假单胞杆菌2-萘酸加氧酶基因的克隆与表达

采用Cosmid pLARF1构建了完整的2-萘酸代谢菌2-NAT菌株的基因文库.通过分析基因文库中产生蓝色色素的克隆验证了2-萘酸代谢基因在大肠杆菌体内得到表达,并导致重组细菌产生靛蓝.从产生靛蓝的克隆抽提重组的Cosmid DNA进行酶解分析,发现所有能产生靛蓝的克隆均含有一大小相同的DNA片段.用重组细菌进行靛蓝生物合成的试验展示了微生物法生产靛蓝的美好前景.     

扣囊拟内孢霉α-淀粉酶基因的克隆和在酿酒酵母中表达

以穿梭质粒pCN60为载体,大肠杆菌C600为受体构建了扣囊拟内孢霉(Endomycopsis fibuligera)G45 Sau 3A基因文库。从基因文库中提取重组质粒DNA并转化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BJ1991,选出四个具有o-淀粉酶活性的转化子,琼脂糖凝胶电泳结果证实插入的DNA片段为9.0kb。对插入DNA片段亚克隆,确定。-淀粉酶基因位于PstI-Sall 3.9kb片段上,启动子位于PstI-EcoRI 的1.3kb片段上。用亚克隆PGK11.9kb片段置换。-淀粉酶启动子区,其转化子的e-淀粉酶活性有明显提高。     

麦迪霉素聚酮缩合酶基因的亚克隆及表达

利用与麦迪霉素生物合成有类似途径的放线紫红素聚酮缩台酶基因ActⅠ作为探针,将来源于麦迪霉素产生菌基因文库的与ActⅠ有同源性的阳性初级克隆pcN8812进一步缩小,亚克隆获得了2．4kb的麦迪霉素聚酮缩台酶基因,将其插入pwHM3载体中构建了重组质粒pcG2 DNA。pcG2 DNA在放线紫红素聚酮缩合酶基因缺陷型变株天蓝色链霉菌TKl7及螺旋霉素产生菌S．Ambofaciens中均获得表达。前者所得产物不同于麦迪霉素和放线紫红素,可能为新的杂合抗生素,后者能使螺旋霉素产量得到提高。另外pcG2 DNA在道诺红霉素产生菌调节变株S.peucetiusH6101中的表达产物经TLC及HPLC分析表明为紫红霉酮。pcG2 DNA在Tetracenomycin C产生菌S．Glaucescens中亦有一定的功能表达,而在红霉素产生菌红霉内酯阻断变株Saccharapolyspara erythraea WMH 15,26l中未观察到活性表达。推测pCG2 DNA具有一定调节或在某些聚酮类抗生素产生菌变株中超互补的功能。     

利用同源重组建立地中海拟无枝菌酸菌U32染色体的基因置换/中断系统

地中海拟无枝菌酸菌U32是力复霉素SV的工业产生菌,其遗传操作一直是一个难题。在该菌株DNA高效电转化的基础上,利用同源重组的原理,建立了地中海拟无枝菌酸菌染色体的基因置换/中断系统。通过大肠杆菌重组质粒pDK110构建、转化及两步重组筛选,成功地用α淀粉酶基因（amy）取代了地中海拟无枝菌酸菌U32染色体上的3-氨基-5-羟基苯甲酸合成酶基因（ahbas）。第一步单交换和第二步双交换的频率分别是0.5%～0.7% 和 2%。将质粒pDK110变性后转化可显著提高重组频率,在第二步筛选双交换前对单交换重组子进行电击也能够提高其双交换重组的频率。此外,通过转化构建的两端带同源区段的线性DNA片段及一步重组筛选,我们在地中海拟无枝菌酸菌U32染色体的amrD,rifO基因中间插入了阿普拉霉素抗性基因（apr）,其效率约为30～50转化子/μgDNA。     

酵母SUC2基因的克隆

本文以酵母一大肠杆菌穿梭质粒YEP51为载体构建了酿酒酵母s.cerevisiae 2．1168的基因文库,并用DNA分子杂交技术从这个基因文库取得了包括suC2基因的克隆YFD6。本文还对YFD6中的SUC2基因在酵母细胞中的表达,YFD6的物理图谱以及SUC2基因在YFD6上的位置作了初步分析。     

青霉素G酰化酶操纵子的负调控因子的研究

青霉素G酰化酶(PA)操纵子的调节基因(pacR)存在于青霉素G酰化酶结构基因(pac)内部Dral-Taql一段约500bp的DNA片段内,此片段内含有2个ORF。2个ORF及其突变体分别克隆到pUC18得到一系列重组质粒,用这些重组质粒转化青霉素G酰化酶产生菌E.coliD816,测定克隆片段对PA表达的影响。如果克隆片段含有具功能的pacR,诱导剂苯乙酸(PAA)不能使由高拷贝却pacR表达的阻抑物全部失活,部分阻抑物结合pac操纵基因,阻碍RNA聚合酶对pac的转录,因此PA的表达量降低。结果表明,阻抑物是由pac结构基因内部的ORF2编码的蛋白因子,pacR即ORF2。RNA—DNA杂交实验证实了pacR在转录水平阻抑pac的表达。     

海绵Pachychalina sp.体内细菌多样性的研究

通过非分离培养分析方法,直接从海绵体内提取细菌总DNA。以样品总DNA为模板进行PCR扩增获得细菌16S rDNA。用16S rDNA限制性酶切片段长度多态性（ARDRA）和测序方法对南海湛江海域海绵Pachychalina sp.体内的细菌多样性进行了研究。在细菌16S rDNA的ARDRA图谱中,大多数克隆的酶切带谱间存在差异;随机挑选22个克隆进行测序得到它们的16S rDNA部分序列,大部分序列属于γproteobacterium和αproteobacterium,但有少数克隆序列与RDP数据库中收录的16S rDNA序列间的相似性极小,不参与系统发育树的构建。研究结果表明海绵Pachychalina sp.体内细菌组成具有丰富的多样性。     

pBR322-Red在大肠杆菌lac操纵子基因敲除和敲入中的应用

pBR32 2 - Red是一种新型重组工程系统 ,它携带了λ-噬菌体Red重组酶基因和一系列调控元件。对pBR32 2 Red最优重组条件进行探索后应用该质粒提供的体内同源重组功能 ,在菌株W3110体内 ,对染色体上的lac操纵子进行了基因修饰 ,包括 :①运用kan-sacB选择反选择方法和重叠引物方法敲除了阻遏基因lacI,②运用kan -sacB选择反选择方法和线性双链DNA介导的DNA重组方法将报告基因lacZ敲入lacA和lacY的位置 ,并且首次测定了报告基因lacZ在这三个结构基因位置的组成性表达情况。结果表明运用不同的重组策略 ,pBR32 2- Red系统都能方便有效地对大肠杆菌W3110染色体进行基因敲除和敲入修饰。     

酵母菌色氨酸合成酶基因的克隆与表达

用RemHI酶切酿酒酵母(Saceharomyces cercuisiae) 1412-4D染色体DNA,通过蔗糖梯度分离2-4kb DNA片段并插入穿棱质粒pCN60,构成1412-4D基因文库。从基因文库中提取重组质粒,转化受体菌C9(a,trp5,adcl,ade6),用直接功能互补法,分离到9株重组质粒,它们都含有3．2kb的TRP5 DNA片段,分别命名为pCN60(trps)1-90转化体中色氨酸合成酶的酶活水平比原始菌株1412-4D高3倍。     

用构建的新型BmNPV载体在家蚕高效表达人β-干扰素

构建了家蚕核多角体病毒(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus,BmNPV)新型载体pBm92,该载体将多角体蛋白基因的起始密码ATG改变为ATT,然后在多角体蛋白基因的+12位后连接有5个外源基因的克隆位点。将HulFN-β基因克隆在多角体蛋白基因的+12位后,构建了pBmIFN+12;同时构建了HuIFN－β克隆在－3位后的转移载体pB．mIFN－3。将两种转移载体DNA分别与BmNPV基因组DNA共转染Bm—N细胞。利用重组病毒不产生多角体蛋白的特征,筛选重组病毒。用HuIFN－β基因探针与重组病毒DNA进行杂交鉴定。重组病毒BmIFN+12感染Bm-N细胞,其上清IFN活性为2．0×10⁶Iu／ml,将BmIFN+12注射5龄家蚕虫体,表达水平为5．O×10⁷Iu／ml,是HulFN-β基因克隆在多角体蛋白基因的-3位后获得的重组病毒表达量的2—4倍。构建的新型BmNPv载体能够在家蚕高效地表达HuIFN-β。家蚕虫体生产的rHulFN-β蛋白具有天然HuIFN-β的抗原性。     

浑球红细菌谷氨酸合酶基因(glt)的克隆和图谱分析

利用转座子Tn5随机插入诱变筛选得到12株浑球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)氨同化缺陷突变株(Asm~-)。这些突变株胞内均无GOGAT活性,同时它们均无固氮酶活性(Nif~-),并且具有氮代谢多效性缺失表型(Ntr~-)。将含有Azorhizobium sesbaniae ORS571的完整glt基因的质粒pHB10转入突变株中能互补上述表型。通过筛选携带Tn5的R-prime质粒克隆了glt::Tn5片段。Southern杂交证明所克隆glt::Tn5片段与E. coli的gltBD基因有同源性。用此片段与以pLAFR3为载体所构建的R. sphaeroides 601基因文库进行菌落原位杂交筛选到了携带glt基因的cosmid pLT27。pLT27能互补所有12株R.sphaeroides氨同化缺陷突变株。酶切分析表明在该cosmid中插人的染色体DNA片段大小约为26.5kb。以pRK415为载体亚克隆了4.0kb与10.5kh的pLT27的Hindlll酶切片段,分别命名为pLTRK271与pLTRK272。pLTRK272能互补变种GT6、GT10、GT11,pLTRK…     

免培养法对一热泉细菌多样性的初步研究

应用免培养法（Cultureindependent）对云南腾冲热海大滚锅高温热泉中细菌的多样性进行初步的分析。经过克隆筛选,测定了5个克隆的16S rDNA插入片段的近全序列,系统发育分析的结果表明,它们分属于Bacillus、Hydrogenobacter和Pseudomonas,有一个克隆尚难确定其分类地位,它属于Thermodesulfobacteriaceae科,介于Geothermbacterium属和Thermodesulfobacteria属之间。经PCR扩增出上述5个克隆16S rDNA插入序列中及环境样品总DNA中的16S rDNA V8高变区约600bp片段,进行变性梯度电泳（DGGE）。所得电泳图谱和5个序列的系统发育树不仅表明该高温热泉存在着丰富的细菌多样性,还显示了它们是该高温热泉中细菌的优势物种。     

转录增强子对yellow基因发育特异性表达的调控

从果蝇基因组文库中分离和克隆了yellow基因上游调控区DNA.应用重组DNA技术在体外构建了一种含yellow基因和调控元件的载体,通过转基因技术将其整合入果蝇基因组中.进而用FIP / FRT和Cre/LoxP双重位点特异性重组体系,在基因组同一位置上完成两个重组反应, 获得两种yellow基因突变体,即两种yellow等位基因.等位基因的遗传学分析表明,转录增强子直接调控yellow基因的发育特异性表达.研究结果进一步表明了两种等位基因之间存在相互作用,这种作用明显影响了yellow基因的表达水平,而这种效应可能也是由转录增强子所介导的.     

含庚型肝炎病毒E2基因片段质粒DNA能诱发相当强烈的体液免疫应答

研究了庚型肝炎病毒E2(HGVE2 )基因片段作为DNA疫苗的可行性。将来自于质粒pThioHis-E2编码HGVE2的基因片段 (559bp)亚克隆到质粒pCMV-S中 ,使之和HBsAg基因位于同一阅读框 ,形成重组质粒pCMV-S-E2。用纯化的质粒pCMV-S-E2DNA注射到昆明小鼠后腿四头肌中来免疫小鼠 ,同时用pCMV-S作为对照。间隔 14天再加强一次免疫。在加强免疫后的第 8天眼眶取血。用E2-GST融合蛋白作为固定化抗原 ,通过ELISA检测受试小鼠的体液免疫应答。结果表明 ,用质粒pCMV-S-EDNA免疫的小鼠可以产生很强的体液免疫应答。     

紫云英根瘤菌共同结瘤基因nodA和nodBC的核苷酸序列

以~(32)p标记的苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)2.3kb nod DNA作探针,从紫云英根瘤菌(Rhizobium huakuii即R. astragali)159基因文库中分离到一株能与探针DNA呈阳性反应的克隆pRaN109。同源DNA-DNA杂交及DNA序列分析表明:pRaN109DNA的9kb EcoRI片段上携带了nodD_1BC基因,pRaN109 NDA的18kb EcoRI片段上携带了nodD_2A基因。共同结瘤基因nodA与nodBC两者相距6.7kb。在nodA基因和nodBC基因的上游都存在有结瘤盒(nod box)。与来自不同种属的菌株所报告的结果相比较,紫云英根瘤菌159中的共同结瘤基因有着明显不同的组合。     

麦迪霉素生物合成基因克隆研究

利用穿梭粘粒载体pNJ1组建了麦迪霉素产生菌Streptomyces mycarolaciens 1748的基因文库,用与麦迪霉素生物台成有类似途径的放线紫红素聚酮合成酶基因Act I,Act Ⅱ为探针,从麦迪霉素产生菌的基因文库中,获得了与ActI,Act Ⅱ基因有同源性的阳性克隆,对其中PCNSBl2、6C5及11E11克隆DNA进行了酶切分析,其分子量分别为36kb,48．5kb及41．6kb。PCN6C5 DNA中包含有PCN 8B32的全部DNA片段,PCN ⅡEⅡ与PCN 8B12及PCN 6C5有6．75kb的重叠区。通过分子杂交实验,初步将麦迪霉素聚酮台成酶基因定位在PCN 8812 DNA的EcoR I—BamH I 4．02kb片段上(与Act Ⅱ基因有同源性)及PCN 8B12(6C5),PCNIIEIIDNA BgⅡ—BgⅡ 2．42kb与PCNllE11 Bgl I—B g1 I 1Okb片段上(与Act I基因有同源性)。PCN 8B12及PCN 6C5克隆DNA在麦迪霉素聚酮合成酶基因缺陷型变株Streptomyces mycarofaciens var．68及不产抗生索的变铅青链霉菌Streptomyces lividans TK24受体菌的表达产物,经TLC及HPLC等分析表明与麦迪霉素标准品相似。     

环状芽孢杆菌C-2几丁酶基因的克隆

环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)C-2总DNA经PstI部分酶切后分离2～10kb的片段,插入质粒pUC19的PstI位点,转化大肠杆菌(Escherichia coli),利用几丁质平板从约8000个重组子中筛选到一个几丁酶基因阳性克隆(命名为pCHT1)。用12种限制酶对重组质粒进行的酶切分析表明,重组质粒中的插入片段长3.0kb,其中各有一个KpnI,SacI和SspI位点。把该克隆片段反向插入pUC19的PstI位点所得到的重组子同样具有几丁酶基因表达活性,说明此片段含有一个完整的几丁酶基因,其自身的启动子能被大肠杆菌转录系统所识别。Southern杂交证实了该片段来自于B.circulans C-2基因组,且以单拷贝形式存在,它不能与来自于其它7株几丁酶产生菌的总DNA杂交。     

野油菜黄单胞菌NK-01编码生物合成多糖基因的克隆

采用甲基磺酸乙醇(EMS)诱变野油菜黄单胞菌NK-01得到多糖合成缺陷的不产枯突变株。经SalⅠ部分酶切得到的野生型NK-01染色体DNA片段,连接到广泛寄主载体pRK293上,在E.coli中建立完整的NK-01基因文库。通过使一株不产多糖突变株在协助质粒pRK2013存在下,分别与含基因文库的E.coli菌落群进行三亲结合转移筛选具有卡那霉素抗性的产粘接合后体,对接合后体进行的重组质粒的酶切分析表明,所克隆的DNA具有片段的重叠部分。上述重组质粒对外9株不产多糖突变株互补检测及遗传分析的     

琥珀酸弧菌L-天门冬酰胺酶基因的初级克隆和表达

本文以表达型噬菌体λgtll为载体,以及¹²⁵I标记的放射免疫抗体为探针,从EcDR I酶切的琥珀酸弧菌(Vyibrto succinogenes)染色体DNA片段中克隆得到携带天门冬酰胺酶基因的目的片段,在宿主菌E．Coil Y 1090 中得到表达。经酶解和凝胶电泳分析表明该插入DNA片段的分子量为5．8kb．重组DNA感染另一宿主菌E．ColiYl089后所产生的酶蛋白具有L-天门冬酰胺酶活力。用重组DNA(λgt11-AS8)为探针进行southern DNA杂交,琥珀酸弧菌染色体DNA的Ec0R I酶切片段中,出现一条位置在5．8kb处的杂交带,证明我们克隆到的携带L-天门冬酰胺酶基因的目的片段来自琥珀酸弧菌。     

O139霍乱弧菌LPS基因在大肠杆菌中的克隆和表达

利用粘粒载体pCOS5构建了国内分离的O139霍乱弧菌的基因组文库,并从文库中筛选获得可以表达O139霍乱弧菌脂多糖的重组克隆株E.coliJM109(pMG310)。重组粘粒pMG310经酶切分析,所克隆的外源DNA片段大小为37kb。实验证明：重组克隆株E.coliJM109(pMG310)所表达的脂多糖具有良好的免疫原性及反应原性。