基因操作原理(续)——第八章 在哺乳动物细胞中克隆

前面几章表明,有很多质粒和噬菌体可作为载体在原核细胞(特别是大肠杆菌)中克隆。然而,明显对比的是,现今只有唯一的一类载体被用于哺乳动物细胞克隆。这类载体是从猿猴病毒40(SV40)衍生而来的。SV40是致瘤的乳多泡病毒(papovavirus);     

人工转录因子促进外源基因在CHO细胞中的高效表达

以酵母转录因子GAL4中1-147位氨基酸序列为构建人工转录因子的DNA结合结构域,单纯疱疹病毒转录激活子VP16中12肽(DALDDFDLDMLG)的4个串联重复作为人工转录因子的功能结构域,用SV40的核定位序列(NLS)将两部分连接起来,构建了人工转录因子GVP4并将其克隆进入表达载体pcDNA3·1/Hygro( )中。将不同长度的人工转录因子结合序列构建在外源基因表达载体pcDNA3·1( )启动子CMV的上游,分别连接外源基因EGFP和tPA。用表达人工转录因子和外源基因的载体共转染CHO细胞,EGFP和tPA在含不同数量人工转录因子结合位点表达载体pcDNA3·1( )转染的CHO细胞中的表达水平呈现不同程度的提高。其中,以引入10个人工转录因子结合位点的表达载体的效果最明显,EGFP和t-PA的表达效率均提高2~3倍。结果表明,人工转录因子能有效地促进外源基因在哺乳动物细胞中的表达。     

SV40病毒的培养、增殖及鉴定

目的：建立SV40病毒在Vero细胞上培养的方法,观察其生长过程,获得SV40病毒,并建立相应的SV40病毒检测方法,为SV40灭活疫苗的制备奠定良好的基础。方法：在Vero细胞上培养和增殖SV40-776株病毒。收获病毒后,应用PCR、免疫荧光以及克隆特异性片段进行测序比较来鉴定SV40病毒。结果：SV40在Vero细胞中增殖很快,并且使细胞出现明显的病变。小规模分离到了SV40病毒颗粒,获得了病毒DNA。不同的鉴定方法均显示出良好的特异性。结论：探讨了SV40病毒病变的基本过程,建立了病毒的培养、增殖和鉴定的方法。     

SV40 T基因转化的山羊乳腺上皮细胞系及其生物学特性

目的建立能用于乳腺特异表达基因构件质量检验的山羊乳腺上皮细胞系.方法根据已发表的SV40病毒T基因序列设计引物,以整合有SV40 DNA早期基因区的COS-1细胞基因组DNA为模板,用高保真PCR扩增SV40 T基因.将获得的SV40 T基因克隆入真核表达载体,并用获得的重组表达质粒转染山羊原代乳腺上皮细胞.经有限稀释和反复传代后获得转化细胞克隆,对其生物学特性进行研究.结果扩增出序列正确的SV40T基因,重组质粒转染获得的转化细胞的对数生长期为接种后第4天,细胞群体倍增时间为23.5*!h,克隆形成率为26.7%.DNA斑点杂交试验证明转化细胞的基因组中整合有SV40 T基因,染色体核型分析试验表明转化细胞的核型无明显异常,裸鼠接种试验证明转化细胞不能形成肿瘤,软琼脂集落形成试验表明转化细胞在软琼脂中不能生长.部分细胞克隆已在体外传30代以上,保持正常乳腺上皮细胞的形态特征,在胶原基质上能形成腺泡样结构.结论本研究获得的SV40 T基因转化的山羊乳腺上皮细胞具有转化细胞系的生物学特性.     

SV40灭活疫苗的制备及其对小鼠免疫的研究

猿猴空泡病毒40(Simian vacuolating virus 40,SV40) 属于乳多空病毒科,是一种DNA肿瘤病毒。亚洲猿类特别是恒河猴是SV40的天然宿主。感染SV40病毒可导致猴体急性病变或呈长期带毒状态,此外能诱使幼鼠产生肿瘤,并能使多种培养细胞发生转化。本研究初步建立了SV40 病毒在Vero细胞中的增殖培养方法,并且初步建立了β丙内脂灭活病毒的方法和纯化工艺。使用SV40病毒灭活疫苗对Balb/c小鼠进行了免疫,结果表明该疫苗具有较好的免疫原性。随后对SV40 病毒DNA在免疫小鼠的重要脏器中的整合情况进行了调查,结果表明SV40病毒DNA未在小鼠重要脏器中整合。本研究为SV40病毒灭活疫苗的研制和进一步开展猴体抗SV40 感染实验奠定了良好的基础。     

SV40灭活疫苗的制备及其对小鼠免疫的研究

猿猴空泡病毒40(Simian vacuolating virus 40,SV40) 属于乳多空病毒科,是一种DNA肿瘤病毒.亚洲猿类特别是恒河猴是SV40的天然宿主.感染SV40病毒可导致猴体急性病变或呈长期带毒状态,此外能诱使幼鼠产生肿瘤,并能使多种培养细胞发生转化.本研究初步建立了SV40病毒在Vero细胞中的增殖培养方法,并且初步建立了β-丙内脂灭活病毒的方法和纯化工艺.使用SV40病毒灭活疫苗对Balb/c小鼠进行了免疫,结果表明该疫苗具有较好的免疫原性.随后对SV40病毒DNA在免疫小鼠的重要脏器中的整合情况进行了调查,结果表明SV40病毒DNA未在小鼠重要脏器中整合.本研究为SV40病毒灭活疫苗的研制和进一步开展猴体抗SV40感染实验奠定了良好的基础.     

DNA肿瘤病毒SV40的细胞转化特性

SV40是被广泛应用于肿瘤研究的DNA肿瘤病毒。本文简述了它的一般生物学特性,根据大量研究报道着重归纳了SV40在体外转化细胞的特性及其转化机制,并展望了SV40转化蛋白在癌变机理、细胞分化等研究中的进一步应用。     

人TIMP-1 cDNA克隆、真核表达载体构建及在COS-7细胞中的表达

根据 Gen Bank中 TIMP- 1基因的碱基序列 ,用 RT- PCR方法从人的正常肾组织中克隆出包含信号肽在内的 TIMP- 1全长 c DNA序列 .采用 T- A克隆的方法将之插入 p CRR2 .1中间载体 ,DNA测序证实该片段序列与文献报告的完全一致 .利用亚克隆的方法将 TIMP- 1 c DNA片段克隆到 pc DNA3载体上 ,构建出 pc DNA3/ TIMP- 1的真核表达载体 ,通过脂质体 DOTAP转染至 COS-7细胞 ,Northern印迹及原位杂交证实在 COS- 7细胞上获得人 TIMP- 1的高效表达 ,细胞增殖实验表明 TIMP- 1的高产表达可促进 COS- 7细胞的增殖 ,证实了所转染人 TIMP- 1的生物活性     

一种基于塞姆利基森林病毒复制子的新型复制子载体

RNA复制子是能自主复制的病毒RNA。基于RNA复制子的表达载体和基因疫苗比常规真核表达载体和DNA疫苗具有更大的优越性。以塞姆利基森林病毒RNA复制子衍生的真核表达载体pSFV1为骨架 ,插入CMV立即早期启动子和SV40晚期Poly(A)信号 ,构建了一种完全基于DNA的复制型表达载体pSFV1CS ,将增强型绿色荧光蛋白基因EGFP插入其中 ,构建了重组质粒pSFV1CS EGFP ,通过转染 2 93T细胞 ,证实外源基因能在其中高效表达。该载体可用于表达真核蛋白和构建复制子载体疫苗。     

鸡源细胞基因沉默及快速筛选的实用型双标记RNAi载体

利用人H1 RNA启动子、EGFP基因及Neomycin抗性基因,构建用于禽类细胞基因持续沉默和快速筛选的实用型RNAi载体。在将pCDNA3.1(+)载体上的SV40启动子替换为鸡源的β-actin启动子后,装入EGFP基因表达框以及用于驱动外源shRNA转录的人H1 RNA启动子,构建成同时具有EGFP和Neomycin抗性双标记的RNAi载体,并为载体引入独特设计的含媒介序列的多克隆位点以方便外源shRNA编码小片断插入后的快速筛选,载体设计非常实用。插入靶向EGFP和sIgM λ基因的shRNA编码序列后分别瞬时转染DF-1和DT40细胞,结果显示靶基因表达得到了明显抑制。联用EGFP和Neomycin双标记快速筛选sIgM λ轻链基因稳定沉默的DT40细胞克隆的结果也证实,H1启动子转录shRNA的干扰效果是高效的,双标记筛选策略不仅有效而且方便、快捷。     

人生长激素基因逆转录病毒载体的构建及其对3T3和ES细胞的转化与表达

为了研究生长激素基因在异源细胞中的表达,构建了携带人生长激素基因（ｈＧＨ）的逆转录病毒载体ｐＩＮＳ－ＧＨ,并将其导入小鼠成纤维细胞３Ｔ３和小鼠胚胎干细胞（ＥＳ细胞）ＣＣＥ中。ｐＩＮＳ－ＧＨ转化３Ｔ３细胞,获得了高效表达的克隆,即用放射免疫法检测到克隆培养基中有大量的人生长激素蛋白富积,如ＧＨＳＮＣ２０,富积率高达３７８４ｎｇ／ｍｌ,而且外源基因的整合很稳定。不同的３Ｔ３转化克隆的表达率有显著的差异,Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交的结果表明,这种差异与外源基因整合的拷贝数无关。ｐＩＮＳ－ＧＨ转化ＣＣＥ细胞没有获得明显表达的克隆,而且外源基因的整合也不稳定。转化的ＥＳ细胞克隆总ＤＮＡ的Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果表明,ｈＧＨ基因的确整合到细胞基因组中。目前尚未发现明显的外源ＤＮＡ重排的迹象。     

小剂量DNA毒剂诱导SV40转化的人细胞中的SV40DNA的增强复制

本文介绍了用~(32)P标记的pSV_2质粒为探针,通过DNA分子原位杂交研究小剂量DNA毒剂诱导被SV40转化的人细胞NB—E中SV40DNA的增强复制.最佳条件下,最大增强比可达4-5.而且,这种病毒DNA增强复制与病毒的增强复活与增强致突有相似的动力学过程和剂量响应关系.此结果为哺乳类细胞中可能存在SOS功能提供了进一步证据.被诱导细胞的Hirt沉淀与Hirt上清液中都存在SV40DNA片段,且Hirt上清液中SV40DNA片段大小均一,反映此过程与λ原噬菌体的诱导的起始过程有相似之处.小剂量紫外线可诱导被SV40转化的人XP细胞中的SV40 DNA的增强复制.说明这一诱导过程可能与切除修复功能有不同的遗传学过程.     

pcDNA3．1表达载体转染对细胞生长的影响

为了探讨真核表达载体转染对细胞生长的影响,通过脂质体介导将pcDNA3.1( )表达载体DNA转染鼻咽癌细胞系HNE1,G418筛选后,Southern杂交鉴定稳定表达细胞株,以HNE1细胞为对照,观察pcDNA3.1( ）／HNE1克隆细胞的生物学特性;结果显示,在pcDNA3.1( )/HNE1阳性克隆中,一株细胞克隆培养过程中发生自溶性死亡,一株细胞生长明显受到抑制,另一株细胞生长无明显影响,揭示在宿主细胞中pcDNA3.1( )DNA与宿主基因组DNA发生了随机整合,从而表现不同的细胞生物学改变。     

转基因动物及其在医学研究中的应用

转基因动物(transgenic animal)是指基因组中稳定地整合有以实验方法导入的外源DNA的动物。被导入的外源基因称为转基因(transgene)。1974年美国学者Jeanisch等首次应用显微注射的方法将SV40 DNA注射到小鼠囊胚腔内,在子代小鼠的许多组织中含有该DNA,后来研究证明该DNA以非整合的附加体     

外源基因表达与代谢超负荷

随着重组DNA技术的出现,各种基因大量地被分离定型,然后在外源宿主细胞内表达。生物技术研究成果的产业化正迅猛发展,如克隆多拷贝的基因或采用高质粒拷贝数的克隆载体;采用在基因序列上游含有翻译信号的载体;选用带有强转录启动子的克隆载体等等。但是,宿主细胞的表达水平是有限的,因为外源基因在宿主细胞内的表达水平是有限的,因为外源基因在宿生细胞内的表达要利用宿主细胞的大量资源,并增加其代谢负荷。这种强加的代谢超负荷,会导致宿主细胞的生物化学和生理学改变,如果这些改变较大,可降低目的蛋白的产生和回收量。该综…     

细胞核蛋白与翻译起始因子eIF-4A的顺序有同源性

P68蛋白是一种高度保守性的细胞核抗原,它对细胞生长和分裂具有重要的调节作用。在所有实验过的处于分裂期的哺乳和两栖类动物细胞中均能测出P68,而静止期细胞则无。该蛋白在核内呈独特的颗粒样分布,小鼠静止期成纤维细胞经血清刺激4h后能诱导P68表达。用抗SV40大T单克隆抗体PA6204鉴定表明:P68与DNA肿瘤病毒核癌基因SV40大T抗原具有免疫交叉反应性。实验从不同cDNA文库筛选P68蛋白的cDNA克隆,再亚克隆到M13上,然后用Sanger法测序,共测定了2088bp的DNA顺序,由此推测出P68蛋白的氨基酸顺序。与瑞士Prot数据库的其他蛋白质比较后发现:P68氨基酸顺序     

pZ189质粒DNA体外复制系统的建立

报道了含SV40复制起点的质粒DNA在真核细胞抽提物中进行复制的DNA体外复制系统的建立. 在外源性蛋白质SV40大T抗原(SV40 Tag)的参与下,穿梭质粒pZ189能在猴肾vero细胞胞浆抽提物中,利用其中参与体内DNA复制所需的蛋白质成分,有效地进行体外DNA复制. 从而为研究真核细胞DNA复制系统的结构与功能提供了简单、有效的模型.     

外源DNA在动物体内的吸收代谢

综述了外源DNA在动物体内组织和细胞的代谢命运。外源DNA经核酸酶不完全降解后可以通过胃肠道被哺乳动物吸收,外源DNA片段能够被哺乳动物细胞吸收并整合到宿主细胞基因组中。     

CRISPR/Cas9介导的外源基因靶向插入鸡EAV-HP基因组

本研究旨在通过CRISPR/Cas9介导外源基因靶向插入鸡EAV-HP基因组。首先设计特异性引物并扩增鸡内源性病毒(EAV-HP)左右同源臂和增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因表达盒,然后通过重叠延伸PCR技术将两个同源臂DNA连接至eGFP表达盒两侧,获得全长DNA片段LER,并克隆至pMD19-T载体,获得携带eGFP基因的供体载体pMDT-LER。随后在HEK293T细胞中验证供体载体pMDT-LER能成功表达eGFP后,将EAV-HP打靶载体和供体载体共转染至DF-1细胞,观察绿色荧光阳性细胞,提取细胞基因组,PCR检测外源基因eGFP成功整合至鸡基因组EAV-HP位点。最后,将转基因细胞DF-1传至第7代,用PCR和Western blotting检测eGFP在转基因细胞中稳定表达。文中初步验证外源基因eGFP能整合至鸡EAV-HP位点并稳定表达,为转基因鸡的研究提供新整合位点。