30L生物反应器连续灌注培养重组CHO—C28细胞表达HBsAg的研究

应用３０ Ｌ生物反应器和微载体悬浮 培养技术,通过电脑全自动控制,连续灌注培养分泌ＨＢｓＡｇ 的重组ＣＨＯ－Ｃ２８细胞。试验了培养方式、连续灌流速度,反应器转速和细胞对葡萄糖消耗等工艺条件。观察培养６０ 天,细胞的生长形态、ＨＢｓＡｇ 分泌动态和染色体数。研究结果表明,连续培养６０ 天,细胞密度可达７．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍ ｌ,平均维持在（５．０～６．０）×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍ ｌ,收液的ＲＰＨＡ 滴度可达１∶５１２,ＨＢｓＡｇ 每天平均产量为３０ ｍ ｇ。     

利用谷氨酰胺合成酶基因（GS）作扩增标记在CHO细胞中高效表达乙型…

利用谷氨酰胺合成酶基因（ＧＳ）作扩增选择标记,结合ＣＭＶ－ＩＥ启动子,在ＣＨＯ细胞中高效表达乙型肝炎的基因。初筛克卫表达水平ＲＰＨＡ检测为１：６４,经过谷氨酰胺合成酶基因的抑制剂ＭＳＸ的两轮基因扩增。ＨＢｓＡｇ的表达水平ＲＰＨＡ在１：２５６以上。方静置培养收液,ＲＩＡ检测ＨＢｓＡｇ最高产量为９．５μｇ／毫升。表达水平较以前利用ｄｈｆｒ基因扩增选择系统所得到的高表达细胞系Ｂ４３高一倍以上。利用ＧＳ基     

利用谷氨酰胺合成酶基因(GS)作扩增标记在CHO细胞中高效表达乙型肝炎表面抗原基因

利用谷氨酰胺合成酶基因（ＧＳ）［１］作扩增选择标记,结合ＣＭＶ－ＩＥ启动子,在ＣＨＯ细胞中高效表达乙型肝炎表面抗原基因。初筛克隆表达水平ＲＰＨＡ检测为１：６４,经过谷氨酰胺合成酶基因的抑制剂ＭＳＸ的两轮基因扩增,ＨＢｓＡｇ的表达水平ＲＰＨＡ在１：２５６以上。方瓶静置培养收液,ＲＩＡ检测ＨＢｓＡｇ最高产量为９．５μｇ／毫升。表达水平较以前利用ｄｈｆｒ基因扩增选择系统所得到的高表达细胞系Ｂ４３高一倍以上。利用ＧＳ基因扩增选择系统可以在哺乳动物细胞中高水平表达外源基因。     

HBsAg携带者重叠感染HCV、HDV的血清学调查

对３６２名无症状高滴度ＨＢｓＡｇ携带者用ＲＩＡ法检测ＨＢｅＡｇ、Ａｎｔｉ－ＨＢｅ、Ａｎｔｉ－ＨＣＶ、Ａｎｔｉ－ＨＤＶ。结果表明,ＨＢｅＡｇ阳性率随ＨＢｓＡｇ滴度的增高而增加,且有显著性差异（Ｐ＜０．０５）。重叠感染以ＨＢＶ＋ＨＣＶ最高,占２７．６％;其次是ＨＢＶ＋ＨＤＶ,占９．１％;ＨＢＶ＋ＨＣＶ＋ＨＤＶ最少,占６．４％。但是,以上重叠感染率均与ＨＢｓＡｇ滴度及／或ＨＢｅＡｇ阳性率高低无关（Ｐ＞０．０５）。调查显示,无症状ＨＢｓＡｇ携带者中ＨＢＶ＋ＨＣＶ,或ＨＢＶ＋ＨＤＶ,或ＨＢＶ＋ＨＣＶ＋ＨＤＶ的重叠感染均可发生。     

乙肝疫苗快速阻断HBV母婴传播的研究

为获得更快速的免疫应答,用３０μｇ／ｍｌ乙肝血源疫苗以０、２、６周免疫程序对６８名ＨＢｓＡｇ阳性母亲婴儿作了阻断ＨＢＶ母婴传播免疫效果的观察,并和常规的０、１、６月接种方案的结果进行了比较。结果表明ＨＢＩＧ合并乙肝疫苗或单用疫苗组产生抗─ＨＢｓ（＞１０ｍＩＵ／ｍｌ）血清转换率于Ｔ６Ｍ、Ｔ１２Ｍ时分别为９１．８９％,和８３．８７％;８１．０８％和８３．８７％。短程和常规免疫方案婴儿所产生的保护性抗─ＨＢＳ动态比较,表明以０、２、６周免疫后的Ｔ６ｗ、Ｔ６ｍ时的抗─ＨＢｓ有效率分别为１９．３５％和８３．８７％,明显高于０、１、６月免疫者同期抗体水平（Ｐ＜０．０１）。至Ｔ１２Ｍ时两组的阳转率无显著性差异,说明０、２、６周免疫方案能早期诱导出保护性抗─ＨＢｓ免疫应答。     

糖基化对乙型肝炎表面抗原疫苗的影响

哺乳动物（ＣＨＯ）细胞表达的三种糖基化程度不同的乙肝表面抗原（ＨＢｓＡｇ）Ａ（含ＧＰ３０,ＧＰ２７,Ｐ２３）,Ｂ（含ＧＰ２７及Ｐ２３）,Ｃ（只有Ｐ２３）,在免疫原性、放置后抗原的稳定性以及对不同单克隆抗体亲和力等方面都有明显的差异;（１）免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠后血清中抗体工（ＥＤ５０）。平均结果为Ａ＝１：８０,Ｂ＝１：１１７,Ｃ＝１：１４,表明有糖基的ＨＢｓＡｇ疫苗对小鼠的免疫力明显高于无糖基的ＨＢ     

乙型肝炎病人尿细胞中HBV的实验研究

本文采用间接免疫荧光法（ＩＦ）,ＲＰＨＡ法,ＥＬＩＳＡ法及斑点杂交技术检测１０例无症状ＨＢ－ｓＡｇ携带者及８９例乙肝病人尿细胞中的ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ及ＨＢＶＤＮＡ,发现尿细胞中有ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、ＨＢＶＤＮＡ存在。结果提示：乙肝无症状携带者及乙肝病人尿细胞中具有ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、ＨＢＶＤＮＡ,因此更进一步证实尿液具有传染性。     

乙型肝炎病人重叠感染丙型肝炎的评价

应用ＥＬＩＳＡ和ＰＣＲ法检测５０２例乙肝病人血清,４０１例ＨＢｓＡｇ阳性血清中,有１１４例（２８．４％）抗－ＨＣＶ和ＨＣＶＲＮＡ双项阳性,２５例（６．２％）ＨＣＶＲＮＡ单项阳性;２１例（５．２％）抗－ＨＣＶ单项阳性。将ＨＢｓＡｇ乙肝病人分成ＨＢＶＤＮＡ,ＨＢｅＡｇ阳性组和ＨＢＶＤＮＡ,ＨＢｅＡｇ阴性组。前者抗－ＨＣＶ阳性率为１１．６％～２０．５％,ＨＣＶＲＮＡ阳性率为１６．２％～２０．５％。后者抗－ＨＣＶ阳性率为２０．２％～５５．６％,ＨＣＶＲＮＡ阳性率为２３％～６０．３％。结果说明长期携带ＨＢＶ者和慢性乙肝病人均可重叠ＨＣＶ感染。ＨＢＶＤＮＡ阳性组抗－ＨＣＶ和ＨＣＶＲＮＡ阳性率明显高于ＨＢＶＤＮＡ阳性组     

乙型肝炎疫苗中游离抗原对免疫效果的影响

将按《生物制品规程》制备除氢氧化铝吸附方式不同外,其余所有过程均一致的疫苗各１０批,在ＨＢｓＡｇ含量相同前提下,于５００公升大罐内吸附制备的疫苗中游离抗原含量比在１０公升瓶内吸附制备的疫苗高４倍,两者均数分别为３０４．１ｎｇ／ｍｌ和７３．１ｎｇ／ｍｌ,吸附率分别为９７．９５％和９９．５１％;用ＲＰＨＡ测定游离抗原滴度前者也比后者高２倍;动物免疫效价（ＥＤ５０）高４７％。在上述吸附率范围内,游离抗原含量与ＥＤ５０呈正相关（ｒ＝０．７１７９Ｐ＜０．００１）。     

基因乙肝表面抗原纯化工艺的初步改进

本文研究了新的层析介质（Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ）对原纯化工艺中ＳｅｐｈａｒｓｅＣＬ－４Ｂ柱层析纯化后的乙肝表面抗原（ＨＢｓＡｇ）组分及ＤＮＡ组分的进一步纯化效果。结果表明：该层析介质可以提高ＨＢｓＡｇ的纯度和收量,并对初步提纯ＤＮＡ组分中的乙肝表面抗原有一定意义。并首次发现ＤＮＡ组分中乙肝表面抗原的ＳＤＳ－ＰＡＧＢ图谱较正常基因乙肝表面抗原的图谱缺少３０ＫＤ的条带。     

HBsAg空间结构与分子进化分析

目的:获得乙型肝炎表面抗原HBsAg的生物信息学资料。方法:从Genbank中获得HBsAg的核酸序列,用ExPaSy、EBI和NCBI网站的在线软件推导其编码氨基酸序列、理化性质、空间结构,并在Blastn比对后选择不同地理株进行分子进化进行分析。结果:HBsAg由226个氨基酸组成,分子量25777．6Da,等电点8．74,为亲水性蛋白质;信号肽位于1-29aa处,二级结构由-螺旋(18．14%)、延伸(25．66%)、随机线圈(56．19%)组成。中国与日本、冈比亚、德国、西班牙、墨西哥、荷兰、瑞典、泰国的HBsAg相似率依次为99%、94%、94%、94%、91%、89%、98%、98%、98%．。用不同地理株HBsAg核酸序列构建出的分子进化树中,中国和日本的聚成一簇。结论:通过对HBsAg的生物信息学分析获得该抗原特征,为进一步研究乙型肝炎的感染与发病机制、研制基因工程疫苗以及研究HBsAg新的功能域等提供依据。     

重组CHO细胞HBsAg 纯化工艺的优化

目的：优化重组CHO细胞HBsAg纯化工艺。方法：由乙肝病毒S基因转化的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞培养收液,经初步提纯、密度梯度离心、凝胶过滤层析可得到HBsAg纯品。结果：通过凝胶过滤层析收取HBsAg活性峰,控制HBsAg活性峰的收量,并把HBsAg活性峰的下降段再收集起来重新层析,改进后可使HBsAg的总回收率达到60％以上,而且牛血清蛋白残余量达到10mg/ml以下,HBsAg纯度97％以上。结论：重组CHO细胞HBsAg纯化工艺改进后,使HBsAg在产量及质量上均有明显提高。     

合成乙型肝炎表面抗原肽段的结构与抗原性

本文对合成的乙型肝炎表面抗原肽段的结构与抗原性进行了研究。通过对三种亚型共9个合成肽段的抗原性测定和结构分析,我们证实了在乙型肝炎表面抗原(HBsAg)氨基酸顺序的122-137区域存在着共同决定簇“a”,且半胱氨酸残基对抗原性有很大的影响。合成的16肽P_(122-137)的两个半胱氨酸残基用叔丁基保护时,其抗原性几乎检测不到,一旦去掉保护基并氧化成分子内S—S键后,抗原性明显增加。比较各种亚型肽段的抗原性测定结果,我们发现亚型决定簇d(或y)的位置可能在122—132之间。另外我们发现P_(adw)122—132的抗原性要比P_(adr)122-137的抗原性强,结构分析结果表明adw型中的Asn_(132)可能对此有较大的贡献。     

抗HBsAg二硫键稳定性Fv抗体(dsFv)基因的构建与表达

采用PCR定点突变方法,成功地构建了抗HBsAg dsFv抗体的轻、重链突变基因,NdeI和EcoRI酶切后分别插入pET20b表达质粒,经测序证明在重链第44位氨基酸和轻链第100位氨基酸已突变形成半胱氨酸(Cys).VH和VL重组质粒分别转化到大肠肝菌BL21(DE3)中,IPTG诱导后,经SDS-PAGE电泳表明在12kD处有包含体蛋白表达,表达蛋白含量分别为28%和35%.VH和VL包含体蛋白经GuHCl变性后,等量混合在复性折叠液中结合,形成了一个约24kD并有一定活性的dsFv蛋白.抗HBsAg dsFv抗体表达及复性的成功,为今后基因工程抗体的研究及应用奠定了基础.     

BCG-CpG-DNA对重组HBsAg免疫原性的影响

为了研究BCG-CpG-DNA对重组HBsAg免疫原性的影响,了解其佐剂功能。采用不同剂量BCG-CpG-DNA与不同剂量重组(汉逊酵母)表达的HBsAg或Al-HBsAg混合免疫小鼠,与同剂量铝佐剂疫苗对比,以放射免疫法检测抗-HBs中和抗体水平和抗体持续时间,ELISA法检测抗体亚类。结果显示,BCG-CpG-DNA和HBsAg混合,抗-HBs的中和抗体水平达到或高于同剂量铝佐剂疫苗;BCG-CpG-DNA和Al-HBsAg混合,抗-HBs的中和抗体水平高于同剂量铝佐剂疫苗,并有统计学显著意义(P<0.05);添加BCG-CpG-DNA组抗体水平4周时增加不明显,到10周则显著地高于同剂量铝佐剂疫苗组,IgG2a抗体水平也高于相应的对照组。实验结果表明BCG-CpG-DNA对HBsAg有较好的免疫佐剂作用,并和AL佐剂有协同作用。     

抗乙型肝炎表面抗原不同亚型单克隆抗体细胞株的建立和鉴定

乙型肝炎病毒表面抗原主要的５个不同亚型,是乙肝病毒不同遗传型变种表型的表达,通过四次细胞融合获得了抗－ａ、抗－ｄ、抗－ｙ、抗－ｗ亚型的单克隆抗体,并作了鉴定及初步应用,为进一步对乙肝亚型分型试剂的研制打下了良好的基础     

抗乙型肝炎病毒表面抗原“y”亚型及“a”组抗原决定簇杂交瘤细胞株的建立与应用

用部分纯化的HBsAg/adr和ayw亚型免疫Balb/c小鼠的脾细胞,在PEG作用下与Sp2/o骨髓瘤细胞进行融合,经ELISA及RIA法筛选出了分泌抗HBsAg/a(SH 1 D9)、抗HBsAg/y(SG 3 B10)亚型决定簇的杂交瘤细胞系,在组织培养上清液中它们的滴度分别     

重组HBsAg的纯化及动物免疫原性研究

用乙型肝炎病毒(HBV)DNA转染工程细胞株MT-5,收获培养上清液,经超过滤浓缩、PEG沉淀和3次超速离心,得到纯化的HBsAg。经SDS-PAGE银染色后,纯化的HBsAg显示两条多肽,分子量分别为23k和27k,与血源HBsAg的多肽成分相同,为HBsAg的两条特异性多肽。经PAGE银染色结果显示,纯化的HBsAg中杂蛋白含量符合疫苗制备要求。用上述方法提纯HBsAg,回收率可达44.1％以上。 将纯化的HBsAg吸附于氢氧化铝佐剂,免疫Balb/c小鼠,并与血源HBsAg对照,抗体半数阳转剂量(ED50)分别为0.501μg和0.832μg,说明基因工程HBsAg的免疫原性似优于血源HBsAg。     

乙型肝炎表面抗原疑难判定血清的研究

用中国药品生物制品检定所检定合格的国内外HBsAg EIA试剂及ABBOTT抗-HBs、抗-HBc EIA试剂,对所收集的13份HBsAg疑难判定血清进行检测,并用PCR方法检测血清中HBV DNA,结果显示国内外HBsAg试剂对部分HBV DNA阳性样品的检出率差异较大,提示这些样品可能为S基因突变株或HBsAg含量较低,因此,HBsAg EIA试剂的敏感度仍有待进一步提高,并应进一步研制检测S基因突变株的HBsAg诊断试剂。     

大剂量HBsAg 对HBV 转基因小鼠T 细胞免疫调节的研究

目的:研究大剂量HBsAg对HBV转基因小鼠其T细胞免疫效果的影响。方法:用大剂量血源性HBsAg免疫HBV转基因小鼠,采用ELISA方法观察转基因小鼠所诱生的HBsAg特异性Th1类细胞因子的水平,ELISPOT方法检测不同免疫方案对小鼠HBsAg特异性分泌IFN-γT细胞数量的影响,同时检测对小鼠淋巴细胞增殖的影响。结果:HBsAg组免疫后脾细胞产生的Th1类细胞因子(IFN-γ、IL-2)、HBsAg特异性分泌IFN-γT细胞及T细胞增殖水平较对照组显著增加(P<0.05)。结论:大剂量的HBs-Ag可以诱导乙肝转基因小鼠产生高水平Th1类细胞因子并打破免疫耐受。