露花叶片PEP羧化酶的纯化及某些分子特性

经硫酸铵分部沉淀,DEAE-纤维素(DE52),DEAE-Sephadex A-50,SephacrylS-200和二次羟基磷灰石等柱层析,从露花叶片中分离得到纯化63.9倍、电泳均一的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。此酶的天然分子量经聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳测定为260kD,经SephadexG-200凝胶过滤法测定为240kD。用SDS-聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳测得酶的亚基分子量为115kD,表明此酶是个二同聚体。此酶的等电点为PI=5.6。免疫双扩散的结果表明此酶与高梁PEPG的抗原决定簇呈部分同一性。     

河西走廊芦苇在不同盐渍生境中RuBP羧化酶的比较研究

对不同盐渍生境中芦苇的ＲｕＢＰ羧化酶结构的研究表明,不同类型芦苇的ＲｕＢＰ羧化酶大、小亚基分子量相同,但盐化草甸芦苇和过渡地带芦苇与沼泽芦苇相比,ＲｕＢＰ羧化酶的亲水氨基酸相对含量增加,疏水氨基酸相对含量降低,酶分子被ＰＣＭＢ滴定的ＳＨ基数亦显著减少．表明芦苇的ＲｕＢＰ羧化酶结构发生了变化,反映出该酶有基因表达的环境适应．     

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶cDNA在T7 RNA多聚酶/启动子系统中专一性表达的研究

用PT7和pGP1—2质粒偶联表达系统,通过温度诱导(30～42℃),使温度敏感基因CI875失活;加入利福霉素选择性抑制E.coliRNA多聚酶的表达,从而使外源PEP羧化酶cDNA得到专一性的表达。产物经SDS—PAGE和Wesern杂交分析,表明该系统表达出两条PEP羧化酶带,分子量分别是78kD和80kD。     

ATP对菠菜二磷酸核酮糖羧化酶的热稳定作用

纯化的菠菜RuBP羧化酶有热易变性。加入ATP对RuBP羧化酶的热失活有明显的保护作用。如同时加入DTT则可进一步提高ATP对酶的热稳定作用。此外,ADP,AMP和无机磷也有热稳定作用,但效果比ATP差。照光叶子的ATP含量比暗处理的叶子高一倍,而其RuBP羧化酶粗提液在60℃保温后的酶蛋白含量及酶活力分别比暗处理的高3至7倍。如果在暗处理的RuBP羧化酶粗提液中加入外源ATP时,则酶的热稳定性可达到光处理的86％。     

膜荚黄芪种子中2种几丁质酶的分离纯化及活性测定

运用传统的层析技术对膜荚黄芪种子中两种几丁质酶进行分离纯化,并对分离纯化中各个步骤得到的蛋白进行了活性研究.结果表明:(1)粗提液的硫酸铵沉淀经再生几丁质亲和柱和凝胶过滤层析Sephadex G-75得到几丁质酶A.(2)粗提液的硫酸铵沉淀经离子交换色谱DE-52、CM、凝胶过滤层析Sephadex G-75得到几丁质酶B.(3)几丁质酶A、B的比活性分别为35.6 U/mg和4.1 U/mg.(4)从膜荚黄芪种子中分离纯化的几丁质酶A和B均为糖蛋白,含糖量分别为6.1%和5.8%.(5) SDS-PAGE显示,几丁质酶A、B的分子量分别为35.5 ku、39.6 ku;凝胶过滤层析测定几丁质酶A、B的分子量分别为36.9 ku、40.8 ku;表明几丁质酶A、B均为单亚基蛋白.     

人γ－精浆蛋白的亲和纯化及其糖基化分析

目的:从人精液中提纯γ-精浆蛋白并对其生物学特性进行鉴定。 方法:应用饱和硫酸铵法从小鼠腹水中纯化出抗γ-精浆蛋白的单克隆抗体E4B7,将其共价交联到CNBr-Sepharose4B上,制备成免疫亲和层析柱,用该层析柱亲和纯化经饱和硫酸铵粗提的精液标本。纯化产物分别用SDS-PAGE、Western-blot及ELISA进行生物学特性鉴定,最后经PNGase F、Endo-H酶消化后进行糖基化分析。结果:SDS-PAGE电泳表明纯化蛋白的相对分子量约为44KD,Western-blot及ELISA鉴定显示该蛋白可与抗γ-精浆蛋白的单抗E4B7特异性结合。对纯化蛋白无论是单用Endo-H酶消化,还是同时用Endo-H酶和PNGase F酶共同消化,消化产物电泳后相对分子量均降低到34KD左右,而单独用PNGase F酶消化后相对分子量没有改变。Western-blot及ELISA鉴定显示糖苷酶处理后的纯化蛋白仍可与单抗E4B7特异性结合。结论:成功纯化出N-糖基化形式的γ-精浆蛋白,这为下一步筛选人源化抗体奠定了纯的抗原基础。     

植物磷酸烯醇式两酮酸羧化酶的研究——Ⅵ.葡萄糖-6-磷酸和甘氨酸对高粱叶片PEP羧化酶的稳定效应

高粱叶片的PEP羧化酶对温度很敏感,在45℃下迅速失活。加入变构活化剂G6P或者甘氨酸对酶的稳定性没有明显的影响。但当在C6P和甘氨酸同时存在时,酶对高温的稳定性则大大提高了。PEP羧化酶在低温中也不稳定。4℃下很快失活。酶的这种冷失活现象也可为加入效应剂G6P和甘氨酸所防止。 比较一些多羟基醇类对酶的热稳定性的影响,表明它们都显著地提高酶的热稳定性。山梨醇的保护作用最强,赤藓醇次之,甘油又次之。说明保护效应与保护剂的羟基数有关。应用含有G6P、甘氨酸和甘油(GGG)的缓冲液对提高酶在纯化和贮存过程中的稳定性非常有效。     

杂交稻核酮糖二磷酸羧化酶的动力学性质

在ｐＨ８．０和３０Ｃ的条件下测定了杂交稻ＲｕＢＰ羧化酶的动力学常数,纯化酶测定值与粗酶快速测定值无明显差异。１２种不同组合的三系杂交稻其ＲｕＢＰ羧化酶动力学常数差不大,Ｋｍ（ＣＯ２）和Ｔｍａｘ的平均值与普通栽培品种也无显著差异。杂交稻汕优６３号ＲｕＢＰ羧化酶的动力学常数和酶蛋白含量与父本恢复系相类似,枰本不育系的Ｔｍａｘ和酶蛋白含量均较高。     

甲基单胞菌Methylomonas sp.GYJ3中甲烷单加氧酶羟基化酶组分的纯化和性质

Methylomonassp．GYJ3菌株中经DEAE-SepharoseCL-6B阴离子交换层析和SephacrylS300凝胶层析分离纯化出甲烷加氧酶羟基化酶组分．经HPLC分析,纯度大于90％,分子量为240kD,纯化倍数为3．9,比活为225nmol环氧丙烷每分钟毫克蛋白．SDS-PAGE表明,羟基化酶由三个亚基组成,亚基分子量为56、43、27kD．ICPAES测定羟基化酶的Fe含量为2.1molFe每摩尔蛋白．HPLC法用于甲烷单加氧酶羟基化酶组分的纯化,纯化的羟基化酶组分比活为541nmol（环氧丙烷）每分钟毫克蛋白,是两步LC法纯化的羟基化酶的两倍,Fe含量为3．78molFe每摩尔蛋白．催化性质研究表明羟基化酶能够被化学还原剂还原为还原态羟基化酶,还原态的羟基化酶单独存在时表现出MMO活性,说明它是MMO活性中心,天然态的羟基化酶单独存在时无MMO活性,加入粗酶液中MMO活性明显增加,说明GYJ3菌中MMO是一个复合酶系．     

萱草花粉类动力蛋白生物物理学及药理学性质

利用FPLC技术从萱草花粉中鉴定并纯化了动力蛋白,研究了它的酶学性质及部分生物化学性质。结果如下:纯化的类动力蛋白分子量为100kD,等电点pI=6·15和6·80。在280nm波长激发下,最大的荧光发射波长是346nm。荧光光谱分析结合紫外吸收光谱及导数光谱分析推断它含有色氨酸和酪氨酸残基。药理学性质研究表明巯基可能在酶的活性中心起重要作用。     

杂交稻核酮糖二磷酸羧化酶的动力学性质

在ｐＨ８．０和３０℃的条件下测定了杂交稻ＲｕＢＰ羧化酶的动力学常数,纯化酶测定值与粗酶快速测定值无明显差异。１２种不同组合的三系杂交稻（Ｆ１）其ＲｕＢＰ羧化酶动力学常数差异不大,Ｋｍ（ＣＯ２）和Ｖｍａｘ的平均值与普通栽培品种也无显著差异。杂交稻汕优６３号ＲｕＢＰ羧化酶的动力学常数和酶蛋白含量与父本恢复系相类似,而母本不育系的Ｖｍａｘ和酶蛋白含量均较高。     

植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的研究——Ⅶ.PEP羧化酶必需赖氨酸残基的化学修饰

本文报道纯化的高粱叶片PEP 羧化酶经氨基修饰剂TNBS 和PLP 的修饰迅速失活。酶的TNBS 失活与保温时间和抑制剂浓度呈函数关系并表现为拟一级反应的特性。动力学资料表明酶仅被1分子TNBS 修饰即失活。TNBS 修饰酶的吸收光谱特性表明被修饰的是酶蛋白的赖氨酸残基。底物(PEP)和效应剂(G6P)保护酶免被TNBS 失活。计算G6P 和酶的解离常数K_d-2.39×10~(-3)M。酶的其他反应组分HCO_3~-和MgCl_2单独存在时均不影响TNBS 对酶的失活作用。在被TNBS 修饰过程中还导致酶对G6P 迅速脱敏,同时却保持酶对甘氨酸的敏感性。     

植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的研究——Ⅶ.PEP羧化酶必需赖氨酸残基的化学修饰

本文报道纯化的高粱叶片PEP羧化酶经氨基修饰剂TNBS和PLP的修饰迅速失活。酶的TNBS失活与保温时间和抑制剂浓度呈函数关系并表现为拟一级反应的特性。动力学资料表明酶仅被1分子TNBS修饰即失活。TNBS修饰酶的吸收光谱特性表明被修饰的是酶蛋白的赖氨酸残基。底物(PEP)和效应剂(G6P)保护酶免被TNBS失活。计算G6P和酶的解离常数K_d=2.39×10~(-3)M。酶的其他反应组分HCO_3~-和MgCl_2单独存在时均不影响TNBS对酶的失活作用。在被TNBS修饰过程中还导致酶对G6P迅速脱敏,同时却保持酶对甘氨酸的敏感性。     

蟾蜍血清梭曼水解酶（somanase）的纯化及性质的研究

从蟾蜍血清中发现并纯化出了一种与血清载脂蛋白有关的可催化神经性军用毒剂梭曼的水解酶,此酶全部与高密度脂蛋白以复合形成存在于血清中,我们经过多种纯化手段,从ＨＤＬ中分离纯化出了酯酶的最小分子量组分,得到了高活性、高纯度的酶蛋白,在ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳及等电聚焦电泳中呈单一区带,分子量４２ｋＤ,等电点ｐＨ５．２并证明此酶不是ＨＤＬ中的任何一种已知载脂蛋白,也不是磷脂酶Ａ２和磷脂酶Ｃ以及存在于ＨＤ     

韭菜细胞溶质超氧化物歧化酶的纯化和性质

经硫酸按沉淀、SephadexG－200凝胶过滤和DEAE－Sephacel层析3个步骤,将韭菜细胞溶质SOD纯化到均一程度。从500g叶片中得到2·4mm酶,酶比活力达13000U／mm蛋白。鉴定该酶是Cu·Zn—SOD。测得酶分子量约为30900道尔顿,亚基分子量约为15900道尔顿,N一末端氨基酸为丙氨酸。该酶在紫外与可见光区吸收峰分别在260urn和680urn。实验表明该酶热稳定性良好。     

短小芽孢杆菌2080碱性蛋白酶的纯化与性质

短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）2080碱性蛋白酶的发酵液经超滤、硫酸铵沉淀、CM Sepharose Fast Flow和DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析得到了纯化的组分。SDS-PAGE电泳分析显示其分子量约为61kDa。酶学性质研究表明,该纯化酶的最适pH为10．5,最适温度为50℃。     

刺桐胰蛋白酶抑制剂基因的构建及表达研究

刺桐胰蛋白酶抑制剂是胰蛋白酶、组织型纤溶酶原激活剂及瑞替普酶特异性的抑制剂,可作为配基制成亲合填料用于纯化上述酶。通过化学合成和PCR结合法合成了ETI基因,经过序列分析后将其克隆到大肠杆菌表达载体质粒pET32a中,并在大肠杆菌中进行诱导表达。表达蛋白分子量同理论值一致,生物活性检测表明复性后的ETI对胰蛋白酶及瑞替普酶具有特异抑制作用。     

植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的可逆胍变性

纯化的高梁叶片磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEP羧化酶)经不同浓度的盐酸胍处理变性失活后,在试验的蛋白浓度范围内,它的失活时间进程的动力学分析表明为一级反应。0.4 M盐酸胍处理25分钟后(O℃),酶的催化活性完全丧失,酶蛋白的远紫外圆二色性光谱、内源荧光光谱及免疫特异性等测定均表明酶的结构发生了深刻变化。甘油及PEP羧化酶的变构效应剂G6P和甘氨酸对酶在盐酸胍溶液中的变性作用有一定的保护效果。变性酶用复性缓冲液稀释20倍后,在最佳条件下,再经30分钟保温,酶的催化活性能恢复70％以上。G6P和甘氨酸能促进变性酶的复性,甘油亦有明显效果。随着酶活性的恢复,它的远紫外圆二色性、内源荧光及免疫特异性也随之恢复,变性酶的复性速率在常温下(25℃)比在低温下(0℃)要快得多。     

产纳豆激酶菌株Bacillus sp.ZLK08的分离及酶纯化

获得稳定产纳豆激酶菌株,为高酶活纳豆激酶产生菌的改造奠定基础.取各来源纳豆,用平板梯度稀释法分离菌株,测定菌株酶活,利用16S rDNA鉴定产酶菌株,凝胶过滤法纯化纳豆激酶并SDS-PAGE检测分析.成功获得稳定产酶芽胞杆菌Bacillus sp.ZLK08,16S rDNA分析表明其与GenBank中序列同源率达到99％,液体发酵表明酶活达到2.5 FU/mL,经纯化,SDS-PAGE表明纳豆激酶分子量为28.46 ku.分离出的Bacillus sp.ZLK08菌株能稳定产纳豆激酶且具有较高酶活.     

色氨酸残基在磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶催化功能中的作用

在pH7.5条件下,用NBS对PEP羧化酶中色氨酸残基进行共价修饰表明,PEP羧化酶中48个色氨酸残基均能被NBS修饰。用邹承鲁图解法求得,其中4个残基为酶表现催化活性所必需的。 PEP羧化酶的变构效应剂G6P、Gly及Mal分别与酶预保温后,再经NBS修饰,前两种处理中,同样浓度的NBS所用修饰的色氨酸残基数和处理后的残存酶活与对照相比有很大的差异,而用Mal处理的,两者与对照相差无几。