压力条件下真核模式生物核小体移动模式研究

细胞在面对外界压力(热冲击)时会通过重塑核小体以应对环境变化。本文通过对热冲击前后酵母核小体位置实验数据、体外实验数据进行统计、比较、分析后,发现在没有任何生理扰动下,核小体的定位跟其DNA偏好性有关。但在环境压力下,对热冲击敏感的上表达基因上的核小体位置呈现出一种发散模式,而下表达基因上的核小体位置则呈现一种收敛模式,此外,保守基因上的核小体位置几乎不发生移动。总体上,在热冲击下处于基础表达状态的基因则呈现出一种弱收敛模式。     

果蝇胚胎期不同表达模式基因转录起始位点上游核小体的定位

在研究果蝇胚胎期核小体定位时,发现不同表达模式基因上的核小体定位特征有着很大的差异。与以往研究结果不同的是,在果蝇胚胎期限制性表达基因的转录起始位点上游-1核小体位置上存在着H2A.Z核小体。有趣的是,与单细胞酵母基因上的核小体定位相比较发现,果蝇胚胎期限制性表达基因上的核小体排列与酵母极其相似。     

基于DNA弯曲度的H2A.Z核小体定位与修饰研究

在真核生物染色质中,H2A.Z是高度保守的组蛋白变异体,与转录调控、基因组的稳定性密切相关。为了探讨组蛋白修饰、DNA弯曲度与H2A.Z核小体定位三者之间的关联,在得到实验所测的相关数据后,利用MINE算法并结合皮尔逊相关系数在酵母全基因组的转录起始位点周围探讨了三者间的线性与非线性关系。其中MIC算法可以定量的得出数据之间关联度大小的值,用于衡量数据之间是否存在着关联,而皮尔逊相关系数则用于检查是否为线性关联。结果除了发现大部分组蛋白修饰种类和核小体定位之间存在着线性关联外,还探测到有两种组蛋白修饰数据(H4ac修饰与GCN4修饰)和核小体定位数据之间存在着以往未发现的非线性关系(大致呈正余弦函数),并从数据的生物背景(组蛋白修饰与核小体位置)上探讨了出现非线性现象的原因。     

基于DNA变形能的核小体定位预测方法研究进展

真核细胞中,作为染色质基本结构单元的核小体参与调控基因的转录、DNA复制、重组以及RNA剪接等诸多生物学过程。阐明核小体定位机制并准确预测核小体在染色体上的位置对解读染色质结构与功能有重要生物学意义。在过去30多年时间里,研究人员发展了多种预测核小体位置的方法。最理想的方法应考虑DNA序列、组蛋白修饰和染色质重塑等影响核小体定位的诸多因素,然而现实中,捕捉主要因素的模型也往往具有很高的鲁棒性和实用价值。DNA序列偏好性是在全基因组尺度上影响核小体定位的最重要因素之一,因此基于DNA序列的核小体定位预测方法也最常见。这种方法可大致分为两类,即基于DNA序列信息的生物信息学模型和基于DNA变形能的生物物理学模型。本文重点介绍生物物理学模型近些年取得的主要进展。     

核小体定位模式及其与DNA甲基化位点分布的关系

核小体定位是指DNA双螺旋相对于组蛋白八联体的位置.核小体定位通过限制蛋白结合位点参与基因转录调控.本文利用实验检测的人类CD4+ T细胞核小体定位数据,研究了核小体定位在转录因子结合位点(TFBS)和转录起始位点(TSS)附近的分布模式,并分析了在TFBS和TSS周围,核小体定位与DNA甲基化之间的关系.结果表明,在休眠和激活的人类CD4+ T细胞中,部分TFBS和TSS周围的核小体定位在动态改变,即在定位和缺失两种状态之间切换.在TFBS周围,核小体定位和DNA甲基化存在一种互补模式,核小体定位与DNA低甲基化相联系;而在TSS周围,两者呈现同步模式,DNA高甲基化伴随高核小体水平.而且,在TFBS和TSS周围,DNA甲基化位点的分布呈周期模式.CD4+ T细胞被激活时,较少的转录因子启动了较多的基因.     

核小体及染色质修饰的基因组分布模式和染色质状态

染色质是真核DNA的存在方式,可以通过影响DNA的可及性调节基因转录,其基本单元为核小体,系由约147 bp的DNA缠绕在组蛋白八联体上形成的结构,核小体之间以连接DNA相连．核小体组蛋白上能发生甲基化和乙酰化等化学修饰．核小体位置、DNA的甲基化和组蛋白的修饰等对染色质状态(常染色质或异染色质)及基因组之间的长程相互作用有重要影响．近年,基于高通量测序技术,核小体位置和染色质修饰在多种细胞中的基因组分布已被测定．结果显示,这些标记的分布模式具有位点特异、动态变化、相互偶联和高度复杂的特征．本文详细回顾并评述了核小体位置和染色质修饰的分布模式、对应生物学功能、修饰之间的关联、实验测定技术、染色质状态的计算分析等内容．该工作对于深入认识和理解染色质的表观遗传调节机制有重要意义．     

体外组装含有组蛋白变体H2A.Z及H3.3的核小体

核小体是构成真核生物染色质的基本结构单位,组蛋白变体H2A.Z及H3.3对染色质结构及基因转录过程发挥着重要的调控作用。体内研究核小体及染色质结构受到诸多因素限制,体外重构含有H2A.Z及H3.3的核小体结构是研究与组蛋白变体相关基因表达调控的重要方法之一。实验表达纯化了6种组蛋白,在复性的过程中装配了含有H2A.Z和H3.3的组蛋白八聚体。基于DNA序列10bp周期性及序列模体设计了3条易于形成核小体的DNA序列,通过PCR大量扩增的方法,回收了标记Cy3荧光分子的目的 DNA序列。采用盐透析法体外组装了含有H2A.Z和H3.3的核小体结构,利用荧光标记、EB染色及考马斯亮蓝染色检测了含有组蛋白变体的核小体形成效率及形成过程的吉布斯自由能变化。结果发现,设计的3条DNA序列可以有效地组装形成含有组蛋白电梯的核小体结构,而且随着组蛋白八聚体与DNA比例的增加,核小体的形成效率显著提高;采用Cy3荧光标记可以灵敏且定量地计算组装过程的吉布斯自由能。该方法的建立对研究组蛋白变体相关的结构生物学及转录调控等具有一定的意义。     

技术与方法体外组装含有组蛋白变体H2A.Z及H3.3的核小体

核小体是构成真核生物染色质的基本结构单位,组蛋白变体H2A.Z及H3.3对染色质结构及基因转录过程发挥着重要的调控作用。体内研究核小体及染色质结构受到诸多因素限制,体外重构含有H2A.Z及H3.3的核小体结构是研究与组蛋白变体相关基因表达调控的重要方法之一。实验表达纯化了6种组蛋白,在复性的过程中装配了含有H2A.Z和H3.3的组蛋白八聚体。基于DNA序列10bp周期性及序列模体设计了3条易于形成核小体的DNA序列,通过PCR大量扩增的方法,回收了标记Cy3荧光分子的目的DNA序列。采用盐透析法体外组装了含有H2A.Z和H3.3的核小体结构,利用荧光标记、EB染色及考马斯亮蓝染色检测了含有组蛋白变体的核小体形成效率及形成过程的吉布斯自由能变化。结果发现,设计的3条DNA序列可以有效地组装形成含有组蛋白电梯的核小体结构,而且随着组蛋白八聚体与DNA比例的增加,核小体的形成效率显著提高;采用Cy3荧光标记可以灵敏且定量地计算组装过程的吉布斯自由能。该方法的建立对研究组蛋白变体相关的结构生物学及转录调控等具有一定的意义。     

核小体定位与RNA剪接

根据核小体定位序列和缺失序列的碱基分布特征,应用多样性增量二次判别方法(IDQD)构建模型对这两类序列进行了区分,受试者操作特性曲线下的面积达到了0.958．应用这一模型研究了核小体在人类基因组剪接位点(GT/AG)邻近序列中的分布方式,发现外显子所对应的DNA序列通常倾向参与核小体的形成,并且由它所转录的RNA统计上具有较强的刚性,而剪接位点及其邻近的内含子对应的DNA序列则避免参与核小体的形成,所转录的RNA统计上具有较强的柔性．进一步还发现,DNA序列的核小体定位/缺失和RNA的刚性/柔性具有统计相关性,为从机制上解释为何前体RNA剪接事件与DNA序列中的核小体定位信息有关提供了依据．     

基于遗传算法酵母核小体定位性质预测

在DNA序列上,定位模糊的特殊核小体与定位良好的普通核小体同时存在于染色体区域内,但由于二者的化学性质差异不明显,区分较为困难。本文针对实验核小体在真核基因转录起始位点周围的分布规律和保守性建立了一个核小体分布模型,并在前人所做的预测核小体位置的工作基础上,利用遗传算法寻找模型上不同性质核小体的分布中心,构建核小体定位性质判别准则,最终确定了转录起始位点上、下游定位良好和模糊核小体的位置。     

基于组蛋白甲基化信息的H2A.Z和H2A核小体识别

组蛋白H2A的变体H2A.Z在基因的表达过程中发挥着重要的作用。根据H2A.Z和H2A核小体中组蛋白甲基化修饰方式的不同,作者应用多样性增量二次判别方法(increment of diversity with quadratic discriminant,IDQD)成功地对H2A.Z和H2A核小体进行了识别,说明了以组蛋白甲基化信息作为特征参数的IDQD模型对H2A.Z和H2A核小体识别的有效性。通过计算DNA序列的柔性,发现H2A.Z核小体对应的DNA序列的平均柔性比常规H2A核小体对应的DNA序列的平均柔性弱。     

酿酒酵母核小体定位理论模型的体外实验验证

核小体定位对真核生物基因表达调控发挥着重要作用。前期基于核小体核心及连接区域的k-mer频次分布偏好性,构建了位置权重矩阵算法,并在酿酒酵母基因组内较好地预测了核小体占据率。利用该理论模型,以1 bp碱基为步长、147 bp碱基为窗口,用该算法计算了酵母1号、3号、14号染色体上核小体形成能力强、中、弱各3条长度为147 bp的DNA序列,将这些片段克隆到重组质粒中,大量扩增回收9条标记biotin分子的目的序列。同时分别表达纯化了组蛋白H2A、H2B、H3和H4,复性后装配形成组蛋白八聚体结构。利用盐透析方法将9条DNA序列在体外组装形成核小体结构,经biotin标记检测后计算了反应过程的吉布斯自由能,对比了9条目的序列形成核小体的亲和力大小。研究发现,9条序列中有5条序列与理论预测完全符合,4条序列与理论预测不完全一致。实验结果与该算法预测的核小体定位结果基本一致,表明该理论模型能够有效预测酿酒酵母基因组核小体占据水平。     

果蝇核小体定位研究进展

基因组上核小体位置的确定涉及DNA、RNA聚合酶、转录因子、后转录修饰与组蛋白变异、组蛋白修饰酶和染色质重塑复合体之间的相互作用。真核状态基因组的DNA是被包裹在核小体中,故理解控制核小体沿DNA定位的原理对于进一步理解组蛋白结合所执行的基因功能是非常必要的。而核小体的定位在诸多细胞过程中起着重要重要,比如转录调控、DNA复制和修饰等。因此核小体定位已逐渐成为目前遗传学研究的热点以及表观遗传学的重要研究内容并且也将在未来生物学研究中占据相当重要的位置。本综述以果蝇为例,全面介绍核小体定位的研究现状和未来方向。     

基于核小体位置预测的酵母进化印迹研究

在利用核小体定位实验数据训练支持向量机(SVM)对任意酵母DNA序列的核小体形成能力进行预测的过程中,发现染色质结构对基因组DNA分子进化过程有着显著影响。我们观察到核小体DNA比连接DNA的平均预测准确率低15%,这种普遍存在的局部预测准确率差异性代表了酵母核小体定位的进化印迹(Evolutionary footprint),它揭示了核小体组织在基因组的整个进化过程中所具有的保守性。     

酿酒酵母YPH499 Ⅲ号染色体上ARS形成核小体能力的比较

核小体定位是复制起始调控的重要因素,但是核小体定位是如何调控真核生物的复制起始,目前还不是很清楚。研究酵母Ⅲ号染色体上的不同活性复制起始序列形成核小体能力对探究真核生物DNA复制起始机制有着重要的生物学意义。酿酒酵母Ⅲ号染色体上的10个复制起始序列分为高活性和低活性两组复制起始序列,利用核小体体外组装技术,将回收纯化的高活性和低活性复制起始序列分别与组蛋白八聚体在体外进行梯度盐透析组装形成核小体,并进行Biotin标记检测,然后用Image J软件分析不同复制起始序列组装形成核小体能力的强弱。结果表明,用Image J软件对核小体组装能力强弱进行分析:ARS304ARS303ARS313ARS302ARS306ARS314,ARS305,ARS307,ARS309,ARS315。低活性复制起始序列较高活性复制起始序列更易形成核小体;复制起始位点偏好出现于核小体缺乏区。     

核小体定位的转录调控功能研究进展

核小体是真核生物染色质的基本组成单位,组蛋白八聚体在DNA 双螺旋上精确位置称为核小体定位．核小体定位已被证实在基因转录调控、DNA复制与修复、调控进化等过程中扮演着重要的角色．随着染色质免疫共沉淀-芯片(ChIP-chip)与染色质免疫共沉淀-测序(ChIP-seq)等高通量技术的出现,已测定了多种模式生物全基因组核小体定位图谱,掀起了一股核小体定位及其功能的研究热潮,并取得了一定的成果．本文介绍了核小体定位的概念,总结了核小体在启动子与编码区域内定位的基本模式．在此基础上,综述了核小体定位在转录起始、转录延伸、基因表达模式多样化以及可变剪接等方面的功能研究进展．     

甲藻染色体在非细胞体系核重建过程中核小体的组装

利用纯化的原始真核生物寇氏隐甲藻（Crypthecodinium cohnii E.）染色体,使之与非洲爪蟾（Xenopus laevis L.）S期卵提取物温育,发现甲藻染色体经历了一系列去凝集、再凝集的形态变化,最后形成类似典型高等真核生物的间期核结构。小球菌核酸酶酶切分析表明,不具备组蛋白和核小体结构的甲藻染色体在非洲爪蟾卵提取物中进行了核小体装配,此过程与DNA序列本身、核膜以及核纤层蛋白（Lamin）是否存在无关,但部分拓扑异构酶Ⅱ（TopoⅡ）参与了这个过程,说明核小体的组装并非为核重建所必需,决定染色体高级结构的因素并不在DNA本身,而可能是非细胞体系中的组蛋白和非组蛋白。     

人类基因组核苷酸多态性位点核小体定位分析

研究人类基因组核苷酸多态性位点周围核小体的定位,对于分析核苷酸的变异机制有重要意义.分析了人类基因组单核苷酸多态性(SNP)位点、简单插入位点、插入删除位点和删除位点的分布规律,以及这些位点周围的核小体定位特征.结果表明:转录起始位点下游的核苷酸多态性位点分布呈现约211 bp的周期特征,单核苷多态位点另有一个146 bp的周期;约211 bp的周期与转录起始位点下游核小体的分布周期204 bp非常接近,146 bp的周期恰是核小体核心DNA的长度.这些结果说明核小体与多态性位点的分布关系密切.进一步研究证实,单核苷酸多态性位点多分布于核心DNA上,且多位于核心DNA的两端,这使得单核苷酸多态性位点具有146 bp周期,而插入、插入删除、删除多态性位点多分布于核小体排开区域,间隔约为204 bp.转录起始位点下游核小体等间隔的规则分布使得多态性位点的分布也具有周期性.研究表明,相对于核小体,不同类型变异发生的位置不同,核小体定位在基因组多态性位点的形成过程中具有重要作用.     

基于位置权重矩阵的核小体识别及功能分析

为研究高通量的人类CD4+T细胞的核小体定位模式,使用迭代算法对核小体定位模式进行分类,并利用位置权重矩阵方法分别构建稳定核小体定位序列、动态核小体定位序列和连接区序列模型,通过十倍交叉验证评估模型性能,并与Segal方法与弯曲度方法进行比较,发现位置权重矩阵方法在敏感性、精度和准确性方面都具有一定优越性。同时采用滑窗法在全基因组选取候选序列进行核小体识别,挖掘核小体定位相关基因,并进行基因生物学进程功能富集分析,发现稳定与动态核小体、真实与潜在核小体对应的基因所参与调控的生物学过程各有不同,但也有一些生物学过程为不同类别核小体所共有,例如对细胞内大分子的调控功能。     

盐离子作用下组蛋白变体H2A.Z增强核小体结构的稳定性

真核生物染色质的基本结构组成单元是核小体,基因组DNA被压缩在染色质中,核小体的存在通常会抑制转录、复制、修复和重组等发生在DNA模板上的生物学过程。组蛋白变体H2A.Z可以调控染色质结构进而影响基因的转录过程,但其详细的调控机制仍未研究清楚。为了比较含有组蛋白变体H2A.Z的核小体和常规核小体在盐离子作用下的稳定性差异,本文采用Förster共振能量转移的方法检测氯化钠、氯化钾、氯化锰、氯化钙、氯化镁等离子对核小体的解聚影响。实验对Widom 601 DNA序列进行双荧光Cy3和Cy5标记,通过荧光信号值的变化来反映核小体的解聚变化。Förster共振能量转移检测结果显示:在氯化钠、氯化钾、氯化锰、氯化钙和氯化镁作用下,含有组蛋白变体H2A.Z的核小体解聚速度相比于常规核小体要慢,且氯化钙、氯化锰和氯化镁的影响更明显。电泳分析结果表明,在75℃条件下含有组蛋白变体H2A.Z的核小体的解聚速率明显低于常规核小体。采用荧光热漂移检测(fluorescence thermal shift analysis , FTS)进一步分析含有组蛋白变体H2A.Z核小体的稳定性,发现两类核小体的荧光信号均呈现2个明显的增长期,含有组蛋白变体H2A.Z核小体的第1个荧光信号增速期所对应的温度明显高于常规核小体,表明核小体中H2A.Z/H2B二聚体的解聚变性温度要高于常规的H2A/H2B二聚体,含有组蛋白变体H2A.Z核小体的热稳定性高。研究结果均表明,含有组蛋白变体H2A.Z的核小体的结构比常规核小体的结构稳定。