光棘球海胆seali基因克隆及表达特性分析

seali基因隶属于PIWI超家族,其编码的RNA结合蛋白在生殖细胞发育过程中发挥重要作用。研究经同源比对从光棘球海胆(Mesocentrotus nudus)性腺转录组数据库中筛选得到seali基因片段,随后通过cDNA末端快速扩增技术(Rapid amplification of cDNA ends, RACE),获得其全长cDNA序列。光棘球海胆seali基因cDNA全长3462 bp,其中3′UTR长度为416 bp, 5′UTR长度为180 bp,其中3′UTR的加尾信号并非经典的AAUAAA或AUUAAA,而是较少见的AAUACA。开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)2862 bp,编码954个氨基酸,具有保守的PIWI和PAZ结构域,多重序列比对和系统进化分析结果表明其属于Argonaute家族的PIWI亚家族成员。荧光定量PCR技术检测结果表明, Mnseali基因在光棘球海胆性腺、肠、管足和体腔细胞中均有表达,在性腺中表达量最高。此外, Mnseali基因为母源因子,在整个胚胎发育时期均有表达。在卵巢中,随着卵母细胞的成熟, Mnseali的表...     

鳜鱼MDA5基因的克隆与组织表达分析

目的:克隆鳜鱼MDA5基因cDNA序列,研究聚肌苷酸胞苷酸[Poly(I∶C)]感染过程中MDA5的表达规律。方法:利用RT-PCR和RACE技术克隆鳜鱼MDA5全长序列,构建Poly(I∶C)感染模型,分析MDA5在鳜鱼脾脏和鳃组织中的表达规律。结果:鳜鱼MDA5 cDNA全长3556 bp,包括142 bp 5′UTR、438 bp 3′UTR和2976 bp开放读框,共编码991个氨基酸残基。MDA5蛋白具有RLR家族的典型特征,即N端含有2个CARD结构域,C端含有DEXDc、解旋酶和RD结构域,序列分析发现鳜鱼的MDA5与横斑石鲷、大黄鱼的同源性较高,分别达85.4%、79.8%。组织表达谱分析显示,鳜鱼MDA5基因在不同组织中普遍表达,用Poly(I∶C)抗原刺激后,MDA5 mRNA表达显著上调,其中脾脏组织在诱导8 h后达到峰值,而在鳃组织中表达持续显著上调。结论:MDA5在鳜鱼免疫应答中起重要作用。     

新疆盐穗木GRAS转录因子基因克隆及表达分析

利用抑制消减杂交法从藜科盐穗木属盐生植物盐穗木中分离得到了一个盐胁迫响应的表达序列标签(EST)片段,结合SMARTTMRACE技术获得了盐穗木GRAS转录因子基因的cDNA。序列分析表明,该基因全长2 090bp,含有1 635bp的阅读框,294bp的5′-UTR和161bp的3′-UTR,编码544个氨基酸,分子质量为61.503kD,理论等电点为6.1。系统进化树和Blast同源序列比对分析结果显示,该基因编码的蛋白具有GRAS家族特有的C端保守结构域,并与葡萄GRAS家族蛋白VvSCL13聚集在一起,故将该基因命名为HcSCL13(GenBank登录号KC68640)。实时荧光定量qRT-PCR分析表明,HcSCL13基因在盐胁迫后表达呈明显上调,初步推测Hc-SCL13基因可能与盐穗木的耐盐性相关。     

一个新的家蚕转录相关锌带蛋白基因的克隆及序列分析

锌带蛋白(zinc ribbon protein )是锌指类蛋白的一种,它的Cys4 Zn(2+)结合位点由3个β₂片层折叠而成,而不是α螺旋结构。锌带结构与锌指结构同为转录因子结合核酸的结构域,锌带蛋白作为转录相关因子在调节基因表达活性等方面具有重要作用。在对家蚕 Bombyx mori蛹cDNA文库测序中,发现一个新的编码家蚕锌带蛋白基因的EST序列（GenBank 登录号DY230964）,以此序列为信息探针检索家蚕EST数据库,通过同源筛选,获得一个新的家蚕锌带蛋白基因cDNA全序列并经RT-PCR检测和克隆、测序验证,结果表明与电子克隆序列完全一致。我们将其命名为 BmZNRD1 (Zinc Ribbon Domain Containing 1)（GenBank登录号DQ432055）。该基因全长为675 bp,由363 bp的开放阅读框序列(ORF)、10 bp的5′端非翻译区序列(5′UTR)和302 bp 的3′端非编码区序列(3′ UTR)组成,其编码的120个氨基酸序列与其他真核生物间具有较高的同源性（达60%左右）,预测分子量为13.54 kD, 等电点为6.8。BmZNRD1编码的氨基酸序列是一种锌带蛋白,推测有2个功能结构域,分别是位于N-端的Cx₂Cx₁₄Cx₂C和C-端的Cx₂Cx₂₄Cx₂C,其中C-端保守氨基酸序列Cx₂Cx₆Yx₃QxRSADEx₂TxFx₂Cx₂C在生物进化中保守性很高,从酵母、果蝇、线虫到两栖类、哺乳类都有发现该结构域的存在,与酵母RNA聚合酶A亚单位9和转录相关蛋白有很高的相似性,推测其具有相同的功能。将BmZNRD1基因cDNA序列与家蚕基因组序列进行比对,结果表明该基因具有3个外显子,2个内含子,外显子/内含子边界符合经典的GT-AG规则。 关键词： 家蚕; 锌带蛋白基因; 电子克隆; 基因克隆; 序列分析     

陆地棉SUPERMAN类似锌指蛋白基因的克隆与表达分析

锌指蛋白是生物体内数量最多的转录调控因子,它在动植物的生长发育中都起到十分重要的作用。SUPERMAN类锌指蛋白只含有1个锌指结构。我们根据这类蛋白的保守结构域设计简并引物,通过RT-PCR从棉花中获得了3个这个家族成员的EST,得到1个锌指蛋白基因的全长序列,该基因的编码区长744 bp,编码长248个氨基酸的多肽,其氨基酸序列与GenBank中登录的一个拟南芥RBE蛋白有40%的同源性。此基因被命名为GZFP。它含有保守的锌指结构并在多肽链的C-端具有富含亮氨酸的保守结构域,GZFP含有核定位信号并且没有内含子。GZFP基因在棉花花蕾、子房、花瓣和根中的表达量要高于木质部、韧皮部、叶片、纤维和种子。GZFP基因的表达量很低,在GenBank中没有任何和它同源的EST序列存在。对GZFP 5′侧翼区进行分析发现有数个花粉和根特异表达相关元件,4个与Dof蛋白作用的核心序列,4个与光诱导相关的元件。      

中国对虾蜕皮抑制激素全长cDNA的克隆及序列分析

对虾的蜕皮活动由蜕皮抑制激素和蜕皮激素调控,蜕皮抑制激素是甲壳动物CHH家族神经肽的成员之一,通过抑制Y器官蜕皮激素的合成而调节蜕皮,以中国对虾（Fennropenaeus chinensis）眼柄总RNA为材料,采用cDNA末端快速扩增（RACE）方法。首次得到蜕皮抑制激素的全长cDNA（GenBank登录号：AF469187）。该全长cDNA大小为697bp,是由320bp的3′RACE产物和468bp的5′RACE产物拼接而成,Blast搜索结果显示,该全长cDNA与甲壳动物的MIH基因序列具有较高的相似性,用Clustal X进行多序列比较结果表明,由该全长cDNA推导的氨基酸序列与对虾类的MIH的氨基酸序列同源性最高,其中与日本对虾,斑节对虾,刀额新对虾MIH的同源性分别为95.1%,83.1%,79.1%,根据以上数据,推断该697bp的全长cDNA为编码中国对虾MIH前体的cDNA。进一步序列分析表明,编码中国对虾MIH前体cDNA包括312bp的开放阅读框,81bp的3′UTR和302bp的5′UTR;编码103个氨基酸的MIH前体分子包括信号肽和成熟肽,信号肽由28个氨基酸组成,成熟肽由75个氨基酸组成,成熟肽中6个半胱氨酸非常保守。     

马氏珠母贝galectin-4基因cDNA的克隆及表达分析

半乳糖凝集素(Galectins)属于一种多功能凝集素家族,在机体抵抗微生物的感染中起重要作用。本研究利用cDNA末端快速扩增(rapid-amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆获得马氏珠母贝galectin-4(PmGal-4)基因cDNA的全长,并对其序列进行分析。PmGal-4基因cDNA全长1 071 bp,5′非翻译区(5′UTR)长75 bp,3′非翻译区(3′UTR)长72 bp;其开放阅读框(open reading frame,ORF)长度为924 bp,编码307个氨基酸组成的前体肽,理论分子量约为34.6 kD,理论等电点为8.80。多序列比对结果显示各物种间galectin-4具有高保守性。序列分析结果显示PmGal-4的氨基酸序列具有典型富含半胱氨酸(cysteine-rich domain,CRD)的结构域。实时荧光定量PCR分析表明,PmGal-4基因在马氏珠母贝所检测的组织中呈组成型表达特征,但在闭壳肌和外套膜中表达量最高。上述结果表明PmGal-4基因可能参与了马氏珠母贝多种生理功能,特别是在免疫防御反应中具有重要的作用。     

西伯利亚蓼rd22基因的克隆与序列分析

以3% NaHCO₃溶液胁迫处理48 h的西伯利亚蓼为试材,利用RACE技术,从其茎部组织克隆了脱水应答蛋白RD22的全长cDNA序列。测序后的结果分析表明,该cDNA序列全长为1 302 bp,5′非翻译区为59 bp,3′非翻译区为25 bp,开放读码框为1 218 bp,编码405个氨基酸。在氨基酸序列的C端含有一个比较保守的BURP结构域,N端含有5个重复序列THV-VGKGGV-V。信号肽检测证明该蛋白为分泌性蛋白,前21个氨基酸区域为信号肽结构。其推演的氨基酸序列与葡萄的同源性最高,达到60%。该基因已在GenBank上注册,基因序列登录号为DQ836050。     

大鼠脑特异基因rRP58的克隆及定位分析

EST（AW055733）是在SD大鼠脑内一特异表达基因cDNA的3′端片段,与人和小鼠的一个转录抑制因子基因（RP58）同源,利用RT-PCR的方法,从SD大鼠脑中得到rRP58基因两个不同长度的转录本,全长的rRP58基因编码产物为C2H2型锌指蛋白,含两个保守结构域;氨基端的POZ结构域及羧基端的锌指结构域（ZFD）。在POZ和ZFD结构域之间的序列,BLAST搜索未发现保守结构。但是富含酸性氨基酸残基,将编码ZFD结构域（nt1033-1569)及POZ结构域（nt1-372)的序列克隆到原核表达载体pQE30中,表达并分离纯化了His6-ZFD和His6-POZ（融合了6个组氨酸标签的蛋白质产物）。用His6-ZFD和His6-POZ免疫兔子后,得到了ZFD和POZ两者的多克隆抗体,并利用所制备的抗体进一步分析了rRP58基因多转录本产物在大鼠中的组织分布,免疫组织化学实验结果显示rRP58蛋白主要分布在小脑颗粒细胞中。     

家蚕Piwi亚家族基因的克隆、表达及进化分析

为克隆家蚕Bombyx mori Piwi亚家族蛋白基因cDNA全长序列,分析其分子特征和表达模式,探究Piwi亚家族蛋白在家蚕中的生理功能,本研究利用已知物种的Piwi亚家族蛋白搜索家蚕基因组,预测获得家蚕Piwi亚家族蛋白基因siwi1和siwi2,采用RACE技术克隆siwi1和siwi2的全长cDNA序列,利用ORFfinder、Gene-Explorer、InterPro等分析其分子特征;其次,利用已知的所有物种Piwi蛋白及其类似物Piwil构建系统发育树;最后,通过荧光定量PCR技术检测了siwi1和siwi2在丝腺、马氏管、中肠、头部、卵巢和精巢以及不同发育时期(卵、1～5龄幼虫、蛹、成虫)的表达水平,结果显示,克隆获得了siwi1 cDNA全长3 277 bp,包含部分5′UTR、完整的开放阅读框ORF和3′UTR,获得了siwi2的部分序列,其中siwi1对应BmPiwi,siwi2对应BmAgo3。系统发育结果显示,家蚕Piwi亚家族蛋白与乳草长蝽Oncopeltus fasciatus、黑腹果蝇Drosophila melanogaster、橘小实蝇Bactro...     

新基因水稻 OsLSD1 的克隆及拟南芥和水稻类 LSD1 基因家族的生物信息学分析

类 LSD1 (LSD1-like) 基因家族是一类特殊的 C2C2 型锌指蛋白基因,编码植物特有的转录因子 . 目前已经研究的 2 个成员拟南芥 LSD1 (lesions stimulating disease resistance 1) 和 LOL1 (LSD-One-Like 1) 基因均参与植物细胞程序化死亡 (programmed cell death, PCD) 的调控 . 从水稻 cDNA 文库中克隆到 1 个类 LSD1 基因,命名为 OsLSD1. 该基因长 988 bp ,包含一个 432 bp 的开放阅读框,推导的氨基酸序列 (143 个氨基酸 ) 含有 3 个内部保守的锌指结构域 . DNA 印迹结果表明 OsLSD1 基因在水稻基因组中为单拷贝,且在根、茎和叶中表达 . 借助于生物信息学分析技术,从拟南芥和水稻数据库中各识别出 5 个和 7 个 ( 包括 OsLSD1) 类 LSD1 基因 . 分析了这些类 LSD1 基因的结构,蛋白质结构域组成 . 系统进化分析表明,无论基于编码区的核苷酸或氨基酸序列都可以将这些类 LSD1 基因分为 2 类 . 虽然不存在拟南芥或水稻特有的类 LSD1 蛋白,但有些结构域是水稻所特有的,也有些基因是来源于复制事件 .     

Cloning and characterization of a novel human gene encoding a zinc finger protein with 25 fingers

This study reports cloning and characterization of a human cDNA encoding a novel human zinc finger protein, ZFD25. ZFD25 cDNA is 6118 bp long and has an open reading frame of 2352 bp that encodes a 783 amino acid protein with 25 C2H2-type zinc fingers. The ZFD25 cDNA also contains a region with high sequence similarity to the Krüppel-associated box A and B domain in the 5'-untranslated region, suggesting that ZFD25 belongs to the Krüppel-associated box zinc finger protein family. The ZFD25 gene was localized to chromosome 7q11.2. Northern blot analysis showed that ZFD25 was expressed in a wide range of human organs. In cultured endothelial cells, the mRNA level was decreased upon serum starvation.     

Characterization of two novel KRAB-domain-containing zinc finger genes, ZNF460 and ZNF461, on human chromosome 19q13.1-->q13.4

This study reports the cloning and characterization of two novel human zinc finger protein cDNAs (ZNF460 and ZNF461) from a fetal brain cDNA library. The ZNF460 cDNA is 3,135 bp in length encoding a 562-amino-acid polypeptide and the ZNF461 cDNA is 2,548 bp encoding a 563-amino-acid protein. Both of the proteins contain a KRAB A+B box and eleven C2H2 type zinc finger motifs. ZNF461 shows high similarity with the rat GIOT-1 gene (GIOT1). The ZNF460 gene mapped to 19q13.4 with 3 exons, and ZNF461 mapped to 19q13.1 with 6 exons. Both of the two genes are ubiquitously expressed in normal human tissues and the abundance of the ZNF460 mRNA is relatively low.