NRSE 与 NRSF 及其对神经元特异性基因表达的调控作用

神经限制性沉默元件 (NRSE) 是一段长度为 21~23 bp 的保守 DNA 序列,存在于许多神经元特异表达基因的转录调控区中,神经限制性沉默因子 (NRSF) 能特异性结合到 NRSE dsDNA 上,并通过其 N 端和 C 端阻遏结构域分别连接共阻遏蛋白 Sin3A/B 和 CoREST , Sin3A 招募 HDAC 对组蛋白进行去乙酰基化修饰, CoREST 则作为平台蛋白招募特异的“沉默组件”,以此维持基因沉默 . 最近的研究显示, NRSE dsRNA 能在转录水平与 NRSF 蛋白直接作用,而不是作为 siRNA 或 miRNA 在转录后水平启动神经元特异性基因的表达 .     

神经元限制性沉默因子研究进展

神经元限制性沉默因子（ＮＲＳＦ）是神经元发育中的一个负调探因子。它与靶序列神经元限制性沉默子（ＮＲＳＥ）相互作用,主要调控神经元特异性基因,防止神经元基因在非神经元组织中的异位表达以及防止神经发生中神经元表型的提前表达。最近的研究表明,ＮＲＳＦ还可调控神经元转录编码基因和某些非神经元基因,暗示它在胚胎发育中可能起着更为广泛的作用。     

神经元限制性沉默因子对人胰岛素基因转录调控作用的研究

为了研究神经元限制性沉默因子(NRSF)调控神经元及胰岛细胞中神经特异性基因的表达,进一步寻找胰岛细胞中可能存在的其他NRSF调控基因.先用生物信息学手段对相关基因进行了分析.筛选及序列比对发现,人胰岛素核心启动子区有一段与NRSE相似的序列,提示,它可能受NRSF调控.构建了含NRSF基因的慢病毒载体,将其稳定转染于INS-1细胞.构建了3种荧光素酶报告载体:含有人胰岛素启动子-荧光素酶(hInsP-LUC)的慢病毒载体,pGL3-Basic载体和含有2拷贝NRSE样基序-荧光素酶(NRSE-LUC)的报告载体.利用稳定转染及瞬时转染实验观察NRSF对报告载体中荧光素酶活性的影响.利用电泳迁移率变动分析实验观察NRSE样基序与NRSF蛋白的结合情况,并通过竞争结合实验、引入特异性抗体实验证实探针与蛋白质结合的特异性.RT-PCR检测证实,感染空病毒的INS-1细胞不表达NRSF,感染含目的基因慢病毒的INS-1细胞能表达NRSF.将含有hInsP-LUC的慢病毒载体稳定转染于上述2种细胞,荧光素酶活性分析结果显示,NRSF的过表达能明显降低胰岛素启动子的活性.瞬时转染hInsP-LUC报告系统于上述2种细胞,结果也显示NRSF能明显抑制胰岛素启动子-荧光素酶的活性.将含有NRSE-LUC的报告载体瞬时转染于上述2种细胞,结果表明过表达NRSF的INS-1细胞组的荧光素酶相对值比对照组有明显下降.电泳迁移率变动分析实验进一步证实,此NRSE样序列可以与NRSF蛋白特异结合,这种特异结合可以被标准的NRSE序列所竞争.结果表明,人胰岛素启动子中含有NRSE样序列,该序列通过与NRSF蛋白结合从而抑制人胰岛素启动子的转录活性.这一研究工作有助于进一步了解NRSF在胰岛细胞中的调控作用.     

NRSF与神经系统发育调控

神经系统发育全程中,基因表达模式处于不断变化。这一动态过程是受到机体的精密调控的,NRSF是参与调控的重要分子之一。NRSF是一种含有锌指结构的转录因子,它与神经限制性沉默元件（NRSE／RE-11结合后能募集一些协同作用蛋白,通过组蛋白去乙酰化等机制抑制NRSE下游基因的转录。很多神经特异性基因和一些神经发育调节相关分子的基因序列中载有NRSE,NRSF正是通过动态调控这些基因的表达来调节神经系统发育。由于NRSF靶基因表达模式的变化是神经系统发育进程的重要分子基础,近年来对NRSF与神经系统发育调控的研究备受关注,通过阻断NRSF的异常作用来治疗神经退行性疾病己成为新的研究热点。     

神经元限制性沉默因子在NTera2/CloneD1细胞向神经元分化模型中表达的检测

目的:建立NTera2/CloneD1细胞向神经元分化的模型,检测神经元限制性沉默因子(NRSF)经分化培养基诱导后表达的变化。方法:收集正常培养的NTera2/CloneD1细胞及经全反式维甲酸(RA)、阿糖胞苷(AraC)、尿苷分阶段诱导共28 d的细胞,显微镜下观察诱导前后细胞的形态学变化;免疫荧光法检测NTera2/CloneD1细胞诱导前后干性标志Nestin、Sox2和成熟神经元特异性标志NF-200、β-tubulinⅢ的表达情况;应用RT-PCR和免疫荧光法对NRSF进行mRNA和蛋白水平的检测。结果:显微镜下观察到正常培养的NTera2/CloneD1细胞呈克隆样生长,经分化培养基诱导后的NTera2/CloneD1细胞表现出典型的神经元样细胞形态。免疫荧光检测表明,未诱导的NTera2/CloneD1细胞表达神经干细胞的标志Sox2、Nestin,不表达成熟神经元特异性蛋白NF-200、β-tubulinⅢ;而经RA等诱导分化的细胞则不表达Sox2、Nestin,表达NF-200、β-tubulinⅢ。RT-PCR和免疫荧光检测显示,NRSF在诱导分化后的NTera2/CloneD1细胞中的表达量显著降低。结论:建立了NTera2/CloneD1细胞向神经元分化的模型,NRSF在诱导后的NTera2/CloneD1细胞中表达量显著下调,提示NTera2/CloneD1细胞在诱导过程中可能通过下调NRSF,使受到NRSF负性调控的神经元特异性蛋白启动表达并上调,进而实现NTera2/CloneD1细胞向神经元的定向分化。     

神经元限制性沉默因子与胰岛素在成年小鼠胰腺中的表达

目的:观察神经元限制性沉默因子(NRSF)在正常成年小鼠胰腺组织中的表达情况。方法:以6～8周BALB/c小鼠胰腺为实验材料,制备冰冻切片,与地高辛标记的NRSF cDNA探针进行原位杂交,观察mRNA表达,并结合免疫组织化学方法检测NRSF和胰岛素的表达。结果:原位杂交显示,NRSF mRNA仅表达于胰腺组织外分泌部腺泡腺细胞中,胞浆呈蓝紫色,与免疫荧光组织化学检测NRSF蛋白表达的部位一致,而胰岛细胞中无NRSF mRNA及蛋白的表达。免疫酶组织化学染色显示,胰岛大部分细胞中表达胰岛素,胞浆染成黄棕色,而腺泡腺细胞则不表达胰岛素。结论:NRSF与胰岛素不存在共定位关系,即成年小鼠胰岛细胞不表达NRSF,而表达胰岛素。提示NRSF蛋白表达的消失可能是建立完全分化成熟、具有完好分泌反应的胰岛细胞所必需的。     

NRSF慢病毒干涉载体的构建及功能初步检测

为研究神经元限制性沉默因子(NRSF)负调控神经元及胰岛细胞中神经特异性基因的表达,拟通过RNAi的方法降低NRSF表达以进一步观察其调控的下游基因的表达情况.构建含人胰岛素启动子-荧光素酶(HIP-LUC)的pcDNA3.1报告载体.通过RNAi序列设计软件进行NRSF干涉片段及脱靶对照片段的设计,然后构建慢病毒干涉载体.包装产生慢病毒干涉毒液,用其感染HeLa细胞获得稳定干涉NRSF的细胞株,利用RT-PCR、实时定量PCR、蛋白质免疫印迹、免疫荧光染色等方法检测NRSF的干涉效果及其下游基因的表达情况,观察干涉NRSF后胰岛素启动子报告载体荧光素酶活性的变化.构建具有NRSF干涉效果的慢病毒干涉载体成功,并获得了稳定干涉NRSF及脱靶对照的HeLa细胞株,RT-PCR及实时定量PCR检测结果表明,NRSF干涉片段的干涉效率为56%(n=6,P<0.01),蛋白质免疫印迹、免疫荧光染色方法检测证实干涉后NRSF蛋白表达水平明显降低.RT-PCR实验表明干涉NRSF后下游基因开始表达,荧光素酶活性分析表明,干涉NRSF后胰岛素启动子活性增强了2.4倍(n=3,P<0.01).上述结果表明,成功构建NRSF的慢病毒干涉载体并获得稳定干涉NRSF的HeLa细胞株,干涉NRSF后,其下游基因特别是胰岛素基因开始表达.这一研究工作有助于我们进一步了解NRSF在胰岛细胞发育分化中的调控作用.     

利用条件基因沉默系统研究CHIP对TGF-β信号通路的调控

根据条件基因敲除技术和基因沉默的理论,构建了可被CRE操控的条件基因沉默系统,并应用其研究分子伴侣相互作用蛋白CHIP(C-terminus of Hsc70-interacting protein)对TGF-β信号通路的调控．RT-PCR和免疫印迹结果显示,pLoxP/CHIPi与CRE相互作用后,可以有效地降低内源CHIP的mRNA水平,减少外源和内源CHIP的蛋白质量．荧光素酶报告系统分析表明,条件基因沉默能解除CHIP对TGF-β信号通路的抑制性调控,增强TGF-β信号通路的转录活性．结果表明,CRE依赖的条件基因沉默系统具有高效性、特异性,并通过它反向验证了CHIP对TGF-β信号通路的抑制性调控,为进一步研究与CHIP相关的TGF-β信号通路所致疾病的发生机理提供了有效工具．