应用多重RT—PCR技术检测食管癌患者外周血多种肿瘤基因标志物的研究

目的:建立多重RT-PCR同步检测技术,联合检测黑色素瘤抗原MAGEA3基因、人类斯钙素hsTC1基因、上皮细胞角质蛋白CK20、CK19基因及癌胚抗原CEA基因mRNA在食管癌患者外周血中的表达。方法:在分析MAGEA3、hSTC1、CK20、CK19、CEA和β-actin六种基因mRNA全长序列资料的基础上,自行设计并筛选出6对引物及6条寡核苷酸探针,利用多重RT-PCR技术并结合基因芯片对样本进行检测。结果:全部样品均可检出β-actin,55例食管癌患者外周静脉血中MAGEA3、hSTC1、CK20、CK19和CEA的阳性表达率分别为25.45%、47.27%、49.09%、34.55%和52.73%;多重RT-PCR技术同时检测MAGEA3、hSTC1、CK20、CK19和CEA基因,如果至少表达其中一种即可作为阳性表达者,其阳性表达率可达72.73%。而10例食管癌组织中均为阳性,28例正常健康捐献者的外周血中有2例CEA表达阳性,27例非肿瘤病人的外周血中有3例CK20阳性,3例CK19阳性,3例CEA阳性。测序结果证实RT-PCR产物确为MAGEA3、hSTC1、CK20、CK19和CEA基因。结论:联合检测MAGEA3、hSTC1、CK20、CK19和CEA可以增加外周血循环癌细胞检测的敏感性,本研究建立的多重RT-PCR技术可以做为一种快速、灵敏的检测手段。     

多重检验法在基因芯片研究中鉴定差异表达基因的统计功效

鉴于基因芯片实验的造价,在基因芯片实验设计中,首要考虑的因素是需要多少重复才能检测出一个具有显著差异表达的基因。计算多重检验法要求的重复数（样本大小）或功效可为基因芯片实验设计提供重要的参考。为此,本文基于置换重抽样法构建了一种基因表达噪声混合分布模型。该方法适用各类基因表达数据,即无论是基因表达单噪声源或是多噪声源都可行。应用混合模型和多重检验法并给定统计功效。研究者能在基因芯片实验中获得所需要的最少生物学重复数：或者根据样本大小来确定测定一个显著差异表达的基因所具有的检验功效;或者根据样本大小和统计检验功效,选择最好的统计测验方法。本文以一组在老鼠中与中风有关的3000个基因的基因芯片实验所获得的数据为例,应用该方法拟和后组建了一个单分布模型（即表达单噪声源的分布模型）。根据该模型,我们计算了4种多重检验法在鉴定一个具有表达差异（D）值的基因中所需要的统计功效。结果表明。检测一个小的差异D值,4种多重检验法中B方法的统计功效最低,而BH方法最高。但是,对于鉴定一个具有最大表达差异的基因时,4种方法有相同的鉴定功效。与传统的单个检验法一样,BH方法检测一个小的变化所需要的效率不会随基因数目增加而改变,其他3种多重检验法的检测功效则随基因数目增加而降低。     

马铃薯病毒一步法多重RT-PCR检测技术的构建

根据马铃薯病毒PVX、PVY、PVA、PLRV的CP基因序列设计4对特异性引物,通过对试剂浓度和反应条件进行优化,建立了能够同步检测PVX、PVY、PVA、PLRV的一步法多重RT-PCR检测方法。该方法对PVX、PVY、PVA、PLRV扩增出的靶带大小分别为732、422、132和336 bp,凝胶电泳易辨别区分。病毒RNA最低检测限度为7.8 pg/μL,对PVM、PVS、AMV、TMV及PSTVd的扩增为阴性。研究结果表明,该方法特异、灵敏,比两步法多重RT-PCR检测更加快速、简便,提高了检测效率,降低检测成本,为马铃薯病毒的高效检测提供了有效手段。     

应用多重PCR技术检测性器官异常患者的性别决定基因

采用针对人SRY基因及X与Y染色体同源序列的两对引物进行多重聚合酶链反应技术检测204例新生儿脐血DNA,男性均显示590bp、 355bp及280bp 3条扩增带,女性只有590bp1条扩增带,性别鉴定准确率为100%。又检测47例性器官异常患,13例社会性别为女性者只出现590bp扩增带,与核型性别结果一致。 34例社会性别为男性者中,有2例SRY基因检测结果阴性,只出现590bp带,核型为46,XX,证明这两例患者社会性别不相符,经病理证实后应诊断为女性假两性畸形。 Abstract:This investigation adapted multiplex PCR technique with two pairs of primer to determine sex according to the human SRY gene and X,Y chromosome analogical sequence.We detected bellybutton blood DNA from 204 newborns.Male revealed three bands:590bp,355bp and 280bp,and females only had one band which was 590bp,the accuracy of sex determination was 100%.47 sexual abnormal patients were tested.The results showed that 13 cases,whose social sex were female,had one 590bp band which consistent with their chromosome type sex.In the rest 34 cases,whose social sex were male,2cases showed,on the contrary,only one 590bp band and their chromosome type were 46,XX.This proved that the two patients did not consistent with their social sex,and pathological analysis showed that they were female pseud-hermaphroditism.     

应用多重PCR技术检测性器官异常患者的性别决定基因

采用针对人SRY基因及X与Y染色体同源序列的两对引物进行多重聚合酶链反应技术检测204例新生儿脐血DNA,男性均显示590bp、 355bp及280bp 3条扩增带,女性只有590bp1条扩增带,性别鉴定准确率为100%。又检测47例性器官异常患,13例社会性别为女性者只出现590bp扩增带,与核型性别结果一致。 34例社会性别为男性者中,有2例SRY基因检测结果阴性,只出现590bp带,核型为46,XX,证明这两例患者社会性别不相符,经病理证实后应诊断为女性假两性畸形。 Abstract:This investigation adapted multiplex PCR technique with two pairs of primer to determine sex according to the human SRY gene and X,Y chromosome analogical sequence.We detected bellybutton blood DNA from 204 newborns.Male revealed three bands:590bp,355bp and 280bp,and females only had one band which was 590bp,the accuracy of sex determination was 100%.47 sexual abnormal patients were tested.The results showed that 13 cases,whose social sex were female,had one 590bp band which consistent with their chromosome type sex.In the rest 34 cases,whose social sex were male,2cases showed,on the contrary,only one 590bp band and their chromosome type were 46,XX.This proved that the two patients did not consistent with their social sex,and pathological analysis showed that they were female pseud-hermaphroditism.     

转基因白桦外源基因的多重PCR快速检测

根据转化的载体序列上T-DNA中的目的基因bt,选择性筛选标记基因nptⅡ和报告基因gus设计三对特异性引物,PCR产物片断大小分别为247、449、668 bp,应用多重PCR (mutiplex-PCR)的方法同步检测18株转基因白桦中三个基因的整合状况;用阳性对照为模板,对单重PCR（simplex-PCR）和多重PCR的各项指标进行比较。结果表明多重PCR检测多个外源基因在敏感性方面与单重PCR相比并没有减弱,而且略有提高;对18株样品的多重PCR同步检测无假阳性出现,结果准确,同时在操作中具有减少污染,缩短时间和节约成本等优点。因此,在对转基因白桦的外源基因的定期检测中,多重PCR是一种非常有效而便捷的方法,可以为转基因的拷贝数,T-DNA旁侧序列特征等转基因整合特性方面的研究提供数据。     

医院感染多重耐药革兰阴性杆菌耐消毒剂基因的检测分析

目的研究医院感染多重耐药革兰阴性杆菌耐消毒剂基因qac E△1-sul1存在情况。方法采用聚合酶链反应(PCR)技术检测qac E△1-sul1基因。结果 201株多重耐药革兰阴性杆菌对阿莫西林和头孢类等抗菌药物多数耐药率均达到50%以上,但对碳青霉烯类仍高度敏感。qac E△1-sul1基因的总检出率为40.80%,其中产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)大肠埃希菌、产ESBLs肺炎克雷伯菌、多重耐药鲍曼不动杆菌、多重耐药的铜绿假单胞菌qac E△1-sul1检出率分别为34.78%、44.23%、58.91%和31.25%。结论医院感染患者临床分离多重耐药革兰阴性杆菌耐消毒剂基因qac E△1-sul1携带率较高,加强多重耐药革兰阴性杆菌对消毒剂耐药性的监测,对临床合理使用消毒剂具有重要意义。     

多重RT-PCR用于临床检测三种胃肠炎病毒的研究

轮状病毒、诺瓦克病毒和星状病毒是引起病毒性胃肠炎的主要病原因子。研究采用JV12/JV13、P1/P2和Mon340/Mon348三对引物,建立了同时检测这3种病毒的多重RT-PCR技术,并应用于128份临床粪便样本的检测,检出轮状病毒62份(48.44%),诺瓦克病毒8份(6.25%),星状病毒11份(8.59%)。在灵敏度试验中,轮状病毒的检测灵敏度为5pg/mL、诺瓦克病毒和星状病毒的检测灵敏度均为50pg/mL。该研究所建立3种常见胃肠炎病毒的多重RT-PCR方法具有特异性强、灵敏度高的特点,可用于临床病原诊断和溯源。     

中东呼吸综合征冠状病毒多重荧光定量RT-PCR检测技术的建立

建立中东呼吸系统综合征冠状病毒(MERS-CoV)感染的筛查与诊断应用的核酸检测方法。本研究建立了基于MERS-CoV三个分子靶标(upE,ORF1b,N2)的双重以及三重的三种荧光定量RT-PCR检测技术方法,分别与前期建立的单重荧光定量RT-PCR(upE或N2)检测方法做了比较,并且采用MERS-CoV病毒毒株、上海提供的口岸发烧病人样本以及由首例中国MERS-CoV韩国地区输入病例的咽拭子样品和全血的样品做了临床验证。结果显示:采用MERS-CoV病毒毒株作为模板,三种新建立的多重检测方法与单重荧光定量RT-PCR检测方法最低检测限均能达到10PFU/mL,且与其他常见呼吸道病毒的阳性样本均无交叉反应,特异性良好。对临床样品的验证中,上海病人咽拭子样本均为阴性,而中国首例MERS输入病例的急性期咽拭子样品均为阳性,而全血样的检测结果显示N2靶标有较高检出率,明显优于基于upE单一靶标。本研究所建立的基于MERS-CoV三个分子靶标(upE,ORF1b,N2)的双重以及三重荧光定量RT-PCR检测技术方法用于MERS-CoV感染的实验室诊断,具有较高灵敏度与特异性及适用性。     

应用基因芯片技术检测肝组织的基因表达

为检测正常肝组织中的基因表达状况,采用cDNA microarray技术对正常肝组织中表达的1500个基因进行定量。结果为97 个基因较高表达,1010个基因中度表达,380个基因低表达。结果是cDNA microarray技术是大规模检测基因表达的有效方法。     

食管癌根治性放疗前后外周血CK19 mRNA变化的临床意义

目的:研究检测食管癌根治性放疗前后外周血中循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTC)标记细胞角蛋白19(Cytokeratin19,CK19)mRNA的变化及其临床意义。方法:收集72例食管癌患者根治性放疗前后外周血,应用巢式RT-PCR检测CK19 mRNA的表达,分析其与放疗疗效及两年无进展生存(progerssion-free survival,PFS)的关系。结果:放疗前后CK19 mRNA阳性者分别占44.4%(32/72)与30.6%(22/72),差别无统计学意义(P=0.085)。放疗前32例表达阳性者,放疗后其中12例转阴(37.5%),20例持续阳性(62.5%);40例阴性者,2例转为阳性(5.0%),38例持续阴性(81.2%)。并且,放疗前后CK19 mRNA变化与放疗疗效相关,放疗后CK19 mRNA阳性提示2年无进展生存期较差。结论:食管癌根治性前后外周血CK19 mRNA变化对于判断放疗疗效及预后具有重要意义。     

食管癌根治性放疗前后外周血CK19 mRNA变化的临床意义

目的：研究检测食管癌根治性放疗前后外周血中循环肿瘤细胞（circulating tumor cells,CTC）标记细胞角蛋白19（Cytokeratin19,CK19）mRNA的变化及其临床意义。方法：收集72例食管癌患者根治性放疗前后外周血,应用巢式RT-PCR检测CK19 mRNA的表达,分析其与放疗疗效及两年无进展生存（progerssion-free survival,PFS）的关系。结果：放疗前后CK19 mRNA阳性者分别占44.4%（32/72）与30.6%（22/72）,差别无统计学意义（P=0.085）。放疗前32例表达阳性者,放疗后其中12例转阴（37.5%）,20例持续阳性（62.5%）;40例阴性者,2例转为阳性（5.0%）,38例持续阴性（81.2%）。并且,放疗前后CK19 mRNA变化与放疗疗效相关,放疗后CK19 mRNA阳性提示2年无进展生存期较差。结论：食管癌根治性前后外周血CK19 mRNA变化对于判断放疗疗效及预后具有重要意义。     

Expression and Clinical Significance of CK19 and CK20 Expressions in Transverse Mesocolon Biopsies from Patients with Gastric Carcinoma

We sought to evaluate in this study the significance of cytokeratin (CK)-19 and CK-20 in determining the peritoneal micrometastasis of gastric carcinoma and also determine the factors related with the occurrence of peritoneal micrometastasis. For this purpose, 152 patients with gastric cancer were enrolled in the study and transverse mesocolon biopsies were undertaken intraoperatively. The CK19 and CK20 immunohistochemical staining were performed on the tissue samples, and the results were compared with those of H&E staining and peritoneal lavage cytology (PLC). Our data show that the positivity rates of CK19 and CK20 in transverse mesocolon were 48.6 and 61.2%, respectively, which were significantly higher (P < 0.05) than that (10.0%) of PLC. Besides, the positivity rate increased with the depth of tumor invasion. Based on these data, we concluded that CK19 and CK20 expressions could be adopted to determine the peritoneal micrometastasis for accurate clinical staging of the patients. These data provide reliable guideline for postoperative treatment and prognosis of gastric carcinoma.     

斯钙素-1基因在食管鳞癌患者骨髓中的检测及其临床意义

目的:探讨斯钙素(stanniocalcin-1,STC-1)在食管鳞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)患者骨髓中的表达及其临床意义.方法:术中收集85例ESCC患者肋骨骨髓,应用巢式RT-PCR检测STC-1 mRNA的表达,并分析其与临床病理特征及两年无进展生存(Progress Free Survival,PFS)的关系.结果:骨髓STC-1 mRNA阳性率为21.2％ (18/85).STC-1阳性与患者临床分期(P=0.013)及淋巴结转移(P=0.029)相关,其2年PFS(平均15.0月)亦劣于STC-l阴性者(平均19.7月)(P=0.003).结论:骨髓STC-1 mRNA检测对于判断ESCC微转移具有重要意义,可望成为ESCC潜在预后标志物.     

氟比洛芬酯对食管癌患者围术期外周血淋巴细胞亚群的影响

目的:探究氟比洛芬酯对食管癌患者围术期外周血淋巴细胞亚群的影响。方法:选择2014年6月~2016年8月期间在我院择期行食管癌根治术患者72例为研究对象,采用随机数字法将其分为氟比洛芬酯组(39例)和对照组(33例),患者均给予常规麻醉处理,对照组患者泵入5 mg托烷司琼与20μg/kg芬太尼;氟比洛芬酯组患者给予氟比洛芬酯2 mg/kg。评价术后12 h、24 h和48 h患者疼痛情况(VAS评分),并于术前1 h、术后24 h、术后72 h检测患者血清T细胞中CD3~+、CD4~+、CD8~+及CD56~+比例。结果:两组患者术后不同时刻VAS评分比较,差异均无统计学意义(P0.05);术后24 h两组患者CD3~+、CD4~+、CD4~+/CD8~+均显著降低(P0.05),术后72 h两组患者CD3~+、CD4~+、CD4~+/CD8~+水平均升高,且氟比洛芬酯组患者恢复到术后1 h水平,而对照组患者均仍低于术后1 h,且术后72 h氟比洛芬酯组CD3~+、CD4~+、CD4~+/CD8~+均高于对照组,差异均有统计学意义(P0.05),而CD8~+与CD56~+比例在两组各个时点均没有变化(P0.05);两组患者均未发生严重不良反应。结论:食管癌患者在手术过程中均出现免疫抑制,氟比洛芬酯麻醉效果较好,且对机体免疫功能具有保护作用,促进手术患者免疫功能的恢复,具有重要的临床价值。     

局部晚期鼻咽癌患者外周血VEGF检测及意义

目的:研究血管内皮生长因子(vascular endothelium growth factor,VEGF)在局部晚期鼻咽癌患者外周血中的表达相,探讨VEGF与局部晚期鼻咽癌预后的关系,研究是否能预测局部晚期鼻咽癌患者的预后,或作为局部鼻咽癌治疗的靶分子,为寻找局部晚期鼻咽癌放化疗疗效的分子生物学评价指标提供依据。方法:选择57例局部晚期鼻咽癌患者,收集外周血标本,酶联免疫吸附实验(enzym-linked immunosorbent assay,ELISA)检测外周血中VEGF蛋白水平。结合临床病理特征和随访资料进行分析。结果:(1)局部晚期鼻咽癌患者外周血VEGF表达水平均与复发率、远处转移率有关(P0.05)。(2)局部晚期鼻咽癌患者外周血VEGF的表达水平与性别和年龄无关(P0.05)。(3)局部晚期鼻咽癌患者外周血VEGF的表达水平与生存率有关(P0.05)。结论:局部晚期鼻咽癌患者外周血中VEGF的表达水平对复发率、远处转移率和生存率有影响,提示VEGF在局部晚期鼻咽癌的侵袭转移中可能起协同作用;VEGF检测对筛选较高鼻咽癌转移风险的患者可能有更大的临床价值。     

GCC mRNA和hTERT mRNA在腹腔镜结直肠癌根治术患者外周血中的表达及意义

目的:探讨腹腔镜和开腹手术对结直肠癌根治术患者外周血鸟苷酸环化酶C(GCC)m RNA和人端粒酶逆转录酶(h TERT)m RNA表达的影响及其意义。方法:按照随机数字表法将2009年8月-2014年4月我院收治的结直肠癌患者分为腹腔镜组和开腹手术组,通过逆转录-聚合酶链反应技术(RT-PCR)检测并比较两组患者外周血GCC m RNA和h TERT m RNA的表达情况。结果:与开腹手术组相比较,腹腔镜组患者手术时间长、术中出血量少、术后排气早、住院时间短,差异有统计学意义(P0.01);两组患者手术前GCC m RNA和h TERT m RNA阳性率无显著差异(P0.05);两组患者手术后GCC m RNA和h TERT m RNA阳性率显著升高,差异有统计学意义(P0.05)。结论:腹腔镜和开腹手术均会增加结直肠癌患者血行微转移,但腹腔镜结直肠根治术不会增加术后肿瘤血循环微转移的危险性。     

系统性红斑狼疮外周血单个核细胞cFLIP—L mRNA和cFLIP—S mRNA表达的研究

目的探讨系统性红斑狼疮（system lupus erythematosus,SLE）患者外周血单个核细胞（peripheral blood monouuclear cells,PBMC）中细胞型Fas相关死亡域样白介素-1β转换酶抑制蛋白（cFLIP）表达的意义。方法应用半定量RT—PCR方法检测38例SLE患者和21名正常人PBMC中cFLIP—L mRNA和cFLIP—S mRNA的表达水平,并与SLE疾病活动指数（SLEDAI）评分进行相关性分析。结果①SLE患者PBMC中cFLIP—L mRNA和cFLIP—S mRNA表达水平均明显高于正常对照组（P〈0．01）;SLE患者活动组cFLIP—L mRNA表达水平显著高于非活动组（P〈0．05）,cFLIP—S mRNA表达水平在SLE患者活动组与非活动组之间没有显著性差异（P〉0．05）。②SLE患者cFLIP—L mRNA表达水平与SLEDAI评分呈正相关（r=0．423,P〈0．01）;而eFLIP—S mRNA表达水平与SLEDAI评分无明显相关性（r=0．270,P〉0．05）。结论cFLIP—L mRNA和cFLIP—S mRNA可能在SLE发病机制中起重要作用。     

变应性鼻炎患者外周血中Tr1/Th3细胞的检测和分析

目的:检测变应性鼻炎(Allergic rhinitis,AR)患者和健康对照者外周血中IL-10+CD4+T细胞、TGF-β+CD4+T细胞(分别代表Tr1细胞和Th3细胞的特性)的比例,并探讨其在AR发病中的意义,为AR的治疗提供临床参考。方法:分离19例对粉尘螨过敏的AR患者和19例健康对照者外周血单个核细胞(PBMCs),采用流式细胞术分别检测外周血中IL-10+CD4+T细胞、TGF-β+CD4+T细胞的比例。结果:同健康对照者相比,AR患者外周血中IL-10+CD4+T细胞的比例显著降低[(1.66±0.48)%vs.(3.80.92)%,t=-9.08,P0.01)],AR患者外周血中TGF-β+CD4+T细胞的比例降低[(1.92±0.54)%vs.(4.76±1.12)%,t=-9.94,P0.01)]。结论:外周血中IL-10+CD4+T(Tr1)细胞比例的降低可能是AR发病的一个重要因素,提高AR患者外周血中分泌IL-10的Tr1细胞的比例可能在AR的治疗中具有重要意义。外周血中TGF-β1+CD4+T(Th3)细胞的比例显著降低,可能是AR发病的一个重要因素。但TGF-β1与AR关系的研究较少,特别是外周血中TGF-β1水平与AR的关系研究较少,需进一步研究。