草菇漆酶基因vv-lac1和vv-lac6的克隆及异源表达

【目的】克隆草菇漆酶基因vv-lac1和vv-lac6的全长cDNA,证实其编码的蛋白具有漆酶活性,最终建立草菇漆酶基因的异源表达及纯化体系。【方法】利用RACE技术克隆全长cDNA序列,并利用生物信息学技术进行序列分析,在此基础上,去除全长cDNA的编码信号肽的序列并在3'端添加His-tag碱基序列,把修饰后的cDNA片段克隆到表达载体pPIC9K上,并转化到毕赤酵母GS115中进行表达,对重组蛋白利用Ni柱进行分离纯化并以ABTS底物法检测重组蛋白的漆酶活性。【结果】vv-lac1和vv-lac6的全长cDNA的长度分别为1599 bp和1554 bp,且分别含有19和15个外显子;其编码的蛋白的理论分子量分别是57.3 kDa和56.3 kDa,理论等电点分别为4.73和5.62,且都属于分泌型的胞外蛋白;表达出的重组蛋白RBvvlac1和RBvvlac6,其分子量大小约为70 kDa,说明存在翻译后修饰;含有150 mmol/L咪唑的缓冲液对RBvvlac1和RBvvlac6发酵液进行洗脱所得到的蛋白溶液具有最高漆酶活性(333.17 U/L和227.63 U/L)。【结论】草菇漆酶基因vv-lac1和vv-lac6能够编码有活性的漆酶蛋白,本研究建立的异源表达及纯化体系适用于草菇或其它漆酶基因的异源表达与纯化。     

谷氨酸棒杆菌过氧化氢酶的异源表达、纯化以及酶学性质

过氧化氢酶能催化过氧化氢分解为水和氧气,在工业上有着较为广泛的应用。然而,纺织和造纸工业的特殊的高碱性环境,使得开发碱性过氧化氢酶有着重要的应用价值。利用大肠杆菌表达来自于谷氨酸棒杆菌的过氧化氢酶,对其表达条件进行了优化,并通过镍柱亲和层析的方法分离纯化重组蛋白,然后表征纯酶的酶学性质。最适表达条件为:诱导剂IPTG浓度0.2 mmol/L,诱导温度25℃,诱导时间11 h。过氧化氢酶比酶活达到55 266 U/mg,具有较高的催化活性。该酶具有相当宽泛的p H值适应范围,在p H 4.0–11.5范围内均具有较高的酶活性,并在p H 11.0条件下表现出最高的酶活性。将纯酶在p H 11.0的溶液中处理3 h时剩余酶活为93%,说明该酶在高碱条件下有良好的稳定性。该酶最适温度为30℃,在25–50℃热稳定性较好。其动力学参数Km为25.89mmol/L,Vmax为185.18mmol/(min?mg)。抑制剂十二烷基硫酸钠(SDS)、尿素、Na N3、β-巯基乙醇、EDTA对酶活有不同程度的抑制作用。来源于谷氨酸棒杆菌的过氧化氢酶具有较高的催化效率、良好的碱耐受性,在工业生产中有较好...     

真菌漆酶异源表达研究进展

由于漆酶能够氧化芳香类化合物和其它一些非芳香类有机物,具有广泛的底物特异性,因此在纸浆漂白、纺织品染料脱色、有毒废弃物的去除、生物修复和生物传感器等方面具有巨大的应用潜力。但是缺少大量廉价的酶源供应阻碍了漆酶商业化的应用,解决这个问题的一个主要方法就是通过漆酶的异源表达来获得大量的漆酶。综述了真菌漆酶在酵母表达系统和丝状真菌表达系统中表达的研究结果,着重总结了影响漆酶异源表达的因素和提高漆酶表达的策略。     

真核生物来源漆酶的异源表达研究进展

漆酶属于多铜氧化酶家族中的一种,广泛存在于昆虫、植物、真菌和细菌中。由于其作用的底物范围较广,因此在纺织、制浆、食品以及木质素的降解等方面有广阔的应用前景。但是自然界中的漆酶存在表达量和酶活低、高温易失活等问题,限制了它的应用。对漆酶进行大量高效的异源表达,是解决这一问题的有效途径。近年来,越来越多不同来源的漆酶基因被克隆,并在不同宿主中异源表达。但这些大多局限于实验室研究,还未达到工业化生产的水平。笔者对真核生物来源漆酶的异源表达研究进展进行综述,重点介绍了真核生物来源的漆酶在不同表达系统中的异源表达情况以及在酵母细胞中表达漆酶时提高表达量和酶活性能的方法,以期为研究者们提供参考。     

海藻酸裂解酶异源表达研究进展

海藻酸裂解酶是通过β-消除反应切断海藻酸分子中的糖苷键,产生非还原性端具有不饱和双键的糖的酶.通常作为制备海藻酸寡糖的工具酶,广泛应用于医疗、食品和生物质能源等领域的研究.介绍了海藻酸裂解酶异源表达的研究现状、存在的问题和发展的趋势.     

盐穗木过氧化氢酶基因的克隆与功能分析

利用同源基因克隆法,从新疆荒漠盐碱地多年生灌木盐穗木(Halostachys caspica)中克隆获得盐穗木过氧化氢酶基因(HcCAT1)。序列分析表明,HcCAT1基因开放阅读框为1 479 bp,编码492个氨基酸,推测编码蛋白质的分子量为56.7 kD,等电点为6.84。基因序列比对发现,HcCAT1与多种植物过氧化氢酶基因具有较高的同源性。半定量RT-PCR结果表明,HcCAT1基因受盐胁迫而上调表达。将构建的重组质粒pET32a-HcCAT1转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导重组蛋白His-HcCAT1的表达;SDS-PAGE和Western印迹检测显示,重组蛋白的分子量大小为77.7 kD,其大小与推测的大小一致;在低温诱导下以可溶性形式表达,且表现出一定的过氧化氢酶活性。盐胁迫实验结果显示,在添加400 mmol/L NaCl、400 mmol/L KCl以及300 mmol/L甘露醇的LB培养基中,重组质粒转化菌的生长情况和生长速率明显优于对照,表明HcCAT1可明显提高大肠杆菌的耐盐性。该研究结果将有助于从抗氧化角度认识盐生植物盐穗木的耐盐分子机理。     

盐地碱蓬过氧化氢酶基因的克隆及盐胁迫下的表达分析

过氧化氢酶是清除H2O2的重要酶类,从400mmol/LNaCl处理的盐地碱蓬（Suaeda salsa(L.)Pall)地上部分的cDNA文库中克隆了两个编码过氧化氢酶的cDNA(Sscat1和Sscat2)。其中Sscatl(1.7kb)是一个全长cDNA克隆,编码一个492个氨基酸的开放阅读框架。而Sscat2(1.1kb)是一个cDNA片段。据编码Sscatl3′端的287个氨基酸的cDNA序列与Sscat2的cDNA序列进行的BLAST同源性分析表明,Sscat1和Sscat2在核苷酸水平的一致性则为一个单拷贝基因。Northern杂交结果表明在盐胁迫条件下Sscat1和Sscat2的表达存在差异;400mmol/LNaCl处理48h的盐地碱蓬根中的Sscat1和Sscat2mRNA水平比对照显著提高,但是在叶中仅Sscat1受盐诱导表达,不同盐处理时间下的表达分析也证实。在盐地碱蓬叶中仅Sscat1受盐诱导表达。这说明Sscat1和Sscat2在盐地碱蓬中是差异调控的,生理分析表明过氧化氢酶的活性在盐胁迫条件下显著提高。     

THP基因的重新克隆及草菇表达载体的构建

草菇 (Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａｖｏｌｖａｃｅａ)是一种高温型的食用菌 ,在 4℃低温条件下 ,其菌丝自溶死亡 ,子实体发软、液化直至腐烂[1～ 3 ] 。草菇的这一特性严重地限制了草菇的生产、新鲜草菇的流通、低温冷冻保鲜和出口创汇以及草菇菌种的低温冷冻储藏。草菇是同宗结合的真菌 ,生活史复杂[4 ] ,菌丝没有锁状联合 ,杂种选择缺乏标记 ,这给草菇的杂交育种带来极大的困难[5,6] 。基因工程的发展为解决草菇不耐低温冷藏这一难题提供了可能。ＴＨＰ(ＴｈｅｒｍａｌＨｙｓｔｅｒｅｓｉｓＰｒｏｔｅｉｎ)基因—热滞后蛋白基因 ,是加拿大科学…     

嗜热蓝细菌碳酸酐酶基因的异源表达及酶学性质

【背景】碳酸酐酶(carbonic anhydrase,CAH)因其高效催化CO2转化为HCO3–的能力成为当今碳减排工艺中的研究热点,但因工厂烟道气的温度较高,因此寻求热稳定性高的嗜热碳酸酐酶是碳酸酐酶仿生学固碳的关键所在。【目的】克隆嗜热蓝细菌Thermosynechococcuselongatus PKUAC-SCTE542和SynechococcuslividusPCC6715的碳酸酐酶基因Ecah、Pcah,实现其在大肠杆菌细胞中异源高效表达,并进行初步酶学性质研究。【方法】利用PCR技术获得碳酸酐酶基因cah,构建重组基因工程菌BL21_pETM11_CAH,利用IPTG诱导方法高效表达蛋白,表达产物(CAH)经Ni-Agarose亲和层析柱纯化后,进行酶学性质研究。【结果】从E542、PCC6715中克隆得到大小均为534 bp的碳酸酐酶基因,以CO2为底物,酶催化CO2水合的活性分别为42.6 WAU/mg-protein、47.6 WAU/mg-protein。碳酸酐酶ECAH 50°C处理30 min后,酶活提高了8%,而PC...     

普鲁兰酶的异源表达、结构解析及分子改造研究进展

淀粉是由葡萄糖单元通过α-1,4-葡萄糖苷键和α-1,6-葡萄糖苷键连接而成,不仅是食物的主要成分,也是淀粉深加工工业的基本原料来源。普鲁兰酶能够高效水解淀粉分子中的α-1,6-葡萄糖苷键,与其他的淀粉加工酶复合使用,能够有效提高淀粉的利用率,在淀粉深加工工业中具有“提质增效”的重要作用。本文综述了普鲁兰酶产酶菌株的筛选及编码基因的克隆表达,总结了表达元件及发酵条件优化对普鲁兰酶产酶水平的影响,探讨了普鲁兰酶结构解析及分子改造等方面的研究进展。同时分析了当前研究中存在的问题,并对未来的研究进行了展望,以期为普鲁兰酶的研究及应用提供参考和启示。     

草菇乙酰木聚糖酯酶的生物信息学分析

以草菇（Volvariella volvacea）乙酰木聚糖酯酶AXE、AXEII为研究对象,采用生物信息学方法对其核苷酸及编码的蛋白氨基酸序列、组成成分、信号肽、跨膜结构域、疏水性/亲水性、蛋白质三级结构等进行预测和分析,并构建了乙酰木聚糖酯酶蛋白家族的系统进化树。结果表明,草菇的AXE蛋白由349个氨基酸残基组成,编码蛋白质的分子量为37.55 ku,等电点为8.58,属稳定性蛋白质。AXEII由253个氨基酸残基组成,编码蛋白质的分子量为27.70 ku,等电点为5.82,属稳定性蛋白质。两者均为亲水性蛋白,存在信号肽,AXE与AXEII的潜在磷酸化位点总数分别为15个和11个。草菇的AXE与灰盖鬼伞（Coprinopsis cinerea）亲缘关系较近,AXEII与裂褶菌（Schizophyllum commune）亲缘关系较近。     

草菇热激蛋白60基因(Vvhsp60)生物信息学分析及低温下的表达

【背景】生物受到温度胁迫时,热激蛋白被诱导并在短时间内大量产生,可以使受损的蛋白质恢复正常构象,增强生物对逆境胁迫的耐受性。【目的】初步探究草菇热激蛋白60(Vvhsp60)与低温耐受性的关系,为深入开展草菇不耐低温特性的遗传改良奠定理论基础。【方法】对Vvhsp60进行生物信息学分析,以低温敏感型草菇菌株V23及耐低温菌株VH3为实验材料,利用实时荧光定量PCR技术分析低温胁迫及热激诱导后在低温下草菇菌丝体中Vvhsp60基因的表达水平。【结果】草菇Vvhsp60编码蛋白不存在信号肽,不属于分泌蛋白,在线粒体和细胞质内发挥生物学作用,属于双向跨膜蛋白。低温处理显著提高了V23与VH3菌丝体中Vvhsp60基因的表达量,而且VH3中的表达量显著高于V23,推测Vvhsp60基因的表达量高可能有助于增强草菇对低温胁迫的耐受性。经热激处理后两菌株Vvhsp60基因的表达量显著高于各自未热激处理的对照组,表明热激处理可诱导Vvhsp60基因的表达。【结论】Vvhsp60与草菇低温耐受性相关,并且热激可以诱导Vvhsp60基因的表达。     

五种矿质元素对草菇菌丝生长和活性氧清除能力的影响

【背景】菌种退化是草菇生产中面临的难题,探究一种简单高效的复壮方法是草菇产业亟须解决的问题。【目的】探讨外源添加5种矿质元素对草菇退化菌株的菌丝性状和活性氧(reactive oxygen species, ROS)清除能力的影响。【方法】筛选出5种矿质元素的最佳浓度并添加于PDA培养基中,测定草菇菌落形态、菌丝生长速度、菌丝生物量、ROS含量、抗氧化酶活性及抗氧化物质含量。【结果】MnSO4、Na2SeO3、CaSO4、FeSO4可有效提高草菇退化菌株D1和D2的菌丝生长速度和生物量;降低O2·-、H2O2等ROS的含量,并增加还原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)、氧化型谷胱甘肽(glutathionedisulfide,GSSG)的含量及超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase, CAT)、谷胱甘肽...     

BmSPI38同型串联多聚体在大肠杆菌中的表达和抗真菌活性

本研究旨在通过蛋白质工程手段获得结构均一性更好、活性更高、抗真菌能力更强的家蚕蛋白酶抑制剂BmSPI38的串联多聚体蛋白。利用原核表达技术获得BmSPI38串联多聚体蛋白,并通过蛋白酶抑制剂胶内活性染色、蛋白酶抑制实验和真菌生长抑制实验等探讨串联多聚体化对BmSPI38的结构均一性、抑制活性和抗真菌能力的影响。活性染色结果表明,基于多肽柔性接头的串联表达能够极大提高BmSPI38蛋白的结构均一性。蛋白酶抑制实验表明,基于接头的串联三聚体化和四聚体化能提高BmSPI38对微生物蛋白酶的抑制能力。孢子萌发实验表明,His₆-SPI38L-tetramer对球孢白僵菌（Beauveria bassiana）分生孢子萌发的抑制能力显著强于His₆-SPI38-monomer。真菌生长抑制实验显示,能够通过串联多聚体化来增强BmSPI38对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和白色念珠菌（Candida albicans）的抑制能力。本研究成功实现BmSPI38的串联多聚体在大肠杆菌中的异源活性表达,并证实可通过串联多聚体化来增强BmSPI38的结构均一性和抗真菌能力,不仅可为培育抗真菌转基因家蚕提供重要的理论依据和新策略,还将推动BmSPI38的外源生产及在医疗领域的应用。     

天蓝色链霉菌孢子色素whiE在大肠杆菌中的异源生物合成

【目的】在大肠杆菌中完整重构孢子色素whiE的生物合成途径,分离纯化表达体系中合成的新化合物,并解析whiE的生物合成途径。【方法】构建whiE-ORFII、whiE-ORFVII和whiE-ORFI的单基因重组质粒,SDS-PAGE检测蛋白表达情况;借助Xba I与Spe I互为同尾酶的特性,实现多基因组合串联;构建好的重组质粒再导入大肠杆菌菌株BAP1中进行异源表达,并用高效液相色谱(HPLC)检测发酵产物;依次使用正相硅胶柱和反向半制备柱分离发酵产物,四级杆飞行时间质谱仪(Q-TOFMS)鉴定发酵产物分子量。【结果】whiE-ORFII、whiE-ORFVII和whiE-ORFI均获得可溶性表达;这3个基因单个串联到菌株BTw95中均未检测到新的产物生成;而whiE-ORFII和whiE-ORFVII、 whiE-ORFI和whiE-ORFVII双基因组合以及三基因组合串联到BTw95中可检测得到两种化合物ZYC-1和ZYC-2。在负离子模式下进行Q-TOFMS检测,ZYC-1的[M-H]-为419.0748,推测分子式为C_(23)H_(16)O_8;ZYC-2的[M-H]-为465.0743,推测分子式为C_(24)H_(18)O_(10)。【结论】本研究推进了孢子色素whiE生物合成途径在大肠杆菌中的异源重构,分离鉴定了2个十二酮II型聚酮化合物,并推测了孢子色素whiE的生物合成途径。     

致犊牛脑膜炎大肠杆菌新疆分离株ibeB基因的特性分析北大核心CSCD

【目的】分析致犊牛脑膜炎大肠杆菌分离株ibeB基因的分子生物学信息。【方法】以自脑炎死亡犊牛脑组织、肝组织分离鉴定的O161-K99-STa致病性大肠杆菌牛-EN株和牛-EG分离株为材料。根据GenBank中公布的脑膜炎大肠杆菌K1株RS218 ibeB基因序列设计1对引物,采用PCR方法,从分离株中成功克隆ibe B基因,比较分离株ibeB基因与不同来源大肠杆菌ibeB基因的部分生物信息学特性。【结果】分离株ibeB基因序列全长1500 bp,包含1371 bp开放阅读框,共编码457个氨基酸;生物信息学分析显示,牛-EN株与致人脑膜炎大肠杆菌K1 RS218的核苷酸和氨基酸同源性分别为90.5%和96.9%,牛-EG株与大肠杆菌K12的核苷酸和氨基酸同源性分别为99.4%和100.0%;ibeB蛋白为亲水性蛋白,分子质量为50.26 kDa,理论等电点为6.05;该蛋白无跨膜区,但具有信号肽序列;亚细胞定位显示,分泌信号通路位点(SP)占比例为0.939,说明该蛋白属于分泌型蛋白。【结论】从致脑膜炎大肠杆菌分离株中成功克隆ibeB基因,该基因与致人脑膜炎大肠杆菌K1 RS218 ibeB基因有较高的同源性,均有相似的生物学特性,属肠外致病性大肠杆菌。     

血管内皮生长因子单链抗体在大肠埃希菌中的高效表达

以血管内皮生长因子单链抗体(pTA-anti-VEGF-scFv)为研究对象,考察不同培养基配方和培养条件对血管内皮生长因子单链抗体表达量的影响。经均匀设计试验,确定工程菌R22-4高效表达重组抗体的最佳培养基为以2×YT培养基为基础,添加质量分数为0.3%葡萄糖、1.0%酪蛋白胨、0.4%玉米浆、0.133%KH_2PO_4、0.159 6%K_2HPO_4、0.532%NaCl、0.01%微量元素、0.04%维生素B_1;诱导条件为30℃、0.1 mmol/L IPTG(异丙基硫代半乳糖苷,Isopropylβ-D-Thiogalactoside)诱导5 h。经ELISA (酶联免疫吸附测定,enzyme linked immunosorbent assay)检测,血管内皮生长因子单链抗体的表达量是原始对照组的2.27倍,实现了血管内皮生长因子单链抗体在大肠埃希菌中的高效表达。     

米曲霉（Aspergillus oryzae）果胶酸内切水解酶（PGA）在原核系统中重组表达

果胶酶具有广阔的商业用途,在食品工业上主要用于果汁和酒类的澄清、提高植物油的提取率、提高水果的硬度和植物纤维脱胶。米曲霉（Aspergillus oryzae）一直用于传统发酵食品的生产,自然条件下其果胶酶的产量较低。文献报道的果胶酶的重组表达成功的例子较少,且活性较低。通过RT-PCR 的方法,获得不含信号肽的果胶酸内切水解酶A(polygalacturonase A, PGA) 的cDNA,PGA cDNA 连入pET-28a (+)载体, 构建 pET-28a (+)-pga 质粒。pET-28a (+)-pga 转化Turner (DE3) placⅠ细胞,得到转化子pET-28a (+)-pga-Turner (DE3) placⅠ,首次实现了米曲霉PGA在大肠杆菌系统中过表达,进一步对PGA在大肠杆菌系统中表达的条件进行了研究。在37℃、220 r/min条件培养pET-28a (+)-pga-Turner (DE3) placⅠ细胞,OD₆₀₀至 0.8左右时,用500μmol/L isopropyl β-D-thiogalactogalactopyranoside (IPTG)进行诱导表达,在15℃和170r/min条件下继续培养24 h,表达效果最好,相对于每毫升培养基而言,产酶可达到70u/mL,是米曲霉自然条件产酶量的87.5倍,远优于文献报道的重组表达的PGA酶活     

米曲霉（Aspergillus oryzae）果胶酸内切水解酶（PGA）在原核系统中重组表达

果胶酶具有广阔的商业用途,在食品工业上主要用于果汁和酒类的澄清、提高植物油的提取率、提高水果的硬度和植物纤维脱胶。米曲霉（Aspergillus oryzae）一直用于传统发酵食品的生产,自然条件下其果胶酶的产量较低。文献报道的果胶酶的重组表达成功的例子较少,且活性较低。通过RT-PCR 的方法,获得不含信号肽的果胶酸内切水解酶A(polygalacturonase A, PGA) 的cDNA,PGA cDNA 连入pET-28a (+)载体, 构建 pET-28a (+)-pga 质粒。pET-28a (+)-pga 转化Turner (DE3) placⅠ细胞,得到转化子pET-28a (+)-pga-Turner (DE3) placⅠ,首次实现了米曲霉PGA在大肠杆菌系统中过表达,进一步对PGA在大肠杆菌系统中表达的条件进行了研究。在37℃、220 r/min条件培养pET-28a (+)-pga-Turner (DE3) placⅠ细胞,OD₆₀₀至 0.8左右时,用500μmol/L isopropyl β-D-thiogalactogalactopyranoside (IPTG)进行诱导表达,在15℃和170r/min条件下继续培养24 h,表达效果最好,相对于每毫升培养基而言,产酶可达到70u/mL,是米曲霉自然条件产酶量的87.5倍,远优于文献报道的重组表达的PGA酶活