浓香型白酒窖泥微生物群落结构及其选育应用研究进展

窖池发酵是浓香型白酒酿造的工艺特征。窖泥是酒体生香功能微生物的繁殖载体,窖泥微生物对浓香型白酒风味的形成具有重要作用。近年来,我国学者对窖泥微生物展开了一系列理论和实践研究,取得了丰富的研究成果。本文结合文献资料和本课题组研究工作,介绍了窖泥微生物群落结构的多样性及演替、群落结构与窖泥质量的关系、窖泥微生物选育及应用等方面的研究进展,并针对研究存在的问题提出未来研究方向:系统开展窖泥微生物群落结构的差异化研究;进一步发掘窖泥微生物资源,提升功能微生物的应用潜力;深入研究窖泥培养菌剂的作用机理,实现品质控制。     

洋河酒窖泥细菌群落结构与菌株产酸能力分析

【背景】窖泥微生物的种类及其代谢产物类型是影响浓香型白酒发酵过程中丁酸和己酸等白酒中主要有机酸合成的影响因素之一。【目的】揭示浓香型白酒不同窖龄窖泥细菌群落结构,研究厌氧细菌产酸性能,阐明窖泥细菌与白酒中有机酸合成的相关性。【方法】通过Illumina HiSeq高通量测序,基于16S rRNA基因序列分析不同窖龄窖泥细菌的组成。分离获得厌氧细菌,通过比较菌株产丁酸和己酸能力来分析窖泥的微生物代谢特性。【结果】洋河酒窖泥细菌主要分布于梭菌纲(Clostridia)、拟杆菌纲(Bacteroidia)、互营养菌纲(Synergistia)和芽孢杆菌纲(Bacilli)。20年窖龄的窖泥中氢孢菌属(Hydrogenispora)和瘤胃梭菌属(Ruminiclostridium)丰度显著增加。窖泥细菌间相关性分析表明,瘤胃梭菌属(Ruminiclostridium)为窖泥中影响最大的核心微生物,很多微生物与梭菌属(Clostridium)菌株之间多为相互促进关系。通过传统可培养方法共分离得到梭菌目(Clostridiales)的20株厌氧菌。其中梭菌属(Clostridium)菌株产酸能力高于其他菌属,酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)和丁酸梭菌(Clostridium butyricum)产丁酸和己酸的能力最强。产丁酸能力最高的菌主要分离自5年和20年窖龄窖泥,产己酸能力最高的菌分离自20年窖龄窖泥。【结论】解析了浓香型白酒不同窖龄窖泥的细菌组成,并对菌株产丁酸和己酸的能力进行了比较,为揭示窖泥微生物功能及其对白酒风味物质合成的影响奠定了相关的研究基础。     

厌氧产酸菌群培养技术在窖泥质量快速检测中的应用

【背景】窖泥质量决定了浓香型白酒品质的高低,窖泥中的产酸功能菌群显著影响着窖泥的质量及对应的浓香型白酒品质,但目前对窖泥质量的评价尚缺乏明确和完善的标准。【目的】建立一种快速、准确评价窖泥质量的方法,解析窖泥中参与己酸合成的重要微生物。【方法】通过窖泥产酸菌群培养和产酸代谢特征研究,构建厌氧产酸菌群发酵体系,根据窖泥中厌氧菌的己酸合成能力来评价相应窖泥的质量;利用高通量测序技术分析可培养发酵体系中产己酸功能微生物的群落组成。【结果】葡萄糖碳源相比乳酸碳源可以更有效地富集窖泥中的产己酸菌群;采用毫升级别发酵体系、对窖底泥进行多点取样,产酸菌群发酵代谢产物稳定期的己酸产量、己酸/丁酸值可较准确地评价不同窖泥的质量。16S rRNA基因测序结果表明,利用产酸菌群培养方法可以有效地富集未培养产己酸细菌(Uncultured bacterium Caproiciproducens)。【结论】基于产酸菌群培养的窖泥微生物发酵体系可用于实际生产中快速、准确地评价窖泥质量,并为窖泥微生物己酸合成代谢机制的研究提供参考。     

浓香型白酒糟醅及窖泥产香功能菌的研究进展

浓香型白酒主要香气物为己酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸乙酯和丁酸乙酯四大酯类,白酒微生物发酵过程中酯类合成主要是酸与醇在酯化酶的作用下产生,因此产香功能菌包括香气及其前体物产生菌和酯化酶产生菌.本文综述了浓香型白酒糟醅及窖泥主要产香功能菌的来源、组成、鉴定方法、功能特性、相互关系及其在浓香型白酒生产过程中的应用等方面的研究进展,旨为浓香型白酒重要微生物的研究提供思路,为其发酵过程控制提供理论依据.     

浓香型白酒两个产区窖泥微生物群落结构分析

【目的】探索浓香型白酒两个典型产区窖泥微生物群落结构和多样性,分析窖泥微生物群落地域特征及对白酒风格形成的影响。【方法】分别提取四川和安徽两个产区窖泥样品总DNA,应用PCR-ARDRA和16S rRNA基因克隆测序技术对两个产区窖泥细菌和古菌进行研究。【结果】两个浓香型白酒产区窖泥细菌丰富,包括:厚壁菌门(Firmicute)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、互养菌门(Synergistetes)、Armatimonadetes类群和未分类细菌(Unclassified bacteria)。两个产区窖泥绝对优势种群均为厚壁菌门中梭菌纲(Clostridia)细菌,在四川产区窖泥中检出较多的互营单胞菌属(Synthrophomonas)和紫单胞菌属(Petrimonas)。古菌的群落组成较为简单,主要是甲烷囊菌属(Methanoculleus)、甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)、甲烷鬃菌属(Methanosaeta)和甲烷杆菌属(Methanobacterium)4个产甲烷古菌类群,四川产区窖泥优势古菌为甲烷囊菌和甲烷八叠球菌,安徽产区则为甲烷八叠球菌属和甲烷鬃菌。【结论】四川和安徽两个产区窖泥微生物的16S rRNA基因克隆文库系统地反映了两者微生物群落的相似性和差异性,对揭示浓香型白酒两个产区的酒体风格差异形成有一定的参考价值。     

浓香型白酒发酵过程中窖内古菌群落分布特征

泥窖池多菌种固态发酵是浓香型白酒的典型特点,其中古菌是重要的酿造功能菌,但目前对发酵过程古菌的群落分布及多样性尚缺乏研究。采用高通量测序技术,分析了浓香型白酒发酵过程酒醅与窖泥中古菌的生物量、群落组成与演替规律,并通过共现性网络分析了古菌与细菌的潜在互作关系。结果表明,窖泥中古菌平均生物量约是酒醅的200倍,两者之间古菌群落的结构差异不显著 (r=0.017,P=0.074),但演替规律存在显著相关性 (r=0.30,P=0.03)。甲烷杆菌属 Methanobacterium 是酒醅与窖泥中丰度占比最高的古菌,其他优势群类依次为甲烷八叠球菌属 Methanosarcina、甲烷粒菌属 Methanocorpusculum、甲烷囊菌属 Methanoculleus 和甲烷短杆菌属 Methanobrevibacter。共现性网络分析显示甲烷杆菌属在酒醅与窖泥中与多数细菌为正相关,特别是与窖泥中主要细菌氢孢菌属Hydrogenispora 和产己酸菌属 Caproiciproducens。研究结果揭示了浓香型白酒窖池中古菌群落的时空分布特点及潜在功能。     

基于窖泥微生物相对定量与绝对定量联用的窖泥老熟特征分析

[目的] 基于传统的相对定量法,在总DNA提取过程中加入内标菌,探索不同老熟程度下窖泥微生物菌群组成特征。[方法] 通过添加外源菌丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）作为内标菌,利用16S rRNA基因扩增子测序技术,基于相对丰度与绝对丰度解析不同老熟程度窖泥内的菌群结构和理化差异。[结果] 相对定量分析表明,随着窖泥老熟,窖泥微生物群落的多样性增加,己酸菌属（Caproiciproducens）、甲烷杆菌属（Methanobacterium）、甲烷八叠球菌属（Methanosarcina）和互营单胞菌属（Syntrophomonas）等菌的相对丰度显著增高。结合绝对丰度分析,老熟窖泥内的生物量分别是新窖泥与趋老熟窖泥的600倍与28倍。不同于相对定量分析,乳杆菌属（Lactobacillus）的绝对丰度在老熟窖泥内并未降低,为新窖泥的20倍。己酸菌属在老窖泥中的绝对丰度为新窖泥的25000倍;其他功能微生物包括甲烷杆菌属、甲烷八叠球菌属、甲烷短杆菌属（Methanobrevibacter）、互营单胞菌属的绝对丰度也随着窖龄的增加而显著增加。菌群结构的绝对定量动态分析表明,新窖泥转变为老熟窖泥的过程是一个菌群组成多样性不断提高、生物量也逐步增加的过程,老窖泥中己酸菌属、互营单胞菌属、多种甲烷菌等微生物绝对量的增加,推测对降低窖泥内的乳酸含量和形成窖泥稳态环境具有重要作用。[结论] 绝对定量方法的引入,可观测不同窖龄窖泥微生物生物量的差异,解析不同老熟阶段窖泥功能微生物绝对丰度的动态变化,为窖泥菌群结构和代谢功能的定量化和因果关系研究提供了新的策略。     

浓香型白酒窖泥中兼性厌氧细菌的分离鉴定

为探讨浓香型白酒窖泥中微生物区系的构成,采用传统微生物分类鉴定法,对泸州老窖不同窖龄窖底和窖壁泥样的可培养兼性厌氧细菌进行了分类计数,并初步鉴定到属。平板涂布法计数得出,老窖底样的菌落总数最多,达3.98×103cfu/g泥,新窖壁样菌落数最少,只有0.24×103cfu/g泥;经生理生化鉴定,参照伯杰氏细菌鉴定手册等将划线单离后的菌株归为8个属,其大部分属于芽孢杆菌属(Bacillus)和芽孢乳杆菌属(Sporolac-tobacillus),也存在假单胞菌属(Pseudomonas)、梭菌属(Clostridium)等。     

不同时期窖泥理化因子、风味物质和细菌组成的相关性

[背景]窖泥品质是影响浓香型白酒质量的重要因素之一,窖泥的理化特性、微生物群落结构和风味物质等与窖泥的品质有关.[目的]揭示不同时空浓香型白酒窖泥理化因子、细菌群落结构和挥发性风味物质三者之间的关系.[方法]比较演替期(10年)和成熟期(30年)的窖泥理化因子,利用顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用分析窖泥中挥发性风味物...     

基于高通量测序技术解析浓香型白酒中窖泥臭味物质4-甲基苯酚的来源

【目的】研究浓香型白酒中主要窖泥臭味物质4-甲基苯酚的原料来源;解析窖泥菌群结构,从中分离得到产4-甲基苯酚的菌株,以明确4-甲基苯酚的微生物来源。【方法】运用气相色谱-质谱连用(GC-MS)技术对窖泥、糖化料和大曲中的4-甲基苯酚定性定量;运用高通量测序技术解析窖泥的菌群结构,并通过可培养技术从中筛选产4-甲基苯酚的微生物。【结果】糖化料和曲粉中4-甲基苯酚含量均低于检测限。窖泥中检测到4-甲基苯酚,其中窖底窖泥4-甲基苯酚含量达到24.24μg/g。测定的窖泥菌群主要包括8个纲,其中Bacteroidia、Clostridia和Methanobacteria在上中底部窖泥中含量均高于8%,为主要优势纲。窖泥中含量在1%的属有11个,主要包括Clostridium、Aminobacterium、Methanobacterium、Methanobrevibacter等。经过分离筛选,窖泥中的Clostridium aminovalericum、Clostridium ultunense和Clostridium purinilyticum可产4-甲基苯酚,与窖泥高通量测序结果比对显示,含量都在0.20%以上。【结论】4-甲基苯酚主要来源于窖泥,窖泥微生物可代谢产生4-甲基苯酚。窖泥菌群结构复杂,窖池不同深度的菌群结构并不一致,其中Clostridia及Clostridium与4-甲基苯酚的变化规律相似,含量随深度增加而升高。从窖泥中筛选得到3株产4-甲基苯酚的菌株,3株菌都属于Clostridium。Clostridium在窖泥中的含量达到4.89%,其中筛选得到的3株菌在窖泥中的总含量接近1%,综上得出Clostridium是4-甲基苯酚的主要微生物来源。     

浓香型白酒窖泥放线菌的群落结构及其多样性

以泸州老窖1、50、100和400年窖泥为研究对象,采用变性梯度凝胶电泳(DGGE)研究浓香型白酒窖泥放线菌的群落结构及其多样性。DGGE图谱显示,除1年样品外,其余窖底泥多样性指数(H)均低于同窖龄窖壁泥,但均匀度指数(EH)较高。不同窖池相同部位窖泥的群落结构变化趋势为:随窖龄的延长,窖壁泥H值逐渐上升,为1.74—2.28;窖底泥下降,为1.73—2.07。EH值均为波动下降,分别在0.986—0.991和0.971—0.994之间。窖底泥相似性系数(SC)逐渐上升,为0.46—0.82;窖壁泥为0.31—0.62。DGGE条带测序结果显示,窖泥放线菌归于Olsenella、Atopobium、Streptomyces和Corynebacterium 4个属。Olsenella和Atopobium属为共有的优势属,且在窖壁泥中的优势度(di)均随窖龄延长而降低,在窖底泥中升高。实验结果表明,浓香型白酒窖泥蕴藏着丰富的放线菌资源,群落结构和多样性存在差异,菌群演替呈现一定规律性。     

Prokaryotic Communities in Pit Mud from Different-Aged Cellars Used for the Production of Chinese Strong-Flavored Liquor

Chinese strong-flavored liquor (CSFL) accounts for more than 70% of all Chinese liquor production. Microbes in pit mud play key roles in the fermentation cellar for the CSFL production. However, microbial diversity, community structure, and cellar-age-related changes in pit mud are poorly understood. Here, we investigated the prokaryotic community structure and diversity in pit-mud samples with different cellar ages (1, 10, 25, and 50 years) using the pyrosequencing technique. Results indicated that prokaryotic diversity increased with cellar age until the age reached 25 years and that prokaryotic community structure changed significantly between three cellar ages (1, 10, and 25 years). Significant correlations between prokaryotic communities and environmental variables (pH, NH₄⁺, lactic acid, butyric acid, and caproic acid) were observed. Overall, our study results suggested that the long-term brewing operation shapes unique prokaryotic community structure and diversity as well as pit-mud chemistry. We have proposed a three-phase model to characterize the changes of pit-mud prokaryotic communities. (i) Phase I is an initial domestication period. Pit mud is characterized by abundant Lactobacillus and high lactic acid and low pH levels. (ii) Phase II is a transition period. While Lactobacillus abundance decreases dramatically, that of Bacteroidetes and methanogens increases. (iii) Phase III is a relative mature period. The prokaryotic community shows the highest diversity and capability to produce more caproic acid as a precursor for synthesis of ethyl caproate, the main flavor component in CSFL. This research provides scientific evidence to support the practical experience that old fermentation cellars produce high-quality liquor.     

泸型酒窖泥中梭菌的分离及代谢产物分析

[目的] 分离窖泥中的梭菌微生物并对其代谢产物进行评估。[方法] 对窖泥中梭菌群落的16S rRNA基因进行高通量测序;利用高丰度的梭菌OTU序列在KOMODO数据库进行培养基的预测,定向分离窖泥中梭菌菌株;采用顶空固相微萃取结合气相色谱质谱联用仪对窖泥和代表性梭菌菌株的挥发性代谢产物进行检测。[结果] 利用KOMODO数据库预测的梭菌培养基共计筛选到31株梭菌微生物,分属于梭菌属的14个种;根据风味代谢特性,这些菌株主要分为两大类,一是C.carboxidivorans、C.sporogenes和C.tyrobutyricum等产酸为主的梭菌,二是C.beijerinckii、C.butyricum和C.sphenoides等产醇为主的梭菌。[结论] 利用测序序列预测培养基有助于从窖泥中分离获得丰富的梭菌菌株,其物种和代谢能力的多样性对解析白酒复杂风味形成机理奠定了一定的基础。     

酱香型白酒发酵中地衣芽孢杆菌与酿酒酵母的相互作用

【目的】为解析酱香型白酒酿造群体微生物的发酵过程, 研究了酱香型白酒酿造中重要微生物地衣芽孢杆菌与酿酒酵母之间的相互作用, 并对它们之间的作用机制进行初步探讨。【方法】通过地衣芽孢杆菌与酿酒酵母共培养体系的构建, 认识了两者的相互作用, 初步分析了酿酒酵母产生抑制物的分子量, 耐热性及对蛋白酶敏感性等特性。【结果】研究表明, 酿酒酵母发酵造成的酸性环境以及某些代谢物质能够抑制地衣芽孢杆菌的生长, 这些物质分子量大于10 kD, 对热和蛋白酶敏感。【结论】白酒酿造中酿酒酵母通过产酸以及大分子的蛋白质类物质对地衣芽孢杆菌生长形成抑制, 该研究促进了对白酒酿造群体微生物发酵过程的解析。     

浓香型白酒窖池微生物群落结构特征

窖池是中国白酒,尤其是浓香型大曲酒生产颇具特色的固态生物反应器,窖龄与微生物群落结构关系密切且复杂,对产品质量影响非常显著.本研究以微生物细胞膜的特征组分磷酸脂肪酸(PLFA)为指标,研究了不同窖龄(5年、100年和300 年)窖池窖泥、糟醅和黄水的微生物群落结构特征.结果表明:窖泥中总PLFA含量最高,糟醅次之,黄水最低.PLFA的组成因窖龄而异,黄水中总PLFA含量随窖池窖龄的增长而减小.窖泥中直链饱和脂肪酸含量最高,为PLFA总量的50.7%～73.9%,其中300年窖池窖泥最高.窖泥中表征革兰氏阳性(G+)厌氧细菌的PLFA含量较高,而糟醅和黄水中均以表征革兰氏阴性(G-)厌氧菌的PLFA含量较高.100年窖泥中表征G+菌、G-菌和厌氧菌的PLFA含量高于其他窖龄相应样品.5年窖窖泥、糟醅和黄水中真菌PLFA含量均高于其他窖龄相应样品.经主成分分析,5年窖和100年窖中主要变异菌群是G+菌和真菌,300年窖中主要变异菌群是细菌.描述窖池微生物群落特征的多样性指数可以选用PLFA的频次、Simpson优势度指数和Shannon多样性指数.     

酱香型白酒发酵中两株主要乳酸菌对酿造微生物群体的影响

【目的】研究从酱香型白酒发酵酒醅中分离得到的2株主要乳酸菌Lactobacillus homohiochii XJ-L1和Lactobacillus buchneri XJ-L2对酱香型白酒发酵中酿造微生物群体的作用,并探索该种相互作用对酱香型白酒品质的影响。【方法】结合抑菌实验和组合发酵实验研究L. homohiochii XJ-L1和L. buchneri XJ-L2对酿造微生物群体生长的影响,通过对纯培养和共培养体系中代谢物的比较,研究2株优势乳酸菌对主要酿造酵母风味相关代谢产物的影响。【结果】L. buchneri XJ-L2能够抑制3株芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens XJ-B1,Bacillus subtilis XJ-B2,Bacillus licheniformis XJ-B3)、5株霉菌(Aspergillus oryzae XJ-M1,Aspergillus niger XJ-M2,Aspergillus flavus XJ-M3,Aspergillus albicans XJ-M4,Rhizopus oryzae XJ-M5)、2株酵母(Schizosaccharomyces pombe XJ-Y4,Geotrichum candidum XJ-Y5)的生长;L. homohiochii XJ-L1和L. buchneri XJ-L2能够促进3株主要酵母(Saccharomyces cerevisiae XJ-Y1,Zygosaccharomyces bailii XJ-Y2,Pichia galeiformis XJ-Y3)的生长,同时促进其酸类、醇类、酯类等风味物质的代谢。【结论】L. homohiochii XJ-L1和L. buchneri XJ-L2可促进3株主要酵母的生长代谢,同时L. buchneri XJ-L2明显抑制细菌、霉菌和少数酵母的生长,以此促进和维持主要酵母在酱香型白酒发酵过程中的生态地位,从而影响酒中酸类、醇类、酯类等风味物质的形成,保证酱香型白酒的品质。因此,适当比例的乳酸菌对维持酿造微生物区系平衡,生产典型酱香品质白酒具有重要意义。