉Mp-21中克隆了一个红曲色素产生相关PigE基因,并对其功能进行了鉴定。[方法]利用同源重组原理对PigE基因进行敲除,从表型、显微结构、生长速率、红曲色素、桔霉素等方面分析基因缺失前后的生物学特征变化。[结果]PigE基因的缺失主要导致黄色素产量的提高和种类的增多。与野生型Mp-21菌株以产生红色素为主的色素混合物相比,△PigE丧失了产生红色素的能力,并且新产生了至少5种新的黄色素。△PigE液体发酵13 d后,红曲色素的总色价达到了3548.2 U/g,约为野生型Mp-21菌株的4.82倍;而△PigE桔霉素的产量没有显著变化,但产生的时间延迟。[结论]PigE基因的缺失可能阻断了黄色素向橙色素的转化途径,使△PigE更趋向于黄色素的形成。由于红色素的形成需要较复杂的条件,如培养基中的氨基酸和适宜的pH值等,△PigE更倾向于先合成黄色素,丧失了产生红色素的能力。本研究为高产黄色素基因工程红曲霉菌株的构建提供了一种可能的途径。     

卡伍尔氏链霉菌NA4的Ⅱ型聚酮基因簇的靶向激活及其产物鉴定

【目的】以基因组信息为导向,定向激活海洋来源卡伍尔氏链霉菌（Streptomyces cavourensis） NA4中沉默的Ⅱ型聚酮类次级代谢产物生物合成基因簇,鉴定新产生的次级代谢产物的结构和抑菌活性。【方法】通过添加启动子和敲除负调控基因的方法激活实验室培养条件下沉默或低表达的生物合成基因簇,并完成目标化合物的分离与纯化,通过电喷雾质谱（electrospray ionization-mass spectrometry,ESI-MS）和核磁共振（nuclear magnetic resonance,NMR）数据分析鉴定目标化合物结构,对目标化合物进行抑菌活性鉴定,基于生物信息学信息推导化合物的生物合成途径。【结果】根据基因组生物信息学分析,从海洋来源链霉菌Streptomyces cavourensis NA4中选取一个编码PKSⅡ型次级代谢产物的生物合成基因簇开展研究,成功激活目标基因簇,从中分离到1个PKSⅡ型化合物,推导了其生物合成途径并进行了抑菌活性鉴定。【结论】基因组导向下的天然产物挖掘,可以目标明确地分离产物,充分挖掘链霉菌编码次级代谢产物的潜力。     

红曲霉繁殖相关brlM基因鉴定及功能分析

brlA作为曲霉分生孢子形成的中心调控路径中最上游的转录因子,能够诱导下游特异基因的表达调控分生孢子的产生,brlA缺失将导致曲霉无法产生分生孢子,同时生长代谢发生改变,但对不同菌种的影响有显著差异。【目的】探究brlA同源基因brlM在红曲霉中的基因功能,探索红曲霉繁殖调控机制。【方法】从紫色红曲霉Mp-21菌株中克隆了brlA同源基因brlM。利用同源重组原理,用农杆菌介导转化法构建了brlM基因缺失突变株(△brlM),分析△brlM和野生菌株Mp-21在菌落表型、显微结构、生长速率和次生代谢产物等方面的差异,明确brlM基因在红曲霉中的主要功能。【结果】在形态水平上,brlM基因缺失菌株导致菌丝生长更加旺盛,赋予菌落更加蓬松的表型;显微观察发现△brlM失去了有性繁殖产生闭囊壳的能力,但却提升了无性繁殖产生分生孢子的能力;同时代谢产物红曲色素、莫纳可林K和桔霉素产量显著下降。【结论】红曲霉brlM基因的功能与曲霉属中的brlA并不相同,brlM基因在红曲霉有性繁殖中的作用不可替代。本研究的结果对进一步探索丝状真菌繁殖调控机制提供了新的思路。     

紫色红曲霉Mp-21胞内次级代谢产物的分离纯化与活性研究

[目的]紫色红曲霉(Monascus purpureus)Mp-21胞内次级代谢产物的分离纯化与活性研究.[方法]通过综合运用多种色谱分离方法对次级代谢产物进行分离纯化,最后通过多种图谱数据对化合物进行结构的解析与鉴定.对分离纯化得到的单体化合物进行抗氧化与降血糖相关酶抑制活性的测定.[结果]从紫色红曲霉Mp-21胞内...     

Microbial production of 3-hydroxydodecanoic acid by pha operon and fadBA knockout mutant of Pseudomonas putida KT2442 harboring tesB gene

To produce extracellular chiral 3-hydroxyacyl acids (3HA) by fermentation, a novel pathway was constructed by expressing tesB gene encoding thioesterase II into Pseudomonas putida KTOY01, which was a polyhydroxyalkanoate (PHA) synthesis operon knockout mutant. 3HA mixtures of 0.35 g/l consisting of 3-hydroxyhexanoate, 3-hydroxyoctanoate, 3-hydroxydecanoate, and 3-hydroxydodecanoate (3HDD) were produced in shake-flask study using dodecanoate as a sole carbon source. Additional knockout of fadB and fadA genes encoding 3-ketoacyl-CoA thiolase and 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase in P. putida KTOY01 led to the weakening of the β-oxidation pathway. The fadBA and PHA synthesis operon knockout mutant P. putida KTOY07 expressing tesB gene produced 2.44 g/l 3HA, significantly more than that of the β-oxidation intact mutant. The 3HA mixture contained 90 mol% 3HDD as a dominant component. A fed-batch fermentation process carried out in a 6-l automatic fermentor produced 7.27 g/l extracellular 3HA containing 96 mol% fraction of 3HDD after 28 h of growth. For the first time, it became possible to produce 3HDD-dominant 3HA monomers. Ahleum Chung and Qian Liu contributed equally to this paper.     

紫色红曲霉Mp-21 MpMcrA基因的克隆与生物信息学分析

McrA为最近在构巢曲霉(Aspergillus nidulans)中发现的全局调控因子，具有调控丝状真菌生长发育和次级代谢的作用，利用生物信息学分析方法找到并克隆紫色红曲霉（Monascus purpureus）中mcrA基因，将其命名为MpMcrA。分析MpMcrA蛋白质理化性质、亲疏水性、亚细胞定位、信号肽、跨膜区域及磷酸化位点、转录因子结合位点以及蛋白质二级结构。利用ProtParam、ProtScale、PSORTII、SignalP4.1等生物信息学软件对MpMcrA进行系统分析。 结果表明，MpMcrA基因长1 356 bp，其中含有3个外显子，2个内含子，编码410个氨基酸，与构巢曲霉序列比对蛋白相似性高达64％。预测结果显示，MpMcrA属于亲水蛋白，位于细胞核可能性大，不存在跨膜区域，不属于膜蛋白；不存在剪切位点，不属于分泌蛋白；基因含有54个潜在的磷酸化位点；可能存在5个转录因子结合位点；蛋白结构大部分为无规则卷曲，整体结构较松散。对MpMcrA基因进行了生物信息学分析，得到了基因特征和分析结果。初步确定MpMcrA基因为构巢曲霉同源mcrA基因，在红曲霉中未见有报道。     

ThenadB gene ofSalmonella typhimurium complements the nicotinic acid auxotrophy ofShigella flexneri

Shigella species are characteristically nicotinic acid (NA) auxotrophs. The invasiveS. flexneri strain M90T, transformed with the multicopy plasmid pZT349 encoding thenadB gene ofSalmonella typhimurium, can grow in minimal glucose medium without exogenous NA, whereas, M90T containing the control vector, pUC18 does not, suggesting that this species lacksl-aspartic acid oxidase, the first enzyme in the de novo NAD biosynthetic pathway. The estimated growth rate of strain M90T (pZT349) in HeLa cells was identical to that of M90T (pUC18), indicating the available intracellular concentration of NA is not limiting for bacterial growth.     

Nitrobacter winogradskyi cytochrome c oxidase genes are organized in a repeated gene cluster

Cytochrome c oxidase (EC 1.9.3.1) is one of the components of the electron transport chain by which Nitrobacter, a facultative lithoautotrophic bacterium, recovers energy from nitrite oxidation. The genes encoding the two catalytic core subunits of the enzyme were isolated from a Nitrobacter winogradskyi gene library. Sequencing of one of the 14 cloned DNA segments revealed that the subunit genes are side by side in an operon-like cluster. Remarkably the cluster appears to be present in at least two copies per genome. It extends over a 5–6 kb length including, besides the catalytic core subunit genes, other cytochrome oxidase related genes, especially a heme O synthase gene. Noteworthy is the new kind of gene order identified within the cluster. Deduced sequences for the cytochrome oxidase subunits and for the heme O synthase look closest to their counterparts in other -subdivision Proteobacteria, particularly the Rhizobiaceae. This confirms the phylogenetic relationships established only upon 16S rRNA data. Furthermore, interesting similarities exist between N. winogradskyi and mitochondrial cytochrome oxidase subunits while the heme O synthase sequence gives some new insights about the other similar published -subdivision proteobacterial sequences.Abbreviations COI cytochrome oxidase subunit I - COII cytochrome oxidase subunit II - COIII cytochrome oxidase subunit III - HOS Heme O synthase - ORF open reading frame - SDS sodium dodecyl sulfate