虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅰ-(HWTX-Ⅰ)28肽类似物的化学合成与活性鉴定

虎纹捕鸟蛛毒素-(huwentoxin-,HWTX-)是从我国虎纹捕鸟蛛毒素中分离纯化得到的一种多肽类神经毒素.该多肽分子由33个氨基酸残基组成,含三对二硫键.其一级结构和三级结构均已测定.弄清该毒素的活性部位,是研究其结构功能关系的基础.用固相Fmoc化学合成的方法,合成了虎纹捕鸟蛛-的28肽类似物.该突变体去掉了天然毒素分子N端的Alal和C端的Lys30-Trp31-Lys32-Leu33共5个残基.用氧化还原型谷胱甘肽法完成二硫键配对,并用HPLC进行纯化,所得突变体与天然HWTX-的紫外光谱相似.质谱鉴定确认合成产物正确,分子量为3124,浓度为1×10-5g/ml的突变体能可逆阻断小白鼠膈神经-膈肌的接头传递,阻断时间为60～70min.与天然毒素比较,活性有所下降.结果说明HWTX-的N端、C端残基对其生物活性有一定影响,但不是位于活性中心的重要残基.由结果推测,虎纹捕鸟蛛毒素-的活性中心位于该分子中连接β-折叠的回环区     

重组虎纹捕鸟蛛毒素Ⅰ用pET_(31)b载体的表达和纯化

化学全合成虎纹捕鸟蛛毒素 Ⅰ (HWTX Ⅰ )基因在大肠杆菌中被表达 ,采用pET31b载体 ,表达产物N端为大肠杆菌酮基立体异构酶的融合蛋白 ,经亲和连续 6个组氨酸的亲和柱层析后 ,溴化氰切割融合蛋白 ,再经高效液相色谱反相柱纯化 ,得到了重组虎纹捕鸟蛛毒素Ⅰ .质谱分析及N端测序表明 ,rHWTX Ⅰ系正确表达产物 .还原复性的rHWTX Ⅰ表现出与天然HWTX Ⅰ一致的生物学活性     

百日咳杆菌粘附素中针对支气管败血波氏杆菌的保护性抗原肽的筛选

【目的】本研究通过百日咳杆菌黏附素(PRN)基因的分段克隆表达及其在BALB/c小鼠的主动和被动免疫保护试验筛选PRN中的保护性抗原肽。【方法和结果】利用大肠杆菌进行PRN的完整蛋白、N端和C端多肽及其RⅠ和RⅡ区域多肽(双拷贝)的表达,命名为GST-PRN、GST-PN、GST-PC、GST-2PRⅠ和GST-2PRⅡ。Westernblot检测证实5种表达产物均具有良好的反应原性。在主动免疫保护试验中,5种表达产物均能诱导小鼠产生较高的PRN抗体水平;当使用3LD50的支气管败血波氏杆菌(Bb)强毒株HH0809进行鼻腔攻击后,GST-2PRⅠ的保护率为66.7%(6/9),其余4者的保护率均为100%(9/9);当使用10LD50的HH0809攻击时,其保护率分别为77.8%(7/9)、33.3%(3/9)、66.7%(6/9)、10%(1/10)和60%(6/10)。在被动免疫保护试验中,当使用10LD50的HH0809进行腹腔攻击时,GST-2PRⅠ抗血清对小鼠的保护率为20%(2/10),其余4者的保护率均为100%(10/10);但经天然PRN吸附后的5种兔抗血清均无任何保护力(0/5)。【结论】本研究表明PRN的N端和C端表达多肽均具有较强的针对Bb的保护力,且C端强于N端;而C端RⅡ区域的保护力也显著强于N端RⅠ区域。     

重组虎纹捕鸟蛛毒素Ⅰ在巴氏毕赤酵母中的表达及纯化

纹捕鸟蛛毒素Ⅰ是从虎纹捕鸟蛛粗毒中分离纯化,具有镇痛活性的肽类神经毒素。对巴氏毕赤酵母生产的重组HWTX-Ⅰ进行多步纯化,首先将分泌到培养上清的rHWTX-Ⅰ进行90％饱和度的（NH₄）₂SO₄沉淀,再用截留分子量3kD的滤膜脱盐,再用CM阳离子交换层析分离,最后用C₁₈反相层析脱盐纯化,真空干燥后得到的rHWTX-Ⅰ经Tricine SDS-PAGE,质谱鉴定,氨基酸组成分析,N-端序列测定及活性鉴定,证明已获得高纯度的重组HWTX-Ⅰ,摇瓶表达量约为80mg/L,约占总分泌量的23.6%,并对摇瓶发酵条件进行了优化,为利用基因工程方法生产HWTX－I的规模化生产及临床应用提供了证据。     

毕赤酵母表达重组人白细胞介素11的纯化与鉴定

报道了毕赤酵母表达人白细胞介素11的下游工艺研究,并对其产物进行了分析鉴定。所用工艺流程为离心收集上清、超滤浓缩脱盐、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤。所得产物经SDSPAGE电泳、RPHPLC分析、N端和C端序列分析、质谱、等电点分析和生物学活性分析,结果表明：产品纯度大于97%,结构和性质与E.coli融合表达的Neumega完全一致。     

虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅰ cDNA克隆及序列

 从中国珍稀毒蛛种虎纹捕鸟蛛 (Selenocosmia huwena)毒腺中分离纯化的虎纹捕鸟蛛毒素 - (Huwentoxin ,HWTX- ) ,其一级结构、二级结构和溶液构象均已阐明 ,生理功能实验已证实 HWTX- 是一种作用于突触前膜的神经毒素和高阈值钙通道抑制剂 .为深入开展对 HWTX- 的应用研究 ,根据 HWTX- 多肽氨基酸序列 ,设计其 N-端、C-端和中间段 3组简并引物 (引物 、引物 和引物 ) .从虎纹捕鸟蛛毒腺提取制备 m RNA,逆转录合成 c DNA.以引物 和引物 为引物 ,采用 PCR方法对虎纹捕鸟蛛毒腺总 c DNA进行简并引物扩增 ,得到两条相对特异性的 DNA片段 ,产物直接与 PCR克隆载体 p UC- T连接 .重组子经原引物再次 PCR扩增和同位素标记引物 进行 Southern分子杂交鉴定 .对 4个重组子测序结果表明 ,有 1个重组子所对应的氨基酸顺序与 HWTX- 一致 ,Gen Bank数据检索说明 HWTX- c DNA编码序列确实是一个从未报道的序列 .本研究结果为 HWTX- 在真核细胞表达 ,大量获取蜘蛛毒素组分奠定了基础 .     

人骨形成蛋白-2C端102肽的诱骨活性

为分析更短的Hbmp-2C端肽是否具有诱骨活性 ,寻求新型的有诱骨活性的基因工程Hbmp-2产品。利用温度诱导的大肠杆菌表达系统表达肽段长度为102个氨基酸的Hbmp-2C端肽及其Cys的突变体。表达产物经纯化复性后 ,植入小鼠肌袋模型中测试其诱骨活性。获得了能稳定表达Hbmp 2C端肽的工程菌 ,测序结果与预期的序列完全一致。表达产物以包涵体形式存在 ,表达量占细胞总蛋白的 3 0 %。产物经纯化复性后 ,小鼠肌袋模型测试结果表明 :Hbmp 2 10 2肽仍具有诱骨活性 ,而将C端第一位Cys突变的 10 2肽诱骨活性丧失。实验表明 :比Hbmp 2成熟肽 ( 114个氨基酸 )更短的C端 10 2肽仍具有良好诱骨活性 ,这 10 2肽N端第一个Cys对其诱骨活性可能是必需的。     

无色杆菌蛋白酶Ⅰ肽链N端作用的突变研究

无色杆菌蛋白酶Ⅰ（AchromobacterproteaseⅠ,APⅠ）是高度专一于赖氨酸的丝氨酸蛋白酶．比较其它典型同类蛋白酶的一级结构,该酶的成熟体肽键在N端和C端分别长出9个和26个氨基酸践基．在其N端设计和构建了一些突变体,它们分别具有缩短或延长的N端．这些突变体低于天然酶的活性和稳定性的结果揭示,N端这部分延长在稳定该酶的活性构象方面起着重要作用．     

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)N蛋白C端重组蛋白的原核表达、纯化及应用

通过原核表达系统探究SARS-CoV-2核衣壳(Nucleocapsid,N)蛋白C端重组蛋白表达、纯化的制备方式以及提供有效的重组蛋白用于COVID-19的早期快速诊断.合成N蛋白C端基因序列,构建重组载体,利用原核系统表达重组目的蛋白.利用Ni2+亲和层析和凝胶过滤层析的方法对表达产物进行纯化,SDS-PAGE电泳...     

虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅰ单残基突变体R20A-HWTX-Ⅰ的化学合成与性质分析

虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅰ(Huwentoxin-Ⅰ,HWTX-Ⅰ)是从虎纹捕鸟蛛(-Selenocosmia huwena)-的粗毒中分离出的一种多肽类神经毒素。为了探明该毒素分子中唯一的Arg残基与其生物学活性的关系,运用固相多肽合成技术和Fmoc化学直接构建了Ala取代HWTX-Ⅰ第20位Arg(R20)的突变体R20A-HWTX-Ⅰ;将合成的突变体置于含谷胱甘肽的缓冲体系中氧化复性后用反相和特殊设计的离子交换HPLC纯化,并对之进行氨基酸组成、Edman降解与质谱分析。活性测定结果表明,HWTXⅠ分子中的R20被A取代后,活性下降了92%,提示R20是与活性密切相关的重要残基。     

重组A型产气荚膜梭菌α毒素C端基因在大肠杆菌中的高效表达

在成功克隆A型产气荚膜梭菌α毒素C端基因(cpa408基因)后,发现基因N端ATG后密码子在大肠杆菌中的使用频率普遍偏低,在不改变氨基酸的前提下,对N端基因进行修饰,构建重组表达质粒pBV220cpa408,导入大肠杆菌DH5α中,经温度诱导,cpa408基因获得了高效表达,表达量达菌体总蛋白的4375%,表达产物以可溶形式存在。经Westernblot分析,表达产物能被标准抗α毒素血清识别。     

含Arg9的人抗HBsAg单链抗体/ EGFP融合蛋白基因的构建、表达和内化作用的研究

目的：构建、表达和纯化带有转膜结构域Arg9的ScFv14/EGFP融合蛋白, 并对纯化产物的亲和 活性和内化作用进行研究。 方法： 将Arg9的编码序列分别重组到ScFv14/EGFP基因的5'端或3'端或二者之间,将它们分别克隆入原核表达载体pET32a,转化大肠杆菌BL21(DE3)LysS进行诱导表达和纯化,用间接ELISA方法检测表达产物与HBsAg的亲和活性,并用间接免疫荧光检测纯化蛋白的内化活性。 结果：经测序及酶切鉴定证实四种融合基因序列完全正确.SDS-PAGE和Western blot证实四种融合基因成功表达和纯化.间接ELISA检测证实四种融合蛋白均具有HBsAg结合活性,间接免疫荧光检测显示N端带有Arg9的融合蛋白有较强的内化作用,而且不内化进入HBsAg非表达的细胞。 结论：成功构建、表达和纯化了ScFv14/EGFP融合蛋白和三种带有Arg9的ScFv14/EGFP融合蛋白,纯化产物均具有与抗原HBsAg亲和的活性,N端带有Arg9的融合蛋白与靶细胞作用有较强的内化作用。     

融合表达HLH结构域对猪溶菌酶抗菌活性的影响

[目的]通过遗传操作提高猪溶菌酶抗革兰氏阴性菌的活性。[方法]对猪溶菌酶进行分子模拟,得到了包含功能肽的螺旋-回环-螺旋(HLH)结构域,将HLH编码基因与猪溶菌酶基因N端或C端进行融合,于大肠杆菌中诱导表达,经复性、纯化后检测其抗菌活性,并利用原子力显微镜和荧光染色对抗菌活性较高的融合蛋白杀菌机制进行初探。[结果]与对照组相比,N端和C端融合蛋白基本保持了猪溶菌酶对革兰氏阳性菌的活性;同时,两种融合蛋白对革兰氏阴性菌的抗菌活性均显著增强,其中N端融合产物活性更高,它对大肠杆菌ATCC 10798、大肠杆菌ATCC 25922、克雷伯氏菌TR5、铜绿假单胞菌ATCC 15442、沙门氏菌CMCC(B)50335的抗菌系数分别为1.64、1.24、2.56、1.72和1.42,最低抑菌浓度分别为90μg/mL、100μg/mL、40μg/mL、80μg/mL和100μg/mL。经检测,该融合蛋白能显著增强革兰氏阴性菌细胞膜的通透性。[结论]通过融合表达自身来源的HLH结构域,猪溶菌酶抗革兰氏阴性菌活性得到了显著提升,可为其它溶菌酶抗菌活性的提高提供参考。     

大肠杆菌CMP-唾液酸合成酶最小活性域的研究

比较大肠杆菌与脑膜炎奈瑟氏球菌的CMP－唾液酸合成酶的氨基酸序列,发现大肠杆菌CMP－唾液酸合成酶的保守区域主要位于N－端,其C－末端似乎对其催化活性没有作用。通过PCR方法,对大肠杆菌CMP－唾液酸合成酶的C－末端进行了一系列截短,将得到的产物连接至表达载体pET-15b中,在大肠杆菌BL21（DE3）pLysS中表达。经IPTG诱导,发现从C－末端截去189个氨基酸酶仍有催化活性,说明大肠杆菌CMP－唾液酸合成酶的最小活性域主要集中在N－不端的229个氨基酸。在催化活性的C－端缺失突变合成酶的比活,最适pH及热稳定性发生变化,提示被截去的C－端氨基酸残基虽不直接参与构成酶的催化活性中心,但可影响催化活性域的构象,从而对酶的催化活性与稳定性产生影响。     

大型反应器内pH不均一性对CHO细胞流加培养过程的影响

为了研究大型反应器中p H不均一性对CHO细胞流加培养过程的影响,并将培养过程顺利地放大到生产规模,根据大型反应器的混合特性,构建了搅拌式反应器与平推流反应器串联的规模缩小装置用于模拟大型反应器中的p H不均一性。结果表明停留时间为30 s时,整个培养过程和对照相比并无显著的差异,这表明此时补碱所导致的p H不均一性并未对流加培养工艺造成影响。而随着停留时间的延长,反应器内p H不均一的程度越大,细胞生长和产物表达受到抑制越明显;与此同时,乳酸和氨的累积显著增加,而关键质量属性唾液酸和生物学活性也随之降低。     

Thr28突变对虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅳ钠通道活性的影响

虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅳ(HWTX-Ⅳ)是从虎纹捕鸟蛛粗毒中分离纯化到的一种新型多肽类神经毒素,能明显抑制表达于大鼠背根神经节细胞的河豚毒素敏感型(TTX-S)钠通道.为了更好地研究该毒素的结构与功能之间的关系,采用芴甲氧羰基(Fmoc)固相多肽化学合成法合成了用谷氨酸(Glu)替代HWTX-Ⅳ第28位苏氨酸残基的突变体T28D-HWTX-Ⅳ,线性多肽合成产物经反相高效液相色谱(HPLC)分离纯化后进行谷胱甘肽氧化复性.复性产物采用基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF MS)技术鉴定分子质量,通过全细胞膜片钳电生理技术测定其电压门控钠通道药理学活性.当第28位Thr残基被Glu取代后,突变体T28D-HWTX-Ⅳ对表达于大鼠DRG细胞膜上的TTX-S钠通道的IC50值约为362 nmol/L,对TTX-S钠通道的抑制活性比天然HWTX-Ⅳ(IC50值=30 nmol/L)下降了约12倍,显示第28位的Thr残基是HWTX-Ⅳ与TTX-S型钠通道相互作用的关键活性残基.目前的研究为进一步探索HWTX-Ⅳ的结构与功能关系及新型镇痛药物的研发奠定了基础.     

在大肠杆菌中分泌型表达人α心钠素衍生物

<正> 我们化学合成及克隆了α-ANF基因井将其重组于大肠杆菌分泌型表达质粒pIN-Ⅲ-OmpA进行表达;表达产物为N端多11肽的39肽α-ANF类似物,完全分泌至培养外液中;生物学活性测定表明,表达产物具有与天然心钠素相同的免疫活性及降压、利尿和舒张血管的生物活性。     

牡蛎热休克蛋白70吸附人源诺如病毒功能域的解析

人源诺如病毒（Human norovirus, HuNoV）是全球范围内最重要的食源性病毒之一，牡蛎是其主要的食源性传播载体。已有研究发现：牡蛎热休克蛋白70(oyster Heat shock protein 70, oHSP70)可吸附不同基因型HuNoV，但oHSP70吸附病毒的功能域不清楚。本研究对oHSP70的N端和C端分别进行克隆表达纯化，并采用ELISA方法测定其与不同基因型HuNoV主要衣壳蛋白P功能域的结合能力。实验结果表明：成功获得N端和C端oHSP70的原核表达产物；N端oHSP70与不同基因型HuNoV P蛋白结合能力显著强于C端（P<0.05）。因此，N端oHSP70是结合HuNoV P蛋白的主要结构域。本研究结果为进一步揭示oHSP70与HuNoV互作的分子机制提供了理论支撑。     

虎纹捕鸟蛛粗毒双向凝胶电泳分析及部分蛋白质点的N端序列测定

采用固相 p H梯度等电点聚焦 - SDS双向聚丙烯酰胺凝胶电泳对虎纹捕鸟蛛粗毒进行了分析 ,通过考马斯亮蓝与银染法显色 ,电脑软件识别出约 30 0个蛋白质点 .约有 35个含量较高的蛋白质点分布在分子量 1 0 k D以下区域 ,通过印迹法将凝胶上蛋白质点转移到 PVDF膜上以后 ,对上述分子量 1 0 k D以下的组分进行了 N端序列测定 ,鉴定到了虎纹捕鸟蛛毒素 HWTX- ,HWTX- ,HWTX- 和 SHL- 1在凝胶上的位置 ,同时发现了 5种新的肽类毒素组分 .     

一种重组人α1型干扰素突变体IFN-α1/86D的纯化与鉴定

本文研究了重组人α1型干扰素突变体IFN-α1/86D在摇瓶培养和分批发酵培养的重组大肠杆菌DH5α株中的表达动态,并采用阳离子交换层析和抗α1型干扰素单克隆抗体亲和层析的两步流程对其进行了纯化,得到SDS-PAGE纯及高效液相层析(HPLC)纯的IFN-α1/86D产品,共比活性为2.3×10~7单位/毫克蛋白。N端氨基酸序列测定的结果表明,纯化产品的纯度在95％以上,但其N端不均一,产品中含有两种N端序列正确的IFN-α1/86D活性分子,即约75％为去Met分子和约25％为带Met分子。