核衣壳蛋白VP39融合TAT转导肽对杆状病毒转导哺乳动物细胞的影响

为了提高昆虫杆状病毒在哺乳动物细胞中转导基因的效率,构建了重组杆状病毒AcRed-tat和AcRed。两者都能在哺乳动物细胞内表达红色荧光蛋白作为报告基因。同时,AcRed-tat带有HIV-1Tat转导肽、病毒主要衣壳蛋白基因vp39及增强型绿色荧光蛋白(egfp)三者的融合基因,并由杆状病毒多角体启动子表达,能够在昆虫细胞中表达该Tat融合蛋白,并掺入子代病毒粒子。而AcRed作为相应的对照病毒,带有多角体启动子表达vp39和egfp的融合基因。2株病毒分别转导哺乳动物细胞后,利用流式细胞仪检测报告基因的表达水平,发现在CHO和Vero细胞中AcRed-Tat介导的报告基因表达水平明显高于AcRed,而在HEK293细胞中2株病毒介导的报告基因表达水平差异不显著。结果表明Tat转导肽可以提高杆状病毒对一部分哺乳动物细胞的转导效率,为改进杆状病毒-哺乳动物细胞转导载体提供了新的思路。     

杆状病毒介导外源基因在哺乳动物细胞中表达的研究进展

杆状病毒(Baculovirus)是一种以昆虫为唯一宿主的病毒, 可用做生物杀虫剂或作为表达载体在昆虫细胞中大量表达外源蛋白, 制备疫苗。研究发现, 在哺乳动物细胞中携带哺乳动物启动子的重组杆状病毒能启动下游外源基因的表达但病毒不能在哺乳动物细胞中增值, 对细胞毒性小, 转导成功的细胞可以稳定传代并有效表达外源基因, 哺乳动物细胞比昆虫细胞对蛋白质具有更好的翻译后修饰, 表达出的蛋白结构更接近天然蛋白。因此, 杆状病毒可作为一种新型的哺乳动物细胞基因转移载体, 用于表达外源基因及作为一种基因治疗载体, 具有巨大潜力, 日益受到人们的关注。本文对杆状病毒作为一种表达载体在哺乳动物细胞中表达的研究进展进行了综述。     

哺乳动物细胞表达系统

(一)重要性在基因工程领域,哺乳动物细胞表达系统日益受到人们重视。许多重要的具医疗价值的蛋白在大肠杆菌表达系统中无生物活性或活性很低。这是由于在此系统中许多真核蛋白不能完成转译后修饰,如糖基化、酰胺化、二硫键的正确连接和亚基的正确装配。而在哺乳动物细胞表达系统中,这些转译后修饰过程能正常进行,产生与天然蛋白完全相同的分子。因此,哺乳动物细胞表达系统正在逐渐形成产业。在理论研究上,哺乳动物细胞表达系统也十分重要,它是研究真核基因调控的必不可少的模型。这个系统不仅对检验基因的同域作用(cis-acting)序列(如启动子)非常有用,而且对研究跨域作用因子(如一些调控蛋白)也极有价值。     

β-酪蛋白启动子的活性调控机制

β-酪蛋白启动子是一种活性很强的乳蛋白启动子,它不但能在乳腺细胞中高效启动β-酪蛋白的表达,而且能在其它细胞中实现对外源基因的有效表达.β-酪蛋白启动子之所以能高效启动酪蛋白基因或其它蛋白质基因的表达是因为许多激素和细胞因子能调节β-酪蛋白启动子的活性.催乳激素、CCAAT增强子结合蛋白、八聚体结合转录因子等可直接作用于β-酪蛋白启动子以调控它的活性;糖皮质激素(G),ERBB4,肿瘤坏死因子,P300/CBP等则可以通过间接的途径调控β-酪蛋白启动子的活性.本文就近年来β-酪蛋白启动子活性的直接和间接调控这两个方面的研究进行综述.     

杆状病毒对不同哺乳动物细胞基因转移及表达效率的研究

研究已证实杆状病毒可进入某些哺乳动物细胞,这提示了可将重组杆状病毒作为一种对哺乳动物细胞的新型基因转移载体。利用已构建的重组杆状病毒BacV-CMV-EGFPA,以含病毒的Sf9细胞培养上清同时孵育多种哺乳动物细胞,利用流式细胞术检测报告基因在不同细胞株中的转移效率及表达效率。共使用了20种哺乳动物细胞株,其中有12种人类组织细胞,7种小鼠组织细胞,1种猴组织细胞。实验结果显示携带CMV启动子的重组杆状病毒可有效进入多数哺乳动物细胞,其中对人、猴来源细胞的基因转移效率显著高于对鼠源细胞,对贴壁细胞的基因转移效率显著高于对悬浮细胞。同时,通过脂质体LipofectAMINE将携带有CMV启动子和EGFP基因的哺乳动物细胞表达质粒pCDNA3-1-EGFP分别转染部分特别是被认为杆状病毒进入能力较低的细胞株,结果显示CMV启动子在这些细胞中均可有效引导EGFP基因的表达,因此认为携带了CMV启动子的重组杆状病毒对不同哺乳动物细胞基因转移效率能基本反映出杆状病毒对不同种哺乳动物细胞的进入能力。通过综合比较携带CMV启动子的杆状病毒对不同种属及组织来源细胞的基因转移及表达效率,可看出杆状病毒对灵长类动物贴壁细胞的基因转移及表达效果是较好的,而对小鼠来源的细胞及悬浮培养细胞却并不十分理想,这表明将重组杆状病毒作为一种对哺乳动物细胞的基因转移工具,仍有其局限性,不一定对所有的细胞都合适,在应用时应予以充分考虑。     

启动子Pcpcβ提高鱼腥藻7120中hGM-CSF基因表达效率的研究

利用聚球藻7002中编码藻蓝蛋白基因(cpcβ)的启动子(Pcpcβ),替代穿梭表达载体pDC-GM中的启动子PpsbA,启动外源人粒巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)基因在鱼腥藻7120中的表达。蛋白免疫印迹证实,在含Pcpcβ启动子的cGM藻株中,hGM-CSF基因的表达水平比原先构建的含PpsbA启动子的GM藻株中提高了90%,且该基因的高效表达对宿主细胞的生长未产生明显影响。结果表明,对于在蓝藻中表达hGM-CSF基因而言,Pcpcβ启动子可能是较适宜的强启动子之一。     

肌动蛋白抑制了杆状病毒多角体蛋白基因的转录与表达

为进一步研究肌动蛋白在杆状病毒感染晚期的作用,利用Bac-to-Bac系统构建了表达多角体基因、肌动蛋白与绿色荧光蛋白融合基因的重组病毒vAc-ph/70GA,同时构建对照病毒vAc-ph.实验发现,重组病毒vAc-ph/70GA感染Sf9细胞后能持续表达肌动蛋白,但不能形成多角体,vAc-ph则能形成多角体.sDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示,vAc-ph/70GA感染晚期,细胞内没有多角体蛋白的表达;RT-PCR的结果进一步表明多角体基因的转录被抑制.肌动蛋白的表达并没有影响vAc-ph/70GA对细胞的感染力.结果表明,晚期表达的外源肌动蛋白抑制了多角体基因的转录和表达,从而导致多角体不能正常产生.     

利用优化改造的家蚕杆状病毒表达系统提高NS1表达产量

为优化家蚕杆状病毒表达系统,提高外源基因的表达产量。文中通过同源重组技术,用串联的氯霉素基因(Cm)表达盒和绿色荧光蛋白基因(egfp)表达盒将其替换,从而获得Chitinase和Cystein Protease两个基因缺失的家蚕杆状病毒载体。通过转座,将多角体启动子控制的家蚕二分浓核病毒(Bm BDV)ns1基因表达盒,定点插入到改造后的该分子载体中。将重组载体转染Bm N细胞,获得能表达家蚕二分浓核病毒(Bm BDV)NS1的缺失型重组病毒;另外,将多角体启动子控制的ns1基因转座到野生型Bm-bacmid中,获得能表达Bm BDV NS1的野生型重组病毒。将这两种病毒分别皮下注射家蚕,对感染后的家蚕血液中NS1表达水平进行比较,发现缺失Chitinase和Cystein Protease重组病毒感染的家蚕血液中,NS1的表达量是对照组的3倍,从而建立了一种高效表达可溶性NS1蛋白的方法,为靶蛋白的结构与功能研究奠定基础。     

序列优化的小鼠IL-33基因在哺乳动物细胞中的有效分泌表达

目的: 白细胞介素(IL)-33具有重要的免疫调控作用,在疾病中扮演着重要的角色。本文旨在通过基因优化实现IL-33在哺乳动物细胞中的高效表达,为疾病机理研究以及疫苗免疫佐剂应用等提供基础。方法: 根据小鼠白细胞介素-33成熟肽(mIL-33)的氨基酸序列,以哺乳动物细胞基因表达密码子偏好性进行基因优化设计;化学合成优化的mIL-33基因片段,通过搭桥PCR将编码人CD8α信号肽的核酸序列分别与优化或未优化的mIL-33基因连接,并与绿色荧光蛋白(EGFP)基因分别构建到双表达单元质粒 pBudCE4.1的不同启动子下;重组质粒经 lipofectamine 3000 和PEI转染293FT 细胞;以 Western blot和ELISA检测重组蛋白的表达;收集表达的mIL-33刺激巨噬细胞Raw264.7,ELISA检测培养上清的TNFα水平,以证明IL-33的生物学活性。结果: 重组质粒经酶切鉴定及测序分析证实构建成功; lipofectamine 3000转染效率较PEI转染更高;Western blot和ELISA 结果显示密码子优化的mIL-33表达水平较未优化序列更高,在EF-1α启动子和CMV启动子指导下mIL-33在293FT 细胞表达水平相当,CD8α信号肽成功引导mIL-33的分泌,产物具生物学活性。结论: 密码子优化操作显著改善了 mIL-33在哺乳动物细胞中的表达水平,为进一步研究奠定了基础。     

杆状病毒用于哺乳动物细胞快速高效表达外源基因的研究

现已发现杆状病毒可进入某些培养的哺乳动物细胞,这提示可将杆状病毒作为一种对哺乳动物细胞的新型基因转移载体。对杆状病毒转移载体的改造及对哺乳动物细胞的基因转移方式进行了进一步的研究。以绿色荧光蛋白基因为报告基因,利用Bac-to-Bac系统构建了分别含有正向和反向CMV启动子表达盒的两种重组杆状病毒。可观察到CMV启动子在Sf9细胞中可启动报告基因的表达,但表达效率较低。用重组杆状病毒感染后Sf9细胞的培养上清直接与HepG2细胞作用,以流式细胞术检测基因转移效率及荧光表达强度,发现这两种病毒在相同的感染复数下对HepG2细胞具有相似的基因转移及表达效率。同时,利用流式细胞术进一步研究了直接使用重组杆状病毒感染4d后Sf9细胞的培养上清对哺乳动物细胞进行基因转移的方法。通过对HepG2细胞的实验结果显示,将带毒Sf9细胞培养上清(1.2×10⁷PFU/mL)用哺乳动物细胞培养基1倍稀释后,37℃下孵育靶细胞12h(moi=50),可达到较高的基因转移及表达效率,同时不会对细胞造成明显损伤。将重组杆状病毒与脂质体和逆转录病毒这两种系统对HepG2及CV1细胞的基因转移效率进行了比较,结果发现在同样未经浓缩等特殊处理的条件下重组杆状病毒对这两种细胞的基因转移效率是最高的。因此可以认为,经过适当改造后的Bac-to-Bac重组杆状病毒系统可作为一种对哺乳动物细胞简便高效的基因转移表达载体。     

与CIK细胞结合的肿瘤特异性增殖腺病毒KGHV400的构建

为了构建能与CIK细胞(Cytokine induced killer cell,CIK)结合的肿瘤特异性增殖腺病毒,我们用化学合成的35型腺病毒(Ad35)纤毛基因替换5型腺病毒(Ad5)骨架质粒的纤毛基因,获得5/35嵌合型腺病毒骨架质粒,然后与携带肿瘤特异性启动子hTERT(端粒酶逆转录酶基因启动子)和HRE(缺氧反应元件启动子)的穿梭质粒在HEK293细胞中同源重组,获得能与CIK细胞结合的肿瘤特异性增殖腺病毒KGHV400。分离人外周血单个核细胞,诱导培养成CIK细胞,与KGHV400共培养获得荷载KGHV400的CIK细胞。建立乳腺癌裸鼠移植瘤模型,经尾静脉注射荷载KGHV400的CIK细胞,在注射后第1d、2d、3d、5d、7d、14d解剖实验鼠,用免疫组化技术检测腺病毒六邻体蛋白在移植瘤、心、肝、脾、肾组织的表达。结果显示,构建的重组腺病毒KGHV400能高效率感染CIK细胞;荷瘤鼠尾静脉注射荷载KGHV400的CIK细胞后第1d,肿瘤细胞中即有腺病毒六邻体蛋白表达,之后表达逐渐增多,第14d仍有表达;脾脏在第1~14d检测到少量淋巴细胞中存在腺病毒六邻体蛋白;心、肝、肾组织未检测到该蛋白。对照组(尾静脉注射KGHV400)在注射后第1d、2d、3d、5d,肝、脾、肾组织中检测到存在腺病毒六邻体蛋白,但第7d后为转阴性;肿瘤细胞和心肌细胞未检测到腺病毒六邻体蛋白。我们的研究结果表明,重组腺病毒KGHV400是一种有用的肿瘤基因治疗载体。     

表达猪瘟病毒E2蛋白的BacMam病毒的构建及其免疫原性分析

含具有哺乳动物细胞活性的启动子的重组杆状病毒(BacMam病毒)可有效转导多种哺乳动物细胞,并被广泛用于开发新型非复制型载体疫苗．将水泡性口炎病毒G蛋白(VSV-G)基因插入多角体启动子下游,得到经修饰的杆状病毒转移载体,将对虾白斑综合症病毒(WSSV)ie1启动子控制下的猪瘟病毒E2基因表达盒插入此载体中,构建了BacMam病毒BacMam/G-ie1-E2,以其感染Sf9细胞和转导HeLa细胞,通过间接免疫荧光试验和Western blot分析检测E蛋白的表达,同时用BacMam病毒直接免疫小鼠,用检测猪瘟病毒抗体的间接ELISA方法检测免疫小鼠血清抗体,用基于CFSE和WST-8的淋巴细胞增殖试验评价其细胞免疫应答．结果显示,BacMam/G-ie1-E2能同时在昆虫细胞和哺乳动物细胞中高效表达E2蛋白,免疫小鼠能诱导产生针对猪瘟病毒的特异性抗体,免疫小鼠脾细胞经猪瘟病毒刺激后能诱导特异性的淋巴细胞增殖．这表明,由BacMam病毒介导的基因转移有望用于开发针对猪瘟病毒的非复制型载体疫苗．     

新的单子叶作物高效表达载体

微弹导入系统(包括向细胞中射入覆盖DNA的颗粒)是一种成功的转化手段,却在单子叶植物如禾谷类作物上遇到麻烦,这导致人们研究寻找更加有效的启动子。CaMV(花椰菜花叶病毒组)35S RNA启动子和玉米乙醇脱氢酶启动子已被广泛用于植物转化,但在水稻细胞中效果不佳。Cornell大学由Ray Wu牵头的研究小组报导,用肌动蛋白基因启动子可使转化成功。 Act1肌动蛋白基因启动子在所有水稻细胞中均大量表达。初步实验表明,Act1启动子可促进β-葡糖     

准噶尔雅罗鱼β-肌动蛋白基因启动子的克隆及其活性功能初步检测

以开发利用新疆濒危鱼类准噶尔雅罗鱼(Leuciscus merzbacheri)基因资源为研究目的, 利用PCR技术克隆准噶尔雅罗鱼的β-actin 基因, 得到的β-actin 基因片段SZ21包含启动调控区, 大小为2 398 bp。SZ21的启动调控区包括β-actin 基因上游调控序列、第1、第2、第3和第4外显子部分序列。上游调控序列中含有对转录起重要作用的CAAT框、TATA 框和CArG 框等元件。对启动子序列在线分析表明, 获得的启动子含有E-box、RU49、ZBPF、CEBP、CREB等多个重要转录因子结合位点。用AatⅡ破坏真核表达载体pEGFP-N1-AFPⅢ中的CMV启动子, 将准噶尔雅罗鱼的SZ21启动调控区克隆到载体pEGFP-N1-AFPⅢ(CMV坏)上, 构建成重组表达载体β2 pEGFP-N1-AFPⅢ。脂质体转染BHK-21细胞。结果表明, 克隆的准噶尔雅罗鱼β-actin基因启动子SZ21具有启动EGFP报告基因在哺乳动物细胞中表达的活性。通过BHK-21绿色荧光细胞的传代证实, 克隆的启动子具有持续启动蛋白基因表达的活性, 在细胞传代中可以遗传。PCR检测传代的BHK-21绿色荧光细胞基因组DNA, 均能检测到SZ21目的片段。文章成功分离了具有活性功能的准噶尔雅罗鱼β-actin基因启动子。     

重组家蚕病毒表达系统转移载体的构建和β─半乳糖苷酶的表达

本文从中国农科院蚕业研究所提供的我国家蚕核多角体病毒镇江株中获得了多角体蛋白的强启动子,用此启动子构建了家蚕病毒表达系统的转移载体。外源基因能在此启动子控制下在家蚕细胞和虫体中进行高效表达。用此载体我们首先成功地在家蚕虫体中高效表达了β－半乳糖苷酶,表达量达到５８０μｇ／条蚕,从而证实我们构建的载体是可靠的、有效的,可用于家蚕重组病毒表达外源基因的研究。     

四种启动子调控RFP报告基因在家蚕细胞(Bm-e-HNU5)内的瞬时表达

以红色荧光蛋白基因（RFP）为报告基因,构建含4种不同启动子的重组表达质粒,用脂质体介导法转染家蚕Bombyx mori细胞（Bm-e-HNU5）,观察家蚕细胞质肌动蛋白4基因启动子（A4）、α微管蛋白基因启动子（α-tub）、蚕丝心蛋白重链基因启动子（Fib）和家蚕核型多角体病毒早期即刻蛋白基因启动子（IE）4种启动子调控RFP报告基因在家蚕细胞内的瞬时表达情况。构建的重组表达质粒pDsRed-α-tub、pDsRed-A4、pDsRed-IE和pDsRed-Fib经双酶切和PCR鉴定正确无误。转染和转录实验结果表明,除了pDsRed-A4外,其他3种重组质粒在Bm-e-HNU5细胞中都得到高转染率,α-tub、IE和Fib可依次增强RFP报告基因在家蚕细胞内的瞬时表达活性。     

构建基于杆状病毒的BV-T7杂合表达体系及利用其在哺乳动物和禽类细胞中表达eGFP基因

【目的】研究重组杆状病毒BV-T7杂合表达体系能否有效转导禽类细胞并在禽类细胞中表达外源基因(eGFP),从而构建能在禽类细胞中高效稳定表达外源基因的重组杆状病毒表达系统。【方法】本研究利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,结合T7表达系统,通过对eGFP表达水平的调控来把握噬菌体T7 RNA聚合酶(T7 RNAP)的功能。利用两支重组杆状病毒,pFastBac-CMV-T7 RNAP重组杆状病毒为哺乳动物细胞启动子CMV调控的噬菌体T7 RNA聚合酶的cDNA;pFB-T7pro-IRES-GFP-T7ter重组杆状病毒为T7启动子控制的eGFP报告基因。将两支重组杆状病毒共同侵染哺乳动物OL(oligodendrocyte)细胞、鸡胚成纤维细胞和鸡胚骨骼肌细胞。【结果】两支重组杆状病毒利用T7启动子和T7 RNAP,在OL细胞、鸡胚成纤维细胞和鸡胚骨骼肌细胞中成功表达eGFP报告基因,而且未引起细胞病变,但在鸡胚原代细胞中eGFP的表达相对弱于在OL细胞中的表达。在OL细胞中重组杆状病毒对细胞的转导效率为59.5%,在鸡胚成纤维细胞和鸡胚骨骼肌细胞中转导效率分别为23.2%和33.1%。【结论】本研究构建的基于杆状病毒、T7RNA聚合酶、T7启动子(BV-T7)杂合表达体系能够在哺乳类细胞及禽类细胞中表达T7 RNAP,并利用T7RNAP继续高效而稳定地表达外源基因。这为难于体外操作的RNA病毒提供了有效的研究方法,并对新型基因工程疫苗的研制提供了一个高效而稳定的表达载体系统。     

创建可视化的家蚕杆状病毒表达系统表达家蚕二分浓核病毒非结构蛋白NS1

重组杆状病毒感染昆虫细胞是表达外源蛋白常用的一种方法。为有效鉴定转染的细胞中是否产生了重组病毒粒子,对质粒pFastBacI进行改造,构建了极早期基因ie1启动子控制的绿色荧光蛋白egfp基因表达盒,以及多角体基因启动子控制的外源DNA的一个通用型双表达载体;通过酶切、连接的方式,将家蚕二分浓核病毒ns1基因连接到多角体启动子下游;在转座酶的介导下,该供体质粒上部分序列可转座到穿梭载体Bm-Bacmid上,进而构建可同时表达egfp和ns1基因的重组杆粒。将构建的该重组杆粒DNA转染BmN细胞,通过观察可视化的绿色荧光信号,可迅速判定转染后的细胞中重组病毒粒子产生的情况,收集转染后的细胞培养上清,将其感染BmN细胞,对感染4 d后的细胞总蛋白进行Western blotting分析,结果表明能杂交到一条36 kDa大小的特异蛋白,表明NS1蛋白成功获得了表达,进而为深入研究ns1基因的功能奠定了基础。     

在哺乳动物细胞中表达丙型肝炎病毒结构蛋白的研究

应用带有T7启动子的痘苗载体构建了含丙型肝炎病毒 (HCV)结构蛋白基因C ,E1和E2 /NS1的重组痘苗表达克隆 .在重组痘苗病毒vTT7所提供的T7RNA聚合酶存在下 ,在哺乳动物细胞中进行了暂时表达 .以HCV患者血清作Westernblot鉴定 ,分别检测到了核心蛋白C、包膜蛋白E1和E2的成熟表达 ,并且发现表达产物与不同来源的HCV患者血清及克隆本病毒患者不同时期的抗血清反应不同 .比较了C- E1 -E2在 6种不同的哺乳动物细胞中的表达情况 ,其中Vero和HeLa细胞对于这些蛋白的表达最为理想 .为了对表达产物开展进一步的研究 ,已成功地构建了能稳定表达C ,E1和E2的重组痘苗病毒株 .