腐败梭菌α毒素基因的克隆表达及其类毒素的免疫原性研究

根据GenBank公布的腐败梭菌α毒素基因序列,设计了一对引物,并以腐败梭菌基因组为模板,经PCR特异性扩增出腐败梭菌菌株HeB01的α毒素基因。序列分析表明,该基因产物大小为1323bp,与GenBank报道的4个腐败梭菌参考菌株α毒素基因序列同源性高于99·5%。将扩增的α毒素基因定向克隆到原核表达载体pQE30中,得到重组质粒pQE30-α,将重组质粒转化大肠杆菌M15中,得到重组菌株M15(pQE30-α),经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析可见表达的48kD特异条带;Westernblot和ELISA检测实验表明:表达的α毒素与抗天然α毒素抗体发生特异性反应,说明α毒素蛋白具有较好的免疫原性。将表达的α毒素蛋白制成类毒素疫苗,免疫小鼠后,具有一定的保护能力,表明该重组菌株有望作为腐败梭菌基因工程类毒素疫苗的候选生产菌株。     

产气荚膜梭菌ε毒素导致多器官组织损伤

【背景】产气荚膜梭菌ε毒素(ε toxin,ETX)是由B型和D型产气荚膜梭菌产生的一种肠毒素,具有迅速的致命性和经济上的破坏性。【目的】研究ETX对小鼠多个脏器的损伤情况及其在不同小肠肠段的结合情况。【方法】构建纯化偶联红色荧光蛋白的mScarlet-ETX,使用小动物活体成像观察其在小鼠体内的累积情况;使用病理学技术观察ε毒素对小鼠各个脏器和不同肠段的结合情况,以及对脏器的损伤情况。【结果】产气荚膜梭菌感染后,产生的ETX能累积于脑、肾、肺、肝、脾和心脏组织中,并能导致这些脏器的损伤。ETX在小鼠的小肠中主要累积于结肠中。【结论】产气荚膜梭菌ε毒素导致多器官组织损伤,并主要在结肠上被吸收,为治疗和预防携带ε毒素的产气荚膜梭菌感染提供了理论依据。     

首次自肉毒中毒食品中分离的一株产生E型肉毒毒素的酪酸梭菌

对某卫生防疫站委托本研究室分离病原菌的一份引起肉毒中毒的食品一＂黄豆冬瓜酱＂进行检测和病原菌的分离,从中再次检出了Ｅ型肉毒毒素并分离到一产毒菌种,对该菌种的生物学及生化学特性进行检查,并检测其毒素基因（ＰＣＲ试验）。结果：该分离菌能产生Ｅ型肉毒毒素,ＰＣＲ检测结果也证明其具有Ｅ型肉毒神经毒素基因,但其多项生化特性与Ｅ型肉毒梭菌有明显差异,而与酪酸梭菌完全一致。结果说明该分离菌系产生Ｅ型肉毒毒素的酪酸梭菌,而非Ｅ型肉毒梭菌。由酪酸梭菌引起的食物中毒型肉毒中毒并从中毒食品中分离到该病原菌,这在国际上尚属首次报告。     

难辨梭菌毒素的免疫电镜观察

本文用兔抗难辨梭菌毒素A标记在难辨梭菌48小时培养物中产生的毒素上,再用葡萄球菌A蛋白(Staphylococcus protein A,SPA)胶体金(PAG)标记,即可在电镜下观察到清晰可见的毒素颗粒。     

酶联免疫吸附试验检测艰难梭菌A毒素

实验用兔单特异抗艰难梭菌Ａ毒素ＩｇＧ包被酶标板,以羊抗艰难梭菌Ａ毒素ＩｇＧ标记辣根过氧化物酶作为第二抗体,采用双抗体夹心ＥＬＩＳＡ法检测艰难梭菌Ａ毒素,可检测出０．９４ｎｇ的精制Ａ毒素,对６１株菌的培养液及６５份健康人粪便标本检测发现此法具有较高的特异性。用平行线定量法对几份典型产毒培养物进行了定量测定,结果表明,在一定剂量范围内线性及平行性好,结果准确、可靠。可用于临床粪便标本中艰难梭菌Ａ毒素的筛查及定量检测。     

多重PCR鉴定不同毒素型的产气荚膜梭菌菌落

参照文献报道的产气荚膜梭菌a, b, e, t 毒素基因cpa、cpb、etx 及iA序列合成了针对4种毒素基因的4对特异引物, 建立了一种简单的产气荚膜梭菌定型的菌落多重PCR方法。结果本所保存的A, B, C, D, E各型产气荚膜梭菌参考菌株均扩增出了相应的预期条带, 而诺维氏梭菌、腐败梭菌和破伤风梭菌的扩增均为阴性; 将单个菌落稀释100倍利用此菌落多重PCR仍能扩增到相应的目的片段。并利用此多重PCR对13株不同动物来源的产气荚膜梭菌进行了定型鉴定, 并与毒素中和试验鉴定结果进行了比较, 结果表明两种方法具有较高的符合率。本方法的建立对于产气荚膜梭菌的快速检测、定型具有十分重要的意义。     

E型内毒毒素的分子生物学研究进展

Ｅ型肉毒毒素不同于Ａ型肉毒毒素及具有蛋白分解性的Ｂ,Ｆ型肉毒毒素,具有自身的特点。本文就Ｅ型肉毒毒素的结构,激活及作用机制,Ｅ型肉毒毒素的精制特点,基因结构及酪酸梭菌产生Ｅ型肉毒毒素的机制探讨等四个方面予以介绍。     

多重PCR鉴定不同毒素型的产气荚膜梭菌菌落

参照文献报道的产气荚膜梭菌α,β,ε,τ毒素基因cpa、cpb,etx及iA序列合成了针对4种毒素基因的4对特异引物,建立了一种简单的产气荚膜梭菌定型的菌落多重PCR方法.结果本所保存的A,B,c,D,E各型产气荚膜梭菌参考菌株均扩增出了相应的预期条带,而诺维氏梭菌、腐败梭菌和破伤风梭菌的扩增均为阴性;将单个菌落稀释100倍利用此菌落多重PCR仍能扩增到相应的目的片段.并利用此多重PCR对13株不同动物来源的产气荚膜梭菌进行了定型鉴定,并与毒素中和试验鉴定结果进行了比较,结果表明两种方法具有较高的符合率.本方法的建立对于产气荚膜梭菌的快速检测、定型具有十分重要的意义.     

E型肉毒毒素的分子生物学研究进展

Ｅ型肉毒毒素不同于Ａ型肉毒毒素及具有蛋白分解性的Ｂ、Ｆ型肉毒毒素,具有自身的特点。本文就Ｅ型肉毒毒素的结构、激活及作用机制、Ｅ型肉毒毒素的精制特点、基因结构及酪酸梭菌产生Ｅ型肉毒毒素的机制探讨等四个方面予以了介绍。     

产气荚膜梭菌α毒素研究进展

产气荚膜梭菌是引起各种动物坏死性肠炎,肠毒血症,人类的食物中毒和战创伤性气性坏疽的主要病原菌之一,该菌分为Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ６型,其致病因子是菌体产生的外毒素。到目前为止,已发现的外毒素有１２种之多,但各型产气荚膜梭菌均产生α毒素（ＣＰＡ）,故以α毒素最为重要。近年来,国外学者对α毒素的组成,结构,作用机制及分子遗传学等方面都作了较为深入的研究,现将有关情况介绍如下。     

弧菌三联融合毒素基因表达及ELISA检测方法建立

采用柔性Linker(GGGGS)和重叠延伸PCR方法将三个毒素基因, 即副溶血性弧菌的耐热型直接溶血素基因tdh、创伤弧菌的溶细胞毒素基因vvhA和拟态弧菌的热不稳定型溶血素基因vmhA的成熟蛋白基因片段进行串联, 得到三联融合毒素基因tdh-vvhA-vmhA(命名为FT)。一致性比对分析与预计融合的基因序列一致性为99.6%。FT的开放阅读框架全长3225 bp, 编码1074个氨基酸残基, 预测分子量为120.4 kDa。将FT亚克隆至表达载体pET-22b(+)中, 再转化至E. coli BL21 (DE3)中进行表达, 经SDS-PAEG分析, 融合蛋白分子量与预测的相符。终浓度为1mmol/L的IPTG, 37 ℃诱导4 h, 融合毒素蛋白表达量最高, 经薄层扫描分析, 此时融合毒素蛋白占全菌体蛋白的11.49%。融合毒素蛋白包涵体经纯化, 免疫豚鼠制备血清抗体, 确定间接ELISA的最佳工作条件, 并进行敏感性、特异性、重复性及模拟样品检测试验, 建立了食物中毒性弧菌广谱、快速、特异的同步免疫学检测方法。     

上海部分地区儿童艰难梭菌相关性腹泻的临床分析

本文旨在监测儿童腹泻中艰难梭菌相关性腹泻(CDAD)的发病情况,并对其进行回顾性临床分析。对复旦大学附属儿科医院2007年2月～9月111例腹泻患儿的粪便标本进行艰难梭菌毒素A检测及粪便厌氧菌培养,对所有患儿进行回顾性病史采集及分析,并对粪便培养所得的4株艰难梭菌菌株用多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)技术进行同源性分析。111例患者中,艰难梭菌毒素A检测及艰难梭菌培养均为阳性者无,艰难梭菌毒素A阳性而艰难梭菌培养阴性者16例,艰难梭菌毒素A阴性而艰难梭菌培养阳性者4例,艰难梭菌毒素A及艰难梭菌培养均阴性者91例。比较院内、院外组3种不同病程腹泻CDAD的发病率,无显著差异。MLVA分析发现粪便培养得到的4株艰难梭菌菌株有部分同源性。结果提示,目前上海部分地区儿童CDAD发病情况为散发,但彼此之间有部分同源性;院内、外获得性腹泻的CDAD发病率无显著差异;艰难梭菌毒素A阳性或艰难梭菌培养阳性的病例在临床表现上与艰难梭菌毒素A阴性且艰难梭菌培养阴性的腹泻病例无显著差异。     

梭菌神经毒素分子作用机制的相关研究进展

厌氧梭菌产生的神经毒素可以引起严重的神经失调,甚至威胁生命.作为具有很高同源性的7种毒素分子,它们既具有相似的发病机制又有不尽相同的结构基础和分子作用方式,从而产生不同的毒素活性.主要就神经毒素分子作用机制相关的毒素蛋白结构、毒素受体、毒素活性的发生、毒素与底物的作用、底物的调节作用与应用等内容的研究进展作一综述.     

梭菌神经毒素的研究进展

梭状芽孢杆菌属包括许多可以形成芽孢的革兰阳性棒状杆菌,它们广泛分布于自然界中,包括土壤、海洋和淡水沉积物中。在家畜、鸡,以及人等哺乳动物的肠道中也经常能发现肉毒梭菌。许多梭状芽胞杆菌可以产生神经毒素,如肉毒毒素、破伤风毒素和产气荚膜梭菌ε毒素,分别由肉毒梭菌、破伤风梭菌和产气荚膜梭菌产生。这些梭菌神经毒素毒性非常强,可以引起人类或动物发病,如肉毒中毒、破伤风、羊肠毒血症等,给人类的健康和养殖业带来许多危害,一直是重要的研究对象。近年来,梭菌神经毒素在结构与受体以及检测、防控方面取得了较大的进展,现从以上方面综述这3种毒素的研究进展。     

A型肉毒神经毒素基因的PCR检测

目的:建立快速筛查A型肉毒毒素的PCR方法。方法:根据GenBank中报道的肉毒毒素基因序列,综合应用多种生物软件分析设计特异的检测引物,从提取的基因组DNA、热裂解产物和菌液等不同形式的模板中扩增大小为457bp的A型肉毒毒素特异基因片段,以肉毒梭菌其他血清型及破伤风梭菌为对照。结果:检测方法无交叉反应,灵敏度可达10pgDNA,3×103个菌。结论:建立的检测方法特异性强、灵敏度高,可以用于A型肉毒毒素基因的快速筛查。     

C型肉毒毒素的制备及类毒素保护力初探

将C型肉毒梭菌经适宜条件的产毒培养后纯化,并进行相关鉴定。制备的C型肉毒毒素用分段脱毒法脱毒,并进行类毒素保护力的初步研究。以不同蛋白含量C型肉毒类毒素免疫小鼠后攻毒,结果显示,蛋白含量为0.625μg的类毒素免疫2针或蛋白含量为1.25μg的类毒素免疫1针均可保护50LD50的C型肉毒毒素攻击。蛋白含量为5μg的C型肉毒类毒素与福氏不完全佐剂配制的抗原免疫小鼠3次所得抗血清的保护力(Anti LD50/ml)为4.3×104。说明用该纯化工艺制备的C型肉毒类毒素具有很好的免疫原性,作为抗原成分用于C型肉毒疫苗和C型肉毒抗毒素的研究和生产具有较好的应用潜力。     

无菌大白鼠肠道中破伤风梭菌的生长和毒素的产生

<正>梭菌是在全世界范围内广泛分布的厌气性芽胞菌。肉毒梭菌和破伤风梭菌能产生较强的神经毒素,分别引起典型的肉毒中毒和破伤风疾病。肉毒中毒大都和吃污染肉毒毒素的食物有关。过去一直认为肉毒梭菌在肠道中不能生长和产生毒素;但是,近来的研究表明,肉毒梭菌能在新生小鼠和新近给了广谱抗菌素治疗的成鼠肠道中生长并产生毒素。最近认识到,新生儿肉毒中毒乃是婴儿猝死症的原因之一。因为肉毒梭菌芽胞能在     

丙酮丁酸梭菌胞浆蛋白质组的系统研究

为了建立丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)蛋白质组的研究方法,采用超声波破碎细胞,并结合丙酮沉淀分离蛋白的方法,提取丙酮丁醇梭菌胞浆蛋白质,发现加入罗氏蛋白酶抑制剂能有效地减少提取过程中蛋白质的降解。通过二维电泳技术对其胞浆蛋白进行有效分离,在pH 4～7的胶上分离出大约1230个蛋白点。利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱成功鉴定了19个蛋白质。这些蛋白质组研究方法对于缺少蛋白质组研究的梭菌属具有一定的参考价值。     

自生牛肉分离的一株E型肉毒梭菌

我们曾于1966年4月,检查了一份可疑的在我国某高原地区引起食物中毒的生牛肉,并从中分离到一株E型肉毒梭菌。 1．被检的生牛肉系经过冬藏并有部分腐烂的现象,每克约含1,000小白鼠致死量的E型肉毒毒素。 2．从该生牛肉分离的一株厌氧性梭状芽孢杆菌,经细菌学和毒素血清学实验,鉴定为E型肉毒梭菌,编号为E66418。 3．本文指出,E型肉毒中毒及该菌的生态分布并不一定都同海洋有关。     

贝类毒素监测的动物试验优化及替代方法

贝类毒素严重威胁水产品的质量,而且给人类健康带来潜在危害。由于其结构多样、作用机制复杂,贝类毒素监控计划通常使用动物方法,不仅成本高、定量难,而且不符合＂3R＂的要求。运用减轻动物痛苦和减少数量的优化方法,开发新的基于毒性作用机制和结构分析的细胞功能检测法、免疫学方法、化学分析法和生物传感器方法,这些动物试验替代方法的研究提高了贝类毒素监测的有效性,经过科学验证和认可后可用于监控目的 。