人多肽N-乙酰氨基半乳糖转移酶2基因反义RNA表达质粒的构建及其功能的初步研究

反义封闭人多肽N-乙酰氨基半乳糖转移酶2 (pp-GalNAc-T2)的基因表达, 对胃癌细胞SGC7901中转化生长因子-β1(TGF-β1)与基质金属蛋白酶2 (MMP2)基因表达及细胞增殖有影响.在对几株肿瘤细胞的pp-GalNAc-T2基因表达水平进行分析后, 以高表达pp-GalNAc-T2的人胃癌细胞株SGC7901的总RNA为模板, 利用RT-PCR方法扩增两段不同长度pp-GalNAc-T2基因片段, 构建反义表达载体转染胃癌细胞SGC7901, 通过Ｇ418筛选, 建立一系列旨在封闭胃癌细胞SGC7901 ppGalNAc-T2基因表达的亚细胞克隆.通过流式细胞术、荧光显微镜、RT-PCR及Western印迹检测反义封闭pp-GalNAc-T2基因RNA表达后胃癌细胞SGC7901增殖以及TGF-β1、MMP2表达水平的变化. 反义封闭pp-GalNAc-T2基因表达后, 胃癌细胞SGC7901 pp-GalNAc-T2的表达水平明显降低, 细胞分裂增殖减慢, 表明反义封闭pp-GalNAc-T2基因表达对胃癌细胞SGC7901的生长增殖有影响.结果还显示, 反义封闭pp-GalNAc-T2基因表达可使TGF-β1、MMP2基因在mRNA与蛋白质表达水平均增加, 提示pp-GalNAc-T2基因表达可能对胃癌细胞SGC7901浸润转移产生影响.以上结果表明, pp-GalNAc-T2基因在肿瘤细胞中广泛表达, 并可能与肿瘤的增殖及浸润转移相关.     

RNA干扰NRP2基因表达对胃癌细胞SGC7901裸鼠移植瘤的抑制作用

目的:探讨特异性抑制NRP2基因表达对人胃癌细胞SGC7901裸鼠移植瘤生长及淋巴管新生的影响。方法:采用小RNA干扰方法,构建shNRP2质粒,稳定转染入SGC7901细胞株,Westen blot检测转染前后NRP2蛋白的表达。建立人胃癌细胞SGC7901裸鼠移植瘤模型,随机分为shNRP2组(实验组)、shCon组(HK阴性对照组)和正常对照组,观察移植瘤的生长情况。6周后处死裸鼠,免疫组化检测NRP2蛋白的表达及微淋巴管密度(Micro-vessel density,MLD)。结果:成功构建shNRP2质粒,与另两组比较,shNRP2组细胞NRP2蛋白表达明显降低,且移植瘤组织生长、NRP2表达及MLD明显受抑制。结论:抑制NRP2基因的表达,可以抑制胃癌裸鼠移植瘤的生长及淋巴管的形成,NRP2基因有可能成为一个潜在的胃癌生物治疗靶点。     

重组抗HER2 ScFv/tBid 基因的表达对SGC7901胃癌细胞的促凋亡作用

目的：构建重组抗HER2 ScFv/tBid载体并观察其对胃癌SGC7901细胞的促凋亡作用。 方法： 将重组抗HER2 ScFv/tBid基因克隆入真核表达载体pCMV中,转染SGC7901细胞,用RT-PCR方法检测目的基因在mRNA水平的表达,间接免疫荧光法检测目的蛋白表达和细胞形态学变化,通过细胞计数检测转染目的基因后对细胞生长的影响,通过检测细胞周期来观察其促凋亡作用。 结果：转染SGC7901细胞后,检测出目的蛋白的表达。细胞计数发现细胞的增殖被明显抑制。细胞周期分析有明显的凋亡峰出现,说明重组抗HER2 ScFv/tBid表达后有促凋亡作用。 结论： 重组抗HER2 ScFv/tBid基因可以在转染的SGC7901细胞中表达,并且可抑制转染细胞的生长,诱导细胞发生凋亡。     

冬凌草活性部位逆转SGC7901/ADR细胞多药耐药性的体外研究北大核心CSCD

以SGC7901和SGC7901/ADR为细胞模型,检测了冬凌草活性部位与化疗药物联用后,对SGC7901/ADR耐药性的逆转效应;冬凌草活性部位处理细胞后,检测耐药细胞内阿霉素的蓄积变化、耐药细胞P-糖蛋白(P-gp)的表达水平以及mdr1基因的表达变化。结果显示,冬凌草氯仿部位和乙酸乙酯部位可以有效提高化疗药物阿霉素在SGC7901/ADR细胞内的蓄积,降低P-gp的表达,降低mdr1基因的转录。冬凌草逆转胃癌耐药细胞SGC7901/ADR多药耐药性的活性部位是冬凌草氯仿部位和乙酸乙酯部位,其逆转作用与抑制P-gp的表达相关。     

索拉非尼联合顺铂对胃癌SGC7901细胞的抑制作用

目的:探讨索拉非尼联合顺铂(DDP)对胃癌SGC7901细胞的抑制作用以及可能的分子机制.方法:选取人胃癌细胞株SGC7901,用索拉非尼和DDP单药或联合作用于细胞,观察最佳抑制效果.MTT法检测索拉非尼、DDP及两药联用对胃癌SGC7901细胞的增殖抑制作用并计算半数抑制浓度(IC50);用流式细胞仪检测细胞凋亡;用Western blot观察ERK及pERK蛋白的表达.结果:MTT检测结果显示胃癌SGC7901细胞经索拉非尼、DDP单独处理以及两者联合处理后,在不同浓度均能出现细胞生长抑制作用,并且其抑制作用呈时间-剂量依赖效应.与单药组相比,联合作用组对细胞的抑制率明显增高,表现为协同作用(P＜0.05).流式细胞仪检测凋亡的结果显示,经药物处理后细胞凋亡率均较空白对照组升高,两药联合作用的凋亡率要明显高于单药组.单药组及联合用药组对SGC7901细胞ERK的表达无明显影响,但是pERK在单用索拉非尼及联合用药组的表达则降低,以联合用药组尤甚.结论:索拉非尼联合顺铂对胃癌SGC7901细胞有增殖抑制及促凋亡的作用,两药联合表现为协同作用,其机制可能与细胞增殖通路Raf/MEK/ERK的机制有关.     

冬凌草活性部位逆转SGC7901/ADR细胞多药耐药性的体外研究

以SGC7901和SGC7901/ADR为细胞模型,检测了冬凌草活性部位与化疗药物联用后,对SGC7901/ADR耐药性的逆转效应;冬凌草活性部位处理细胞后,检测耐药细胞内阿霉素的蓄积变化、耐药细胞P-糖蛋白(P-gp)的表达水平以及mdr1基因的表达变化。结果显示,冬凌草氯仿部位和乙酸乙酯部位可以有效提高化疗药物阿霉素在SGC7901/ADR细胞内的蓄积,降低P-gp的表达,降低mdr1基因的转录。冬凌草逆转胃癌耐药细胞SGC7901/ADR多药耐药性的活性部位是冬凌草氯仿部位和乙酸乙酯部位,其逆转作用与抑制P-gp的表达相关。     

长链非编码RNA UCA1在胃癌多药耐药中的作用研究

目的:研究胃癌耐药细胞及其亲本细胞中长链非编码RNA UCA1的表达差异,探讨UCA1在胃癌多药耐药中的作用。方法:通过实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测胃癌耐药细胞SGC7901/ADR、SGC7901/VCR及其亲本细胞SGC7901中UCA1的表达差异;通过si RNA转染降低SGC7901/ADR中UCA1表达,MTT法检测细胞半数抑制浓度(IC50)的变化,流式细胞仪检测细胞凋亡变化。结果:QRT-PCR结果显示,UCA1在SGC7901/ADR和SGC7901/VCR胃癌耐药细胞表达显著高于SGC7901胃癌亲本细胞;MTT实验表明,干扰UCA1的SGC7901/ADR相对于阴性对照(NC)组的IC50显著降低;凋亡检测结果显示,在相同剂量化疗药物作用下,干扰UCA1后SGC7901/ADR凋亡率显著高于NC组;Western blot证实,干扰UCA1表达可显著降低BCL-2蛋白表达。结论:长链非编码RNA UCA1在胃癌耐药细胞表达显著升高,干扰UCA1表达可明显逆转胃癌耐药,UCA1可作为治疗胃癌耐药的重要分子靶标。     

比较NRP-1反义寡核苷酸与VEGFR-2反义寡核苷酸对人胃癌SGC7901细胞增殖和凋亡的影响

目的:研究比较神经纤毛蛋白1(NRP-1)反义寡核苷酸(ASODN)与血管内皮生长因子受体2(VEGFR-2)反义寡核苷酸(ASODN)对人胃癌SGC7901细胞增殖活性及凋亡水平的影响。 方法:分别及同时将不同浓度经硫代磷酸化修饰的NRP-1 ASODN 和 VEGFR-2 ASODN 转染入人胃癌SGC7901细胞,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测NRP-1基因和VEGFR-2 基因mRNA的转录水平;MTT比色法测量细胞的增殖活性;流式细胞仪测量细胞的凋亡水平。 结果:转染NRP-1 ASODN和VEGFR-2 ASODN后,人胃癌SGC7901细胞NRP-1基因和VEGFR-2 基因mRNA的转录水平均出现降低;NRP-1 ASODN和VEGFR-2 ASODN对SGC7901细胞有明显抑制增殖和促进凋亡的作用,且随着ASODN浓度升高而增强;分别转染时其作用无显著差别,联合转染时其作用明显增强。结论:NRP-1 ASODN和VEGFR-2 ASODN可抑制人胃癌SGC7901细胞 NRP-1基因和VEGFR-2 基因mRNA的转录水平及细胞增殖活性,促进细胞凋亡;与分别转染相比,两者联合转染作用明显增强。     

端粒植入胃癌7901细胞对细胞生长、端粒和端粒酶的影响

研究外源端粒片段植入胃癌7901细胞后对细胞生长、端粒长度和端粒酶活性的影响.采用lipofectTM2000介导的转染方式,将含有端粒片段质粒pSXneo-1.6-T2AG3转染胃癌细胞SGC7901,PCR在基因水平上鉴定外源性端粒片段的植入后,采用TRAP法检测转染细胞端粒酶活性变化,TRF法检测转染细胞端粒长度变化,MTT法检测细胞生长曲线,RT-PCR测定转染细胞hTERT表达变化.染色体核型分析细胞染色体变化.结果显示端粒片段成功导入SGC7901细胞后获得稳定的细胞株,端粒片段植入后细胞生长变慢,端粒长度延长不明显,端粒酶活性明显降低,hTERT mRNA表达水平下降,核型分析显示转染前后细胞染色体数目无明显变化.实验成功将携带了1600 bp端粒TTAGGG重复序列的真核表达载体pSX-T2AG3-neo稳定转染至人胃癌7901细胞中,端粒植入降低细胞端粒酶的活性和下调端粒酶活性亚单位hTERT的表达,但对端粒长度无明显影响.     

MDR1基因沉默增强紫杉醇诱导SGC7901/ADM细胞凋亡的敏感性

为了探讨MDR1基因沉默对紫杉醇诱导人胃癌SGC7901/ADM细胞凋亡的影响,本研究构建靶向MDR1基因重组干扰载体,稳定转染SGC7901/ADM细胞,流式细胞术检测P-gp外排泵功能。激光共聚焦显微镜下观察细胞形态变化,琼脂糖凝胶电泳检测DNA断裂情况。结果发现,构建的shRNA表达载体pSilencer 2.1-U6 neo-MDR1稳定转染SGC7901/ADM细胞后,细胞内Rho-123相对荧光强度升高;激光共聚焦显微镜下观察到,细胞形态发生改变,出现凋亡特征,与SGC7901/ADM细胞相比,经紫杉醇处理后SGC7901/ADM-2.1-3细胞的DNA片段化更为明显。结果表明,MDR1基因沉默增强了紫杉醇诱导SGC7901/ADM细胞凋亡的敏感性。