重组单链胰岛素在含有巯基试剂的变性剂中的解折叠

重组单链胰岛素(PIP)含有3对二硫键。在含有巯基试剂的变性剂中,PIP产生二硫键交换从而形成一系列具有不同解折叠程度的二硫键异构体混合物。分别用高压液相色谱（HPLC）和圆二色性（CD）光谱分析了PIP在含有0．2mmol/L2－巯基乙醇的尿素和盐酸胍中的解中的解折叠程度。PIP二硫键异构体混合物通过胰蛋白酶酶解并用质谱测定酶解片段的分子量,证明PIP确实产生了二硫键交换。同时还分离纯化了PIP的一种主要非天然二硫键异构体并研究了它重新折叠成天然构象的情况。观察到PIP只有一种热力学稳定的二硫键配对方式,PIP的非天然二硫键异构体在巯基试剂存在的条件下可以高效转化为天然二硫键配对。还将PIP解折叠和再折叠的情况与胰岛素样生长因子－I（IGF－I）及胰岛素做了比较：胰岛素和PIP只折叠成一种热力学稳定的三级结构,IGF－I却折叠成两种热力学稳定的二硫键异构体;胰岛素的双链重组需缓慢进行,而PIP却可以快速折叠。     

胰岛素的促生长作用

除了经典的代谢调节作用之外,胰岛素还具有重要的促生长作用：在体外胰岛素能够刺激众多细胞的增殖与分化,一些实验证明胰岛素在体内可能也是一种重要的生长调节因子.胰岛素的促生长作用通过细胞表面的胰岛素受体介导,但在较高的胰岛素浓度下也可以通过类胰岛素生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)受体进行,在不同细胞体系中可能会有所不同.受体后的信号转导经过了一系列磷酸化和去磷酸化等途径,其中有胰岛素受体底物1(IRS-1)、Shc蛋白、Ras蛋白以及磷酸肌醇3激酶(PI3-K)等的参与.在胰岛素的分子表面很可能存在一些区域或位点,对其促生长作用有着更大的贡献,通过对一些高促生长活性的胰岛素类似物的研究已揭示出一些初步的证据.     

胰岛素耐受的HepG2细胞模型建立

采用高胰岛素体外诱导培养HepG2细胞,建立胰岛素耐受的细胞模型。将HepG2细胞置于5×10-7mol/L胰岛素培养液中24h,采用3H-D-葡萄糖掺入试验及残余125I-胰岛素结合率测定等方法观察高胰岛素对HepG2细胞葡萄糖摄取率及其胰岛素受体数目和功能的影响。高胰岛素诱导培养的HepG2细胞葡萄糖掺入率及残余125I-胰岛素结合率明显低于未用高胰岛素诱导的HepG2细胞(对照细胞)。将高胰岛素诱导培养的HepG2细胞置于不含胰岛素的培养液中60h,其细胞葡萄糖摄取率仍明显低于对照细胞。将HepG2细胞置于5×10-7mol/L胰岛素环境中24h,该细胞对胰岛素的生物学效应产生抵抗,其胰岛素抵抗状态可维持60h。     

重组人胰岛素的纯化及其性质的初步研究

构建含有人胰岛素原基因的重组载体,并在大肠杆菌表达系统中进行高效表达。表达产物经变性、复性、凝胶过滤纯化后,再经胰蛋白酶和羧肽酶B酶切作用,产物经离子交换层析纯化得到重组人胰岛素,且具有天然生物学活性。     

胰岛素B链C端及B29Lys氨基在胰岛素促生长功能中的作用

利用结晶紫测定细胞生长的方法,在９６孔板培养的小鼠乳腺癌细胞ＧＲ２Ｈ６中,建立了胰岛素促细胞生长活力的测定体系。该方法具有灵敏度高,重复性好,操作简便,周期短及便于大量样品分析测试的优点。利用该方法研究了胰岛素Ｂ链Ｃ端延长与缩短的类似物和胰岛素侧链氨基对胰岛素促生长活性的影响。结果显示,胰岛素Ｂ链Ｃ端在胰岛素的促生长活性中有重要作用;Ｂ链２９Ｌｙｓ氨基对促生长活性也有较大贡献。     

3个六肽的胰岛素受体结合和体内生物活性

为了研究胰岛素受体结合部位的结构和功能,设计并用固相方法合成了３个六肽．在浓度大于１×１０３ｎｍｏｌ／Ｌ时,ｃｙｃｌｏ（Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ）具有明显的胰岛素受体结合活力;Ｈ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－ＯＨ的这一活力则不明显;而Ｈ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨ则增强胰岛素和其受体的亲和性．然而,它们都没有体内生物活性．这表明：环六肽部分模拟了胰岛素受体结合部位的空间构象;胰岛素受体结合部位的疏水性和其中的Ｂ２３Ｇｌｙ－Ｂ２４Ｐｈｅ－Ｂ２５Ｐｈｅ对胰岛素和其受体的结合起重要作用．     

Swainsonine对胰岛素受体功能影响的研究

以Ｓｗａｉｓｏｎｉｎｅ（Ｓｗ）作为高尔基体付糖链加工酶系中α－甘露糖苷酶Ⅱ的特异抑制剂,研究Ｎ－糖链结构和胰岛素受体（Ｉｎｓ－Ｒ）功能的关系．发现Ｓｗ不影响细胞生长和３Ｈ－亮氨酸参入ＳＭＭＣ７７２１细胞,但明显促进３Ｈ－甘露糖参入细胞总糖蛋白和表面糖蛋白,并使后者的ＣｏｎＡ强结合组分显著增加,提示Ｓｗ使Ｉｎｓ－Ｒ的Ｎ－糖链变成杂合型及高甘露糖型。胰岛素结合试验后作Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析：发现Ｓｗ不改变Ｉｎｓ－Ｒ的结合容量和每个细胞表面的结合位点数,也不改变结合动力学。再用部分纯化的Ｉｎｓ－Ｒ研究自身磷酸化和对外源底物的酪氨酸蛋白激酶活力,也未发现Ｓｗ处理和对照细胞间的明显区别,表示Ｓｗ也不影响Ｉｓｎ－Ｒ的跨膜信息传递,结合已报道的衣霉素使细胞表面Ｉｎｓ－Ｒ减少的结果,提示Ｉｎｓ－Ｒ运送至细胞膜需要Ｎ－糖链存在,但糖链的类型对ＩＮＳ－Ｒ的代谢和结合动力学并不重要     

一个未知的特异结合雌激素效应元件编码链的单链结合蛋白

本文介绍一个不是雌激素受体（ＥＲ）却能专一地结合雌激素效应元件（ＥＲＥ）编码单链的单链结合蛋白,对此蛋白在细胞中的定位、组织中的分布、热稳定性、同二价金属离子的关系作一初步研究。发现其受雌激素负调控。此蛋白在人病理样品２９例乳癌中同ＥＲ的含量似有一定的负相关关系,讨论了上述结果的意义。     

胰岛素及胰高血糖素对HepG2细胞载脂蛋白CⅢ受体功能的影响

为寻求一种可替代人肝细胞研究载脂蛋白（apolipoprotein, apo）CⅢ受体的生理模型,并探讨apoCⅢ受体的生理功能及其在内源性高甘油三酯血症发病机制中的作用,首先以¹²⁵I标记的人apoCⅢ为配体,利用放射性配体结合分析法观察了人肝癌细胞系HepG2细胞是否有apoCⅢ受体存在.结果证实HepG2细胞上存在高亲和力的、可饱和的、特异的apoCⅢ受体结合位点,其受体的亲和力(K_d)和apoCⅢ受体结合容量(B_max)分别为(9.53±1.03)×10^-9 mol/L和(3.28±0.31) μg/g.随后又分别研究了胰岛素及胰高血糖素对HepG2细胞apoCⅢ受体功能的影响,结果表明：胰岛素可使HepG2细胞apoCⅢ受体结合容量（B_max）显著增加,但对受体的亲和力（K_d）无影响;胰高血糖素可使HepG2细胞apoCⅢ受体亲和力显著下降（即K_d值升高）,对受体的结合容量无影响.提示人肝apoCⅢ受体的功能可能受胰岛素及胰高血糖素的不同调节.     

胰岛素对βTC-3细胞胰岛素受体表达的作用

目的：观察外源性胰岛素对小鼠胰岛β细胞瘤细胞株βTC-3细胞胰岛素受体表达的影响。方法：采用免疫荧光细胞化学技术结合激光扫描共聚焦显微镜观察高浓度胰岛素（100 IU/ml）刺激不同时间（0 min、30 min、60 min、120 min、240 min）,培养的βTC-3细胞胰岛素受体的表达,用Image pro plus软件对胰岛素受体的荧光强度进行了半定量分析。结果：与0 min比较,胰岛素孵育30 min、60 min、120 min、240 min时胰岛素受体荧光强度均明显下降（P〈0.05）。结论：高浓度胰岛素孵育βTC3细胞后,可明显下调胰岛素受体的表达,这可能是高胰岛素血症导致胰岛素抵抗产生的机制之一。     

胰岛素对βTC-3 细胞胰岛素受体表达的作用

目的:观察外源性胰岛素对小鼠胰岛β细胞瘤细胞株βTC-3细胞胰岛素受体表达的影响。方法:采用免疫荧光细胞化学技术结合激光扫描共聚焦显微镜观察高浓度胰岛素(100 IU/ml)刺激不同时间(0 min、30 min、60 min、120 min、240 min),培养的βTC-3细胞胰岛素受体的表达,用Image pro plus软件对胰岛素受体的荧光强度进行了半定量分析。结果:与0 min比较,胰岛素孵育30 min、60 min、120 min、240 min时胰岛素受体荧光强度均明显下降(P<0.05)。结论:高浓度胰岛素孵育βTC3细胞后,可明显下调胰岛素受体的表达,这可能是高胰岛素血症导致胰岛素抵抗产生的机制之一。     

前列腺癌细胞结合单链抗体的克隆表达及其功能初步研究

目的:在获得纯化的前列腺癌细胞结合单链抗体scFvP-9后,对其生物学功能进行初步探讨,为前列腺癌的诊断和治疗奠定基础。方法:利用MTT比色实验初步研究了scFvP-9对多种肿瘤细胞及正常肝细胞HL02的生物学作用,并建立人宫颈癌的裸鼠模型,进行了抑瘤实验。结果:scFvP-9不影响HL02细胞及恶性程度低的人前列腺癌细胞LNCaP的生长,但对人前列腺癌细胞PC3、人宫颈癌细胞HeLa、人肺癌细胞PLA801D均有生长抑制作用;scFvP-9在荷瘤模型体内也显示了较好的抑瘤效果,与对照组相比有显著性差别,且瘤周皮下给药组效果更为显著。结论:该抗体具有潜在的重要临床应用价值。     

胰岛素样生长因子1的结构与功能研究进展

胰岛素样生长因子1(IGF1)是一种多功能细胞调控因子.它的结构特征为其促生长和物质代谢功能提供依据.集中介绍了IGF1的三维结构、IGF1与相关受体和结合蛋白的结合区以及二硫键在蛋白质折叠中的重要作用.     

一株针对人EGFR的单链抗体克隆与哺乳细胞表达

目的:制备特异性抗人表皮生长因子受体(EGFR)的单链抗体(sc Fv),鉴定其生物学活性,为进一步研究基于单链抗体的免疫治疗奠定基础。方法:从分泌抗人EGFR单克隆抗体的杂交瘤细胞系提取总RNA,利用5'RACE技术扩增轻链和重链可变区(VL、VH)基因,构建具有VL、VH基因的单链抗体基因,并将构建的单链抗体基因克隆到真核细胞表达载体pc DNA3.1中进行表达和鉴定。ELISA鉴定单链抗体对抗原的特异性;Fortebio检测抗原抗体间的亲和力,流式细胞术检测单链抗体结合肺癌细胞系天然EGFR的功能活性。结果:获得唯一的轻重链可变区序列VL、VH,成功构建EGFR-sc Fv,特异性与天然EGFR蛋白结合,亲和力达3.22×10-9mol/L。结论:成功构建了抗人EGFR单链抗体,为肺癌免疫导向治疗研究奠定了基础。     

[B2-Lys]-胰岛素的制备与性质

本文报道了用化学半合成途径从天然猪胰岛素制备[B2-Lys]-胰岛素的过程。人胎盘细胞膜胰岛素受体结合试验表明:[B2-Lys]-胰岛素的受体结合能力只有天然胰岛素的80％,降兔血糖作用与时间关系的结果表明它没有长效作用。本文还对这些结果进行了讨论。     

胰岛素受体家族的结构与功能研究

胰岛素（insulin）与胰岛素样生长因子-1（IGF-1）分别是由胰岛β细胞和肝细胞分泌的 多肽类激素.它们通过结合并激活位于细胞膜上的受体酪氨酸激酶(RTKs),发挥重要的生理作用. 作为起始信号传导的第一步,胰岛素与IGF-1是如何与各自受体的膜外区域（ectodomain） 结合并进一步激活受体的细胞膜内酪氨酸激酶活性一直属于科学研究的关键基础问题.本文 概述了胰岛素受体家族（IR和IGF-1R）及其配体的结构与功能的特点和关系,并重点介绍 了近年来国内外在胰岛素受体家族复合体结构和功能上的研究手段和取得的突破性进展.     

3T3-L1脂肪细胞对MIN6胰岛素细胞中Kir6.2表达的抑制作用

为明确脂肪细胞对胰岛素细胞中KATP通道表达的直接影响,MIN6胰岛素细胞被分为两组：一组为对照组,一组与分化的3T3-L1脂肪细胞共培养1周。运用半定量RT-PCR方法测定MIN6细胞中KATP通道蛋白Kir6．2的表达变化,Fura-2荧光方法测定MIN6细胞内钙浓度的变化,放射免疫测定方法明确MIN6细胞的胰岛素分泌功能。结果显示,与3T3-L1脂肪细胞共培养1周后,MIN6细胞中Kir6．2的表达明显减少,其表达水平降低为对照组的65．3％。对照组MIN6细胞在0．1mmoi／L甲苯磺丁脲(KATP通道关闭剂)的刺激下,表现为细胞内钙水平显著性升高和胰岛素分泌显著性增加,而共培养组MIN6细胞则失去了甲苯磺丁脲刺激所引起的细胞内钙升高及胰岛素分泌反应。以上实验结果表明,3T3-L1脂肪细胞可以通过分泌一些活性因子直接降低MIN6细胞中KATP通道蛋白的表达和合成,损害MIN6细胞的胰岛素分泌功能。实验结果提示脂肪细胞直接参与2型糖尿病中胰岛β细胞功能障碍的发生。     

胰岛素受体胞外区三维结构的模建及结构功能关系

利用计算机辅助分子设计技术模建了人胰岛素受体α亚基N端三个结构域的空间结构。实验研究证明胰岛素受体结合胰岛素的主要决定要素在这三个结构域,在模建的结构中,三个结构域围成了一个很大的开放的空洞,这个空洞的体积大小足以容纳一个胰岛素分子,这个空洞可能就是胰岛素受体与底物的作用的部位,另外,突变实验研究表明在胰岛素受体中有一个结合底物的“footprint”,由4个在一级结构上不连续的片段组成,从三维结构角度看,这4个片段中,有3个出现在邻近的平行折叠股,在我们的模型中,胰岛素受体分子中有一个两性表面,这个表面位于L1结构域,并且面向三个结构域围成的空洞,这个表面可能就是受体识别胰岛素和与底物发生初始作用的部位。“foot-print”和两性表面的大部分残基是相同的。     

2型糖尿病视网膜病变与胰岛素抵抗及β细胞功能的关系

目的:探讨新疆汉族2型糖尿病视网膜病变(DR)与胰岛素抵抗(IR)及β细胞功能的关系.方法:免散瞳眼底照相行眼底筛查我院内分泌科住院病人及体检正常人群258例,正常人(NC)83例、糖尿痛无视网膜病变(NDR)60例、糖尿病视网膜病变(DR)115例.测定其空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FINS),计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR指数)、β细胞功能指数(HOMA-β指数),并测定其临床一般资料,记录身高、体重等.结果:NDR组、DR组HOMA-IR指数、HOMA-β指数明显高于NC组,差异有统计学意义(p<0.05),但NDR组与DR组相比,HOMA-IR指数、HOMA-β指数差异无统计学意义(p>0.05).2型糖尿病视网膜病变与FBG、FINS、HOMA.IR、HOMA-β呈正相关(p<0.01).多元Logistie回归分析显示病程、吸烟史、TG、Tc、尿微量白蛋白(UAE)、糖化血红蛋白(HbAlc)、血尿酸(SUA)、收缩压(SBP)HOMA-IR、HOMA-β为DR的危险因素.校正这些因素后DR仍与UAE、SUA、SBP、HOMA-IR、HOMA-β相关.结论:DR的发生与发展除了与病程、脂代谢紊乱、吸烟有关外,还与IR、β细胞功能、UAE及SUA等有关.