铜绿假单胞菌完整细胞a-氨基酸酯水解酶的性质

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) AS 1.204完整细胞a-氨基酸酯水解酶能催化a-氨基酸酯的水解和转移a-氨基酸酯的酰基到胺亲核试剂上。在水解和转移反应中酶的一般性质相同,最适pH为5．2,最适温度都是40℃。7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸(7一ADCA)抑制苯甘氮酸甲酣(PG-Ome)的水解。因此,该酶催化7一ADCA和PG-Ome转化成相应的半合成头孢菌素。     

恶臭假单胞菌JP-1腈水合酶的诱导形成

恶臭假单胞菌JP-1能利用乙腈、丙腈、异丁腈、乙酰胺和丙酰胺作为生长的碳源和氮源。培养液中丙腈的代谢产物经证明是丙酰胺、丙酸和氨。腈水合酶是诱导酶,经丙腈诱导的适应细胞的腈水合酶活力比未适应的细胞高得多。生长细胞用0.3%丙腈诱导14小时后,即具有很高的转化丙烯腈成丙烯酰胺的活力,丙烯腈转化率为90%。除丙腈外,丙酰胺、异丁腈、正丁腈都是腈水合酶的有效诱导物。     

Val22对恶臭假单胞菌扁桃酸消旋酶催化活性的影响

恶臭假单胞菌扁桃酸消旋酶的Val22位于20 s环状结构上, 是与底物结合相关的氨基酸之一。其中Val被替换为Arg后酶活性下降了75.9%。除了酶与底物疏水作用减弱以外, 静电排斥作用增强也可能引起活性的下降。利用分子动力学模拟对酶与底物的米氏复合物进行分析, 结果表明: 突变后第22位氨基酸侧链与底物的静电势从0.036 kJ/mol升高至0.124 kJ/mol。这说明氨基酸侧链极性的改变增加了侧链与底物分子之间的静电排斥作用, 因而静电排斥作用也是导致突变体活性下降的原因之一。同时, 突变后系统势能增加了283 kJ/mol, 进一步证实了第22位氨基酸侧链极性和带电性质的改变导致酶与底物结合状态的势能增大, 从而引起活性大幅下降。因此, 将来对酶的结合口袋区域进行理性设计时, 除了考虑空间位阻效应外, 还需考虑疏水作用和静电作用。     

冷风干燥制备高活菌的恶臭假单胞菌菌粉

【目的】获得高活菌恶臭假单胞菌菌粉,提高菌体干燥及保藏存活率。【方法】选用冷风干燥法制备活菌粉,并优化吸附载体与保护剂。【结果】冷风干燥制备恶臭假单胞菌菌粉干燥存活率普遍达到65%以上,显著优于喷雾干燥(24%);对载体与保护剂进行正交试验优化,确定了载体为混合的硅藻土和碱处理玉米芯粉,混合比为1:2,保护剂(质量比)为甘露醇7%、谷氨酸钠5%、甘油1%,制得菌粉活菌数为1.03×1011 CFU/g,室温保藏30 d和4 °C保藏60 d存活率分别达到40.54%和71.67%。【结论】冷风干燥温度相对较低(10?40 °C),对菌体损伤小,碱处理玉米芯粉、甘露醇和谷氨酸钠是提高菌粉保藏存活率的重要因子,此法克服了革兰氏阴性菌菌粉不易制备和不耐保藏的瓶颈。     

恶臭假单胞菌腈水合酶βAla97影响催化己二腈的区域选择性

对恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)腈水合酶(Pp NHase)催化己二腈进行研究,发现Pp NHase只能催化己二腈中1个氰基生成单酰胺产物5-氰基戊酰胺,具有区域选择性;睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)腈水合酶(Ct NHase)能催化己二腈直接生成己二酰二胺,不具有催化区域选择性。为了阐明这一区域选择性差异的机制,对Ct NHase和Pp NHaseβ亚基的氨基酸序列进行比对,结果显示同源性为94.1%,Ct NHase存在βAla97缺失。基于此分析,构建了Pp NHaseβ97位Ala的缺失突变体(ΔAla97)。利用高效液相色谱检测ΔAla97催化己二腈的产物,发现ΔAla97能将底物完全催化为己二酰二胺,表明βAla97是影响催化己二腈由5-氰基戊酰胺向己二酰二胺转化的关键氨基酸。     

恶臭假单胞菌丙氨酸消旋酶基因的克隆、序列分析及表达

从恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)200的基因组出发,用PCR方法克隆到两个独立作用的丙氨酸消旋酶基因,称之为dadX和alr。DadX编码357个氨基酸长的多肽,计算分子量为38.82kDa,alr编码409个氨基酸长的多肽,计算分子量为44.182kDa。序列分析显示,DadX的氨基酸序列与Pseudomonas putidaKT2440,铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa),鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和大肠杆菌(Escherichia coli)的DadX比较,相似性分别为96.64%、71.99%、44.88%和47.37%。Alr的氨基酸序列与Pseudomonas putidaKT2440比较,同源性为94.38%,而与铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)和大肠杆菌(E.coli)的Alr比较,同源性均较低,分别为22.89%、25.72%和26.44%。在P.putida200的DadX和Alr氨基酸序列中部发现有对于酶活性至关重要的保守区域,如磷酸吡哆醛(PLP)结合位点。DadX和alr在大肠杆菌中得到表达,DadX丙氨酸消旋酶只对丙氨酸有消旋作用,而Alr丙氨酸消旋酶可以作用于丙氨酸和丝氨酸两种底物,且对丝氨酸特异性更高。Alr的表达不依赖于外源启动子,说明在其结构基因上游存在启动子结构。     

假单胞菌胞外酶降解黄曲霉毒素B1的酶学性质

[背景]黄曲霉毒素B1(AflatoxinB1,AFB1)毒性强、污染普遍,目前尚无有效的防治办法.[目的]为了发掘高效的AFB1降解菌并探索其降解特性,对红树林污泥样品中一株AFB1降解菌株(HAI2)的酶学性质进行分析.[方法]以AFB1结构类似物为唯一碳源,筛选出一株高效的AFB1降解菌,利用16SrRNA基因测...     

镍对荚膜红假单胞菌氢酶和固氮酶活性的促进作用

本文报道了过渡金属镍离子对荚膜红假单胞菌(Rhodopseudomonas capsulata)菌株N3氢酶吸氢活性和固氮酶乙炔还原活性的促进作用,当培养基内的镍离子浓度为IμM时,生长菌体的氢酶具有最大的吸氢活性,但镍离子对固氮酶活性的最适浓度为5pjIfo镍离子加入到整体细胞或无细胞提取液中,对氢酶话性无促进作用。镍离子加入到整体细胞中,固氮酶活性也没有被促进。其它一些过渡金属离子,例如Co2+、Cu2+、Zn2+什对氢酶和固氮酶活性均无促进作用。无论有无镍离子存在,螯合试剂。O-phenanthroline 和EDTA 对生长菌体的氢酶和周氮酶的活性均有少量的抑制作用,基于以上试验结果,对Ni2+参与Rps. Capsulata 氢酶蛋白质合成以及有关作用机理进行了讨论。     

一株广泛耐药恶臭假单胞菌耐药机制研究

目的研究一株临床分离广泛耐药恶臭假单胞菌(extensively drug resistant Pseudomonas putida,XDR-PP)的耐药机制,以期指导临床合理使用抗菌药物。方法采用VITEK-2compact全自动微生物分析系统对菌株进行鉴定及药敏试验;改良Hodge试验初筛碳青霉烯酶;EDTA-亚胺培南协同试验和亚胺培南双纸片增效法初筛金属酶;PCR检测16SrRNA甲基化酶基因、金属β-内酰胺酶基因及可移动性遗传元件基因,产物测序,结果经BLAST软件比对分析。结果该菌株对所检测的抗菌药物均耐药。改良Hodge试验、EDTA-亚胺培南协同试验和亚胺培南双纸片增效法结果均为阳性。基因检测结果显示,金属β-内酰胺酶基因阳性的有blaVIM-2和blaIMP-4两种基因,16SrRNA甲基化酶基因阳性的有armA基因,13种可移动性遗传元件中,intI、tnpU和merA基因阳性,其余均为阴性。结论blaVIM-2、blaIMP-4、armA、intI、tnpU以及merA基因是导致其广泛耐药的重要机制。恶臭假单胞菌中同时检出blaVIM-2和blaIMP-4两种金属β-内酰胺酶基因及armA基因为国内首次报道。     

恶臭假单胞菌HspB的单晶培养及结晶条件优化

为了获得可用于X射线衍射的恶臭假单胞菌尼古丁代谢途径中关键单加氧酶Hsp B的单晶。定点突变PCR构建重组质粒,大肠杆菌中诱导表达,镍柱亲和层析、烟草蚀纹病毒(Tobacco etch virus,TEV)蛋白酶酶切和凝胶过滤层析纯化,悬滴扩散法进行结晶。成功构建重组质粒并获得高表达;比较了TEV蛋白酶柱上及透析酶切的效率,TEV蛋白酶透析酶切效率更高;确定了该纯化路线,获得电泳纯级的Hsp B蛋白。结晶条件初筛和正交优化后获得可培养Hsp B蛋白单晶的条件为22%PEG3350、0.1 mol/L Bis-Tris p H6.5、0.21 mol/L Mg Cl2、18℃、1?50比例加晶种。去除标签后的Hsp B蛋白获得了分辨率1.8?的单晶。     

假单胞菌碱性木聚糖酶的纯化及性质

假单胞菌(Pseudomonas)G62可产生两种胞外木聚糖酶,即XynA和XynB。经过硫酸铵沉淀、阴离子和阳离子交换层析、分子筛色谱,最终得到 两种电泳纯酶。XynA的分子量及等电点分别为42kD和91,XynB的分子量和等电点分别是 20kD和88。经薄层色谱分析证明,两酶以不同的方式水解木聚糖,但都不产生木糖,即 两酶都为内切酶,它们的最适作用温度均为50℃。XynA的最适作用pH为7.0～9.8,而XynB的为7.0～7.5。在65℃时的半寿期XynA为6 min,XynB为140 min。XynA的Km和Vmax分别是5.56 mg·ml-1和543μmol·min-1·mg-1,XynB的Km和Vmax分别是7.72 mg·ml-1和819μmol·min-1·mg-1。两酶受Cu2+、Fe3+、Pb2+、Zn2+和Hg2+强烈抑制。化学修饰的初步结果表明,两酶的活性位点氨基酸均含有色氨酸和羧基氨基酸。     

红假单胞菌H菌株生长细胞光照放氢条件的研究

本文报道红假单胞菌属（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｈ菌株光照放氢的主要条件。结果表明,Ｈ菌株除利用苹果酸外,还可以利用葡萄糖、丁酸钠、乳酸钠等底物光照放氢,尤以葡萄糖产氢量较高。Ｈ菌株光照放氢的适宜ｐＨ为７．０,与细胞生长最适ｐＨ值一致。可以明显地抑制生长细胞放氢,在气相完全为Ｎ_２条件下,Ｈ菌株仍能以较高速率光照放氢。Ｈ菌株光照放氢的适宜温度为３０℃。空气能抑制光照放氢,加入一定浓度的Ｎａ_２Ｓ可以缓解这种抑制作用。     

恶臭假单胞菌S1产胞内海藻糖合成酶发酵培养基的优化

采用摇瓶发酵法研究了不同碳源、氮源对恶臭假单胞菌S1干重和胞内海藻糖合成酶酶活力的影响。通过正交试验得出其最佳培养基配方为(g.L-1):葡萄糖25,玉米浆15,麦芽糖20,豆粕水解液10 mL.L-1,Na3C6H5O7.2 H2O 0.5,Na2HPO4.12 H2O 0.5。优化后菌体密度、单位细胞产酶活力分别提高了1.44倍和72.16%。     

热激对恶臭假单胞菌S1胞内海藻糖合成酶的影响

研究了热激对恶臭假单胞菌S1胞内海藻糖合成酶的影响。通过正交试验确定了热激的最佳条件:热激在产酶初期(培养20 h)进行,热激时培养温度由20℃升高至30℃,处理时间30 min。在此条件下,海藻糖合成酶的酶活提高了76%。同时在热激后菌体的耐盐性也有较大增强。     

产碱假单胞菌脂肪酶的克隆表达及酶学性质研究

【目的】克隆产碱假单胞菌的脂肪酶基因,实现其在大肠杆菌中异源表达并进行酶学性质研究。【方法】通过基因文库构建和PCR,获得脂肪酶基因,并以pET30a(+)为表达载体、E.coli BL21(DE3)为宿主菌,在大肠杆菌中进行异源表达,表达产物经HisTrapTM亲和层析柱纯化后进行酶学性质研究。【结果】从产碱假单胞菌中克隆得到一个脂肪酶基因,大小为1 575 bp(GenBank登录号为JN674069)。该酶分子量为55 kD,最适底物为p-NPO,最适反应温度和pH分别为35°C、pH 9.0。重组酶经1 mmol/L的Cu2+处理30 min可使酶活提高至156%。在最适反应条件下重组酶的比活力为275 U/mg,Km和Vmax分别为80μmol/L和290 mmol/(min.g protein)。【结论】产碱假单胞菌脂肪酶基因的克隆与表达不仅积累了脂肪酶基因的资源,并为其在手性拆分中的应用奠定基础。     

沼泽红假单胞菌乙酸光合放氢研究

依据光合细菌生长代谢特性和有机废水降解主要产物类型,11种有机物被用于沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas palustris）Z菌株的光合产氢研究,其中,乙酸反应体系产氢活性最高。在此基础上,研究了该菌株的生长与产氢动力学行为,探求了影响该菌株光合放氢的主要限制性影响因素。结果表明,该菌株产氢与生长部分相关。种子培养基和菌龄对产氢活性有明显影响。细胞最适产氢和生长所需要的光照强度和温度基本一致。当种子来源于硫酸铵高菌龄预培养物或谷氨酸钠对数期预培养物时,该菌株产氢活性显著增加,产氢延滞期明显缩短。氧浓度和接种量对产氢活性也有显著影响。供氢体和氮源浓度直接决定细胞的生长与光放氢活性。在低于70 mmol/L乙酸钠和15 mmol/L谷氨酸钠时,产氢活性随底物浓度的增加而增强。谷氨酸钠浓度高于15mmol/L时,由于游离NH₄⁺的出现,产氢活性受到抑制,但却明显刺激细胞的生长。在标准状况下,该菌株的最大产氢速率可达19.4 mL·L^-1·h^-1。