培养基组分、激素及pH值对转基因白桦花粉萌发的影响

采用花粉离体培养法研究了培养基不同组分、激素及pH值对转基因白桦（Betula platyphylla Suk.）花粉萌发的影响。结果表明,培养基组分在一定范围内促进花粉萌发,转基因白桦花粉萌发对硼酸和Ca^2＋的反应敏感,培养基中缺乏该物质时花粉不萌发。激素类物质低浓度时促进萌发,高浓度时抑制萌发。最适合培养基组分为蔗糖18%,硼酸0.015%,Ca^2＋ 0.020%,pH6.0,NAA 10mg/ml,6-BA 1mg/ml。并对不同保存条件（4℃,-20℃）下转基因白桦花粉的萌发率进行了比较,4℃下干燥保存更有利于保持转基因白桦花粉的活力。     

玉米Ubi-1启动子在可育转基因玉米植株中的表达活性

本工作将玉米泛素基因-1启动子(Ubi-1)与大肠杆菌β-葡糖苷酸酶基因(gus,uidA)的编码区融合,通过基因枪粒子轰击方法转化来自玉米未成熟胚盾片组织的I-型愈伤组织,经PPT选择获得可育的玉米转基因植株,并采用组织化学方法分析了Ubi-1启动子驱动的gus基因在不同组织、细胞中的表达活性,发现gus基因在除花药壁以外的其它所试组织中均可以有效表达.UbiGUS在花粉、卵细胞和T1代转基因植株未成熟胚中的表达显示该启动子在植株发育的早期阶段即具有活性.对T0代转基因植株的花粉进行GUS组织化学染色,gus基因呈11分离,显示外源基因在转基因植株中以孟德尔方式遗传.同时发现,使用玉米本身的启动子Ubi-1可以降低外源基因在转基因玉米中的拷贝数,进而避免基因沉默现象的发生.目前已得到第二代转基因种子.     

玉米Ubi－1启动子在可育转基因玉米植株中的表达活性

本工作将玉米泛素基因－1启动子（Ubi-1)与大肠杆菌β－葡萄糖苷酸酶基因（gus,uidA)的编码区融合,通过基因枪粒子轰击方法转化来自水成熟胚盾片组织的I－型愈伤组织,经PPT选择获得可育的玉米转基因植株,并采用组织化学方法分析了Ubi-1启动子驱动的gus基因在不同组织,细胞中的表达活性,发现gus基因在除花药壁以外的其它所试组织中均可以有效表达。Ubi：GUS在花粉,卵细胞中T1代转基因植株未成熟胚中的表达显示该启动子在植株发育的早期阶段即具有活性。对T0代转基因植株的花粉进行GUS组织化学染色,gus基因呈1：1分离,显示外源基因在转基因植株中以孟德尔方式遗传。同时发现,使用玉米本身的启动子Ubi-1可以降低外源基因在转基因玉米中的拷贝数,进而避免基因沉默现象的发生。目前已得到第二代转基因种子。     

马铃薯Sgt1基因启动子的结构及功能分析

糖苷生物碱(steroidal glycoalkaloids,SGAs)是一类存在于茄科和某些百合科植物的重要次生代谢物,与植物的抗逆性和产品品质有密切关系．茄啶半乳糖基转移酶（solanidine galactosyltransferases,SGT1）是SGAs合成代谢途径的末端关键酶之一,研究其编码基因的启动子序列对于SGAs生物合成代谢调控有重要的作用和意义．研究采用染色体步移技术(Genome walking),首次克隆到马铃薯Sgt1基因起始密码子上游2 183 bp的启动子序列,已注册到GenBank（注册号：KC759163）．构建该启动子驱动融合报告基因gfp::gus的植物双元表达载体p1304Sgt1p,转化野生型烟草获得Sgt1p::gfp::gus转基因植株,通过GUS组织化学染色分析Sgt1p::gfp::gus转基因植株中Sgt1p启动子的活性．结果表明,gus基因在转基因烟草的根、茎和叶中均表达,在叶中Sgt1p启动子的活性低于CaMV35S启动子,而在根和茎中二者基本相同;光诱导结果显示,光照处理明显增强了Sgt1p::gfp::gus转基因烟草叶片中Sgt1p启动子的活性,表明庄薯3号马铃薯 Sgt1p启动子是一种光诱导型启动子．     

转基因白桦中GUS基因表达的定量分析

以转基因白桦（Betula platyphylla）为材料,采用单酶切结合Southern杂交的方法揭示不同转基因植株中GUS基因的整合拷贝数为1—4个。采用组织化学染色法定性分析不同整合方式转基因白桦植株中GUS基因的表达。结果表明,11个转基因植株中有2株出现了GUS基因沉默,其余植株均有不同水平的GUS表达。在此基础上应用分光光度法定量分析不同拷贝数的GUS转基因白桦中β-葡萄糖醛酸酶活性。结果表明,在11个转基因尢性系中除2个株系的GUS基因沉默外,其它9个转基因植株中GUS酶活力差异明显,但这种差异与GUS基因的拷贝数没有必然联系。     

转基因白桦中GUS 基因表达的定量分析

以转基因白桦(Betula platyphylla)为材料, 采用单酶切结合Southern杂交的方法揭示不同转基因植株中GUS基因的整合拷贝数为1-4个。采用组织化学染色法定性分析不同整合方式转基因白桦植株中GUS基因的表达。结果表明, 11个转基因植株中有2株出现了GUS基因沉默, 其余植株均有不同水平的GUS表达。在此基础上应用分光光度法定量分析不同拷贝数的GUS转基因白桦中b-葡萄糖醛酸酶活性。结果表明, 在11个转基因无性系中除2个株系的GUS基因沉默外, 其它9个转基因植株中GUS酶活力差异明显, 但这种差异与GUS基因的拷贝数没有必然联系。     

甜瓜黄瓜素基因启动子表达载体的构建及分析

该研究构建了由黄瓜素基因5′端310bp启动子序列驱动β-葡萄糖醛酸酶(GUS)报告基因的植物表达载体pPZP-CGN,通过花粉管通道法将植物表达载体pPZP-CGN导入甜瓜,并采用荧光法定量测定转基因植株中GUS活性。结果显示,gus基因在果实中高表达,而在根、茎、叶等组织中表达活性很低,表明黄瓜素基因上游310bp启动子具有指导外源基因在果实中高效特异表达的特性。     

农杆菌介导的苜蓿次级体细胞胚的遗传转化

采用农杆菌菌株GV3101感染子叶期苜蓿体细胞胚来研究苜蓿次级体细胞胚的遗传转化方法。农杆菌菌株GV3101双相载体pCAMBIA2301,此双相载体具有gus报告基因和nptⅡ抗卡那霉素筛选基因。感染的子叶期苜蓿体细胞在75 mg/L卡那霉素筛选压下,经过一系列诱导培养,最终获得转基因植株。然后,通过GUS组织化学定位分析来检测转基因植株不同器官中的GUS表达,并进一步通过PCR和Southern杂交确定转基因的稳定整合和转化率。结果表明转基因植株不同器官均有GUS表达,整合的nptⅡ基因的拷贝数是1~4,获得的转基因植株的转化率是65.82%。     

抗除草剂转基因大豆后代遗传分析

分析了来源于农杆菌介导的4个独立的大豆转化系的后代遗传特性。分别采用种子切片GUS染色方法和除草剂涂抹以及喷洒方法检测gus报告基因和抗除草剂bar基因在后代的表达。其中3个转化系T1代gus基因和bar基因能够以孟德尔方式3：1连锁遗传,说明这2个基因整合在大豆基因组的同一位点。这3个转化系在T2代获得了纯合的转化系,并能够稳定遗传至T5代。有一个转化系在T1代GUS和抗除草剂检测都为阴性,但通过Southern杂交证明转基因存在于后代基因组,显示发生了转基因沉默。为了证明转基因沉默是转录水平还是转录后水平,T1代植物叶片接种大豆花叶病毒（SMV）并不能抑制转基因沉默,说明该转化系基因沉默可能不是发生在转录后水平。     

黑芥子酶基因pyk10根特异启动子在番茄中的验证

黑芥子酶是一类催化芥子油苷水解的同工酶,pyk10是一个在拟南芥根和下胚轴中特异表达的黑芥子酶基因.从拟南芥Columbia生态型基因组中克隆的长度为1 450 bp的pykl0基因启动子片段,以gus基因为报告基因构建了植物表达载体pPykG.通过农杆菌介导法,将pykl0的根特异表达启动子以及gus基因转入了番茄中蔬6号,经PCR检测,转化植株中扩增出pyk10启动子特异性条带.组织化学法检测及定量分析,显示pyk10启动子驱动gus基因在番茄的根部特定表达.     

Pollen viability and transgene expression following storage in honey

Transgenic plants of tobacco andArabidopsis that produce genetically marked pollen, expressing the reporter geneuidA (gusA), were generated to determine whether pollen proteins can be expressed and stable in honey, a potential route by which foreign proteins might enter the wider environment. Hydrated tobacco pollen was found to lose viability rapidly in honey, while pollen in the natural dehydrated form remained viable for at least several days and in some cases several weeks, as determined by FDA staining activity and germinability. Dehydrated pollen was found to be capable of transient foreign gene expression, following microprojectile bombardment, after incubation in honey for at least 120 h. PCR amplification of transgene sequences in pollen of transgenic plants revealed that pollen DNA can remain relatively intact after 7 weeks in honey. GUS enzyme activity analysis and SDS-PAGE of pollen proteins revealed that foreign and native pollen proteins are stable in pollen incubated in honey for at least 6 weeks. We conclude that pollen may represent an ecologically important vector for transgenic protein products.     

DUF784基因在花粉管导向中的功能分析

花粉管导向是高等植物完成双受精过程的重要环节,是受多重信号调控的复杂过程.最近的研究揭示,配子体阶段花粉管导向的诱导信号分子是一类具多态性的富含半胱氨酸的防卫素类似蛋白,如来自玉米的ZmEA1和蓝猪耳草中的LUREs在吸引花粉管进入珠孔起重要作用.但是拟南芥及其它植物中此类信号未知.转录组学分析表明,一组DUF784基因可能在花粉管导向中起到重要作用.通过RNAi技术降低一组DUF784基因的表达,分析发现在RNAi转基因植株中,出现胚珠败育现象,花粉管导向出现异常,一部分花粉管不能进入珠孔.另外,用MYB98基因的启动子携带1个DUF基因的编码区,然后转化ccg突变体,发现ccg转基因株系中胚胎败育率下降,即DUF基因能部分互补ccg突变体的表型;从这两方面证实了DUF784基因在花粉管定向导入过程中的作用.     

转基因白桦外源基因的多重PCR快速检测

根据转化的载体序列上T-DNA中的目的基因bt,选择性筛选标记基因nptⅡ和报告基因gus设计三对特异性引物,PCR产物片断大小分别为247、449、668 bp,应用多重PCR (mutiplex-PCR)的方法同步检测18株转基因白桦中三个基因的整合状况;用阳性对照为模板,对单重PCR（simplex-PCR）和多重PCR的各项指标进行比较。结果表明多重PCR检测多个外源基因在敏感性方面与单重PCR相比并没有减弱,而且略有提高;对18株样品的多重PCR同步检测无假阳性出现,结果准确,同时在操作中具有减少污染,缩短时间和节约成本等优点。因此,在对转基因白桦的外源基因的定期检测中,多重PCR是一种非常有效而便捷的方法,可以为转基因的拷贝数,T-DNA旁侧序列特征等转基因整合特性方面的研究提供数据。     

温度对桃离体花药散粉及花粉萌发的影响

以目前生产栽培较多的‘湖景蜜露’、‘霞晖6号’和‘白凤’3个桃品种为试材,连续2年调查了不同温度处理下花药失水率、花药散粉时间以及花粉离体萌发特性等变化。结果表明：桃花药于相对低温条件下散粉失水率较低,随散粉温度升高失水率相应上升;花药开裂所需时间与处理温度呈相反趋势;3个品种花粉离体萌发率随散粉温度的升高而下降。离体花药在超过30℃的温度条件下散出的花粉在萌发过程中出现花粉管变短、花粉瘪小的概率增多的现象,表明高温促使花药脱水和散粉加快,但降低了花粉活力。在桃树花期以及制备花粉时外界环境温度应控制在30℃以下。     

水分胁迫对澳洲坚果花粉生活力和贮藏性的影响

采集经不同水分胁迫处理的澳洲坚果植株的花粉进行生活力测定和贮藏性研究,结果表明,新鲜花粉生活力随贮藏时间增加而下降。常温下正常发育花粉可保存6d左右,此后萌发率逐渐下降;而处于水分胁迫下的花粉,6d后生活力迅速降低;水分胁迫程度越严重,花粉生活力下降越快。几种处理的花粉有效贮藏期分别是:饱和灌溉处理6d,正常灌溉处理30d,水分亏缺处理10d,严重干旱处理(CK)4d。研究还表明,品种间花粉贮藏性表现为Kau >Pahala >O.C.。澳洲坚果花粉生活力的最佳染色鉴定方法为联苯胺染色法。     

转基因白桦的遗传变异分析

应用细胞学方法分析了由农杆菌介导法获得的转基因白桦的细胞学变异情况,结果表明转基因白桦的染色体变异频率为78.5％,远远高于非转基因白桦的变异频率(15.3％),且变异以非整倍体占多数。同时用RAPD标记方法研究了转基因白桦在DNA水平的变异情况,结果显示DNA多态性指数为31.67,并与其它转基因植物的变异情况作了比较研究。最后分析、讨论了产生变异的原因:(1)组织培养过程中产生突变;(2)外源基因的整合及重排时宿主基因组的插入位点及相邻基因转录表达的干扰;(3)应用抗生素和除草剂等筛选转基因植株时促进了转基因植株的变异程度。并提出减少转基因植物体细胞克隆变异的建议。     

Glutathione-S-Transferase: A Minor Allergen in Birch Pollen due to Limited Release from Hydrated Pollen

Background

Recently, a protein homologous to glutathione-S-transferases (GST) was detected in prominent amounts in birch pollen by proteomic profiling. As members of the GST family are relevant allergens in mites, cockroach and fungi we investigated the allergenic relevance of GST from birch (bGST).

Methodology

bGST was expressed in Escherichia coli, purified and characterized by mass spectrometry. Sera from 217 birch pollen-allergic patients were tested for IgE-reactivity to bGST by ELISA. The mediator-releasing activity of bGST was analysed with IgE-loaded rat basophil leukaemia cells (RBL) expressing human FcεRI. BALB/c mice were immunized with bGST or Bet v 1. Antibody and T cell responses to either protein were assessed. IgE-cross-reactivity between bGST with GST from house dust mite, Der p 8, was studied with murine and human sera in ELISA. The release kinetics of bGST and Bet v 1 from birch pollen were assessed in water, simulated lung fluid, 0.9% NaCl and PBS. Eluted proteins were quantified by ELISA and analysed by immunoblotting.

Principle findings

Only 13% of 217 birch pollen-allergic patients showed IgE-reactivity to bGST. In RBL assays bGST induced mediator release. Immunization of mice with bGST induced specific IgE and a Th2-dominated cellular immune response comparably to immunization with Bet v 1. bGST did not cross-react with Der p 8. In contrast to Bet v 1, only low amounts of bGST were released from pollen grains upon incubation in water and the different physiological solutions.

Conclusion/Significance

Although bGST is abundant in birch pollen, immunogenic in mice and able to induce mediator release from effector cells passively loaded with specific IgE, it is a minor allergen for birch pollen-allergic patients. We refer this discrepancy to its limited release from hydrated pollen. Hence, bGST is an example demonstrating that allergenicity depends mainly on rapid elution from airborne particles.     

Pollen viability as a bio-indicator of air quality

Many air pollutants cause plant deterioration. In this study pollen viability was used as bio-indicator of air quality. The study was carried out in the city of Perugia where road traffic is the most important cause of air pollution. Three areas, with different intensity of road traffic (very high, medium and absent) but all characterized by the presence of the same plant species, were selected. Eight species were studied: Hedera helix L., Convolvulus sepium L., Cynodon dactylon (L.) Pers., Quercus ilex L., Dactylis glomerata L., Parietaria diffusa M. et K., Daucus carota L. and Tilia cordata Miller. The pollen of these species was treated with TTC (2, 3, 5 Tryphenil-Tetrazolium-Chloride) staining solution and viability was then estimated by light microscopy. The results showed that the pollen viability was inversely proportioned with pollution. The highest difference in pollen viability between the areas was registered in Tilia cordata. Quercus ilex instead showed that there was no difference in pollen viability between the three different areas. Parietaria diffusa showed a particular behaviour; the highest pollen viability percentage was in polluted areas. The statistical analysis (ANOVA) showed that the main source of variability of the pollen viability depends on the plant but also the site and the interaction between plant and site were very important with a high significant level (p < 0.0001). This revised version was published online in June 2006 with corrections to the Cover Date.     

甘草花粉超微鉴定及花粉活力、柱头可授性荧光显微镜观察

对甘草的有性生殖特性进行了研究,利用扫描电子显微镜对乌拉尔甘草、光果甘草和胀果甘草花粉的超微结构进行观察,利用荧光显微镜确定乌拉尔甘草的授粉方式、花粉生活力和柱头活性以及授粉后受精时间.结果表明,花粉超微结构为甘草的鉴别提供了一定的形态学依据;甘草的授粉方式属于闭花受精;花粉生活力在每天12:00时最强,去雄后超过4d的柱头已经不具备接受花粉的能力;对授粉后不同时间的雌蕊进行研究得出授粉后6h花粉管进入胚珠进行受精.