人p53启动子萤光素酶报告基因的构建及其活性测定

目的：克隆p53基因的启动子,插入萤光素酶报告基因载体,并检测启动子活性。方法：采用PCR技术从人肝癌细胞系HepG2基因组中扩增人p53启动子,插入萤光素酶报告基因载体pGL4．0-empty,将重组质粒转染293T、ZR75-1、HepG2、A549细胞,测定p53启动子的转录活性。结果：构建了p53启动子的萤光素酶报告基因;通过测序及质粒酶切鉴定,所构建的p53启动子正确;活性实验表明,报告基因在多种细胞中显示构建的p53启动子活性,并呈现一定的剂量效应;转录因子USF能以剂量效应方式提高p53报告基因的转录活性。结论：克隆了人p53启动子,为进一步研究调控p53的转录因子奠定了基础。     

活化素抑制大鼠垂体GH_3细胞中人生长激素基因启动子的活性

本研究旨在探讨活化素(activin)对大鼠垂体GH3细胞中人生长激素(hGH)基因启动子活性的影响及其可能的调节机制。采用荧光素酶报告基因方法。首先建立含hGH基因启动子(-484～+30bp)和荧光素酶融合基因的稳定转染GH3细胞株,然后加入活化素或同时加入活化素与相关信号转导途径的激动剂,通过检测细胞培养液和细胞裂解液中GH的含量,以及GH3细胞内荧光素酶的变化,反映活化素对GH分泌、合成和hGH基因启动子活性的影响。将含不同长度hGH基因启动子序列的荧光素酶表达质粒分别转染GH3细胞,观察它们对活化素的反应,寻找活化素影响hGH基因启动子活性的关键DNA序列。结果表明,活化素(5,50nmol/L)能抑制大鼠垂体GH3细胞中GH的分泌和合成,活化素(5,50nmol/L)还能够抑制GH3细胞中hGH基因启动子的活性,使之仅达对照组的77%和69%;在胞内信号转导激动剂中,丝裂原活化蛋白激酶激酶(MAPKK/MEK)特异性激动剂C6ceramide(1μmol/L)完全取消了活化素对hGH基因启动子活性的抑制作用;活化素发挥抑制作用所需要的hGH基因启动子关键序列位于-132～-66bp之间。上述研究表明,活化素能抑制大鼠垂体GH3中hGH基因启动子的活性,它可能是通过抑制细胞内依赖MAPK的信号转导途径来完成的,同时hGH启动子上-132～-66bp的序列在其中发挥重要的作用。     

SARS冠状病毒N蛋白激活hfgl2凝血酶原酶基因的研究

研究鉴定激活hfgl2凝血酶原酶基因的SARS冠状病毒结构蛋白。从SARS尸检肺组织中抽提RNA后制备cDNA,分别扩增SARS-CoV的N、S2和M全长基因序列,再分别克隆到真核表达载体pcDNA3.1( )上。应用免疫组织化学分析鉴定pcDNA3.1-N、pcDNA3.1-M和pcDNA3.1-S2的表达。构建人纤维介素(hfgl2)启动子荧光素酶报告基因质粒,并将SARS冠状病毒结构蛋白表达质粒分别与其共转染以明确激活hfgl2基因转录的SARS冠状病毒结构蛋白。将目的片段克隆至pcDNA3.1( ),经酶切鉴定和测序鉴定无误;免疫组织化学染色可见明显的CHO细胞胞浆棕染。与hfgl2启动子共转染实验阐明SARS冠状病毒膜(M)蛋白和刺突糖(S2)蛋白对hfgl2基因的激活与对照组无显著差异,而SARS冠状病毒核心(N)蛋白可激活hfgl2启动子,使其转染活性提高4.6倍。SARS冠状病毒N蛋白可增强hfgl2基因的转录活性。     

稳定表达ALB启动子及荧光素酶报告基因的肝干细胞株的构建

目的构建稳定表达ALB启动子及荧光素酶报告基因的肝干细胞株。方法PCR扩增获得ALB启动子,并与pBGLuc连接获得携带ALB启动子及荧光素酶报告基因的pBGLuc—ALB质粒,脂质体转染质粒到不同细胞,ALB—GLuc活性检测功能。构建逆转录病毒,感染HP14．5肝干细胞株获得携带ALB启动子及荧光素酶报告基因的稳定细胞株,经Dex、HGF体外诱导后第3、6、9、12天ALB—GLuc检测荧光素酶活性,免疫荧光检测ALB的表达。结果PCR、酶切及测序结果显示ALB启动子正确插入至荧光素酶GLuc基因上游,HEK293、HP14．5、LC14d及Hepa1-6细胞中ALB—GLuc活性与免疫荧光结果一致。HP14．5ALB—Gluc稳定细胞株在高浓度的稻瘟菌素中存活,免疫荧光结果显示Dex、HGF诱导后细胞中ALB的表达逐渐增强,并与ALB—Gluc活性升高一致。结论成功构建了稳定表达ALB启动子及荧光素酶报告基因的肝干细胞株,为研究肝干细胞的体外成熟分化提供了重要的细胞手段。     

呼吸道黏蛋白5AC基因转录表达的顺式调控元件分析

目的：探讨呼吸道黏蛋白（mucin,MUC）5AC基因5'上游序列顺式调控元件在中性粒细胞弹力酶(neutrophil elastase , NE)诱导MUC5AC基因转录表达的调控机制。方法：应用DNA重组技术,构建含萤光素酶报告基因和MUC5AC启动子不同长度片段的嵌合质粒。采用定点突变技术,在嵌合质粒的基础上构建MUC5AC启动子区特殊蛋白（specificity protein）-1和核因子(nuclear factor, NF)-κB结合位点单独突变体,并测定NE刺激的转染细胞荧光素酶相对活性。结果：成功构建了4种含有不同长度MUC5AC基因启动子序列的荧光索酶报告基因质粒。含有启动子序列-1330bp、-689bp、-324bp的嵌合质粒荧光素酶相对光强度较对照组均显著增加,而含有启动子序列-64bp的嵌合质粒荧光素酶相对光强度与对照组相比差异无统计学意义。NE可诱导含有MUC5AC启动子区NF-кB结合位点单独突变体（pGL3E-MUC5AC-NF-кB-MU）荧光素酶相对光强度增加,而NE不能诱导Sp-l结合位点单独突变体（pGL3E-MUC5AC-SP-1-MU）荧光素酶表达增加。结论：MUC5AC 5'上游序列中-324～-64位点存在参与NE诱导MUC5AC基因表达的重要调控元件,位于此区域的顺式作用元件Sp-1位点在NE诱导MUC5AC基因表达机制中起重要作用,该位点可能作为靶向性基因治疗的关键调控元件。     

启动子荧光素酶报告系统检测低浓度过氧化氢激活神经肽PACAP特异受体PAC1-R启动子的作用

垂体腺苷酸环化酶激活多肽（pituitary adenylate cyclase activating polypeptide,PACAP）特异受体PAC1-R (PACAP receptor 1)是神经系统疾病药物开发的重要靶点。为了研究其表达的生物学机制,本研究克隆了PAC1-R基因转录起始位点上游从-2 500到+26的2 526 bp启动子片段,构建PAC1-R启动子驱动的荧光素酶基因报告载体pGL3-PAC1-Rp,并确证PAC1-R启动子荧光素酶报告系统在小鼠脑神经瘤细胞Neuro-2a和人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y中工作正常。运用此PAC1-R启动子荧光素酶报告系统,首次发现低浓度过氧化氢（hydrogen peroxide,H2O2）有效激活PAC1-R启动子,此作用可被转录因子特化蛋白1（specificity protein 1,SP1）抑制剂光神霉素A（mithramycin A）所抑制,提示SP1参与介导H2O2对PAC1-R启动子的激活作用。生物信息学分析显示,PAC1-R启动子含有多个SP1结合位点。PAC1-R启动子的荧光素酶报告系统的构建为深入探索PAC1-R高表达的作用与机制奠定了基础,低浓度H2O2对PAC1-R启动子激活作用的发现有助于深入诠释低浓度活性氧的生理学作用。     

Psoralidin,a coumestan analogue,as a novel potent estrogen receptor signaling molecule isolated from Psoralea corylifolia

A novel biological activity of psoralidin as an agonist for both estrogen receptor (ER)α and ERβ agonist has been demonstrated in our study. Psoralidin has been characterized as a full ER agonist, which activates the classical ER-signaling pathway in both ER-positive human breast and endometrial cell lines as well as non-human cultured cells transiently expressing either ERα or ERβ. The estrogenic activity was determined using the relative expression levels of either reporter or the endogenous genes dependent on the agonist-bound ER to the estrogen response element (ERE). Psoralidin at 10 μM was able to induce the maximum reporter gene expression corresponding to that of E₂-treated cells and such activation of the ERE-reporter gene by psoralidin was completely abolished by the cotreatment of a pure ER antagonist, implying that the biological activities of psoralidin are mediated by ER. Psoralidin was also able to induce the endogenous estrogen-responsive gene, pS2, in human breast cancer cells MCF-7. It was observed that activation of the classical ER-signaling pathway by psoralidin is mediated via induction of ER conformation by psoralidin and direct binding of the psoralidin–ER complex to the EREs present in the promoter region of estrogen-responsive genes, as shown by chromatin immunoprecipitation assay results. Finally, molecular docking of psoralidin to the ligand binding pocket of the ERα showed that psoralidin is able to mimic the binding interactions of E₂, and thus, it could act as an ER agonist in the cellular environment.     

p150Sal2 在人卵巢癌细胞株中促进MX1 基因的表达

目的:研究p150Sal2在人卵巢癌细胞株中对MX1基因表达的影响。方法:将MX1基因的启动子克隆至带有Luciferase报告基因的pGL3-basic载体中,将其与p150Sal2表达载体用PEI介导的转染方法共转染至卵巢癌细胞株SKOV3,用双荧光素酶检测系统检测MX1启动子活性变化;将p150Sal2表达载体转染至卵巢癌细胞株ES-2,用western blot检测细胞中MX1基因的表达变化。结果:双荧光素酶检测系统检测MX1启动子活性被p150Sal2上调,western blot检测转染p150Sal2后细胞中MX1表达量增加。结论:p150Sal2在人卵巢癌细胞株中促进MX1基因的表达。