拟南芥FT基因原核表达载体的构建、表达和蛋白纯化

FT基因是植物成花素,在植物的开花调控中起着重要作用。构建了用于原核表达的FT-eGFP表达载体,并在大肠杆菌BL21中进行重组蛋白的诱导表达。从IPTG诱导浓度、诱导时间和诱导温度等方面进行了细致的分析,最终建立了FT-eGFP融合蛋白诱导表达的优化体系:当菌液OD600=0.6-1.0时,采用IPTG1.0mol/L,在28℃诱导表达6h。摸索和建立了利用HisTrapKit标签,经过镍柱纯化,纯化目的蛋白的技术体系,为进一步研究FT基因在植物开花调控中的应用奠定了基础。     

MBP-gldABC融合蛋白基因的原核表达载体的构建

目的：构建可高效生产甘油脱水酶的大肠杆菌工程菌,方法：将编码甘油脱水酶的三个基因gldA、gldB、gldC,分别克隆至克隆载体pMD18-T和pSIM-T中,经测序正确后,再亚克隆至表达融合蛋白的高效表达载体pMAL-c2X上,构建成表达质粒pMAL-gldABC,并转化大肠杆菌E.coli DH5α。结果：成功地将甘油脱水酶基因gldABC以同向串联方式克隆到大肠杆菌融合表达载体pMAL-c2X中,结论：得到了含gldABC基因的MBP融合蛋白表达载体,为研究甘油脱水酶基因（gldABC）的在原核表达载体中的串联表达奠定了基础。     

PTD融和蛋白的原核表达及其抗体制备

目的:为制备凋亡素重组蛋白抗体,首先获得凋亡素重组蛋白融合基因LTA,而且通过原核表达系统表达重组蛋白并制备其抗体,为进一步利用凋亡素重组蛋白导向治疗肿瘤的检测奠定基础.方法:应用重叠延伸的基因融合技术将LHRH(黄体生成激素释放激素)基因、TAT(HIV-1反式转录激活因子)基因和凋亡素基因重组,构建成凋亡素重组蛋白原核表达载体pET-28a-LTA,随后将表达质粒转入BL21菌株,经IPTG诱导表达重组融合蛋白,将已表达的重组蛋白通过Ni-NTA亲和色谱柱进行纯化,并制备LTA凋亡素重组蛋白抗体.结果:表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,LTA蛋白融合基因获得高效表达,凝胶薄层扫描分析表明表达蛋白占菌体蛋白12.6%.LTA蛋白经Ni-NTA亲和色谱柱柱纯化,以纯化蛋白为抗原免疫獭兔制备凋亡素重组蛋白抗血清.结果表明抗体的效价为1: 12800.结论:应用重叠延伸的基因融合技术获得凋亡素重组蛋白融合基因LTA,通过原核表达系统表达重组蛋白并制备其抗体.     

小鼠cofilin2蛋白的原核表达及纯化

[目的]构建小鼠cofilin2原核表达载体并纯化表达产物。[方法]以胚胎期小鼠心脏组织的c DNA为模板PCR扩增cofilin2基因,经酶切连接表达载体PGEX-4T-1后转化入大肠杆菌E. coli BL21感受态细胞中,利用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达及优化,利用SDS-PAGE凝胶电泳,考马斯亮蓝R-250进行染色,检测GST-cofilin2的表达情况。通过谷胱甘肽树脂(Glutathione Resin)亲和层析进行纯化,最后通过Western Blot进行验证。[结果]PCR成功扩增cofilin2基因,双酶切及测序结果表明p GEX-4T-1-cofilin2原核表达载体构建成功,SDS-PAGE鉴定表明,在22℃、200μmol/L的IPTG能诱导出大量可溶性的GST-cofilin2蛋白,分子量为43 k Da。Western Blot验证得到纯化的GST-cofilin2。[结论]成功构建小鼠cofilin2原核表达载体,纯化得到的重组小鼠cofilin2蛋白可用于后续的生物学研究。     

外源丙氨酸提高蜘蛛牵引丝蛋白天然基因在原核系统中的表达

蜘蛛丝蛋白天然基因的体外表达受诸多因素的限制。本研究在获得生长于中国的Nephila clavipes蜘蛛牵引丝蛋白Spidroin2 cDNA（Genbank Accession No. AF441245）的基础上,利用限制性内切酶双酶切反应构建含有Spidroin2 cDNA的重组表达质粒pET-28b(+)-Sp。将该质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）宿主细胞感受态菌中,以不同浓度的IPTG进行诱导,并通过诱导时间、培养温度、加入外源丙氨酸等途径提高Spidroin2 cDNA的表达量,同时利用多克隆抗体对表达产物进行Western blot检测。重组质粒pET-28b(+)-Sp的测序结果表明Spidroin2 cDNA基因以正确的阅读框插入到原核表达载体中;SDS-PAGE结果表明菌体表达蛋白中存在着大小约为31 kDa的目的蛋白带（加入外源丙氨酸条件下）,Western blot检测结果进一步证实,目的基因在大肠杆菌中得到正确表达。本研究证实,蜘蛛牵引丝蛋白Spidroin2 cDNA可在原核细胞内正确表达,外源丙氨酸的加入对于提高天然蜘蛛丝蛋白基因在原核系统的表达作用明显。     

绿色荧光蛋白的原核表达、纯化以及抗体制备

用PCR扩增出绿色荧光蛋白(GFP)基因,插入到pGEX-KG表达载体中,并将构建出的重组质粒命名为pKG- GFP。将重组载体导入大肠杆菌DH10β中,经IPTG诱导产生GST-GFP融合蛋白,同时以可溶蛋白和包涵体两种形式存在。 GST-GFP分子量大约为53kDa,与其理论值大小一致,用亲和层析以及凝血酶处理纯化GFP。纯化的产物经证实具有很好的 均一性。以GFP免疫新西兰家兔,制备多克隆抗体,Westernblotting测定抗血清效价。     

水稻甲基结合蛋白基因MBD701的克隆及原核表达

甲基结合域蛋白MBD作为与甲基化位点特异结合的重要反式作用因子,在植物生长发育中发挥着重要的调控作用.为了探讨MBD基因的结构与功能,利用RT-PCR方法克隆了水稻中编码甲基结合蛋白基因MBD701,构建了MBD701的原核表达载体pGEX-MBD701,并在大肠杆菌BL21(DE3)工程菌株中实现了融合蛋白GST-MBD701的表达.结果表明,MBD701除了包含典型的甲基结合域(第138～212)外,还包含CW的锌指结构(第73～132);在37℃,1 mmol/L IPTG浓度条件下成功诱导表达了大小为65.87 kD的GST-MBD701融合蛋白,这为进一步开展MBD701的蛋白纯化和功能分析奠定了基础.     

大豆GmOLPa基因的蛋白序列分析及原核表达

以盐诱导后的大豆根为材料,提取总RNA,RT-PCR得到GmOLPa目的片段。对其蛋白序列分析表明,该蛋白属于GH64-TLP-SF同源超家族中的PR-5蛋白,第25-244位氨基酸是其保守结构域,与番茄中的PR-5亲缘关系最为接近。构建GmOLPa基因ORF的原核表达载体pET-28-GP,并对其在大肠杆菌BL21中的表达条件进行优化。SDS-PAGE证实重组质粒能够在大肠杆菌BL21中表达,目的蛋白分子量约为30 kD,最佳诱导时间为4 h,最佳IPTG诱导浓度为1.0 mmol/L。     

重组人ERP57蛋白克隆和原核表达

目的：克隆人ERP57蛋白进行原核表达和纯化。方法：采用巢式RT-PCR从人非小细胞肺腺癌A549细胞总RNA中克隆人ERP57 cDNA,构建ERP57原核表达质粒（pET-28a/ERP57）并转化E.coli的BL21菌株。IPTG诱导蛋白表达,并在变性条件下经Ni-NTA树脂亲和层析纯化。分别用SDS-PAGE和Western blotting鉴定。结果：成功获得大小为1518bp的人ERP57基因片段,转化菌诱导性表达61kDa的人ERP57蛋白,该蛋白可经Ni-NTA树脂亲和层析高度纯化。结论：成功获得纯化的重组人ERP57蛋白,为后续ERP57蛋白功能研究奠定了基础。     

TAT-EDAG融合蛋白的原核表达及其转导活性的研究

HIV-TAT蛋白转导域（PTD）是新近发现的一种在蛋白转导过程中能高效穿过生物膜的结构域,它能将与之连接的多肽、蛋白质及DNA等分子跨膜导入几乎所有的组织和细胞,转导效率高而对细胞没有损伤.构建了TAT-EDAG、TAT-GFP融合蛋白原核表达载体,在大肠杆菌BL21（DE3）细胞中实现了两种融合蛋白的可溶性原核表达,在非变性条件下进行蛋白纯化,获得了纯度在90%以上的融合蛋白.脱盐处理后,利用TAT-GFP转染体外培养的鼠成纤维细胞证实了TAT转导肽的生物活性;利用TAT-EDAG转染体外培养的HL-60细胞,Western blotting分析表明：TAT-EDAG可以导入HL-60细胞中.这为下一步应用于体外造血干细胞扩增研究奠定了基础.     

拟蜘蛛拖丝蛋白基因人工合成及其原核表达

根据GenBank上蜘蛛拖丝蛋白基因序列(AY555585和AH015065)、拖丝蛋白基因的结构特点和密码子的简并性,设计378 bp的拖丝蛋白基因单体,并对其人工聚合成二聚体.Primer5.0分析结果表明,决定拖丝弹性和抗拉力的氨基酸(Gla和Ala)含量(41.43和18.22)接近天然丝蛋白氨基酸含量(42.81和26.32);利用Antheprot软件对二聚体编码氨基酸的二级结构预测结果显示,与丝蛋白的氨基酸链相近,由2个相同的部分排列而成,即β-片层(占48%)、6个α-螺旋间隔(占15%)、散在的转角(占12%)和若干不规则卷曲(占25%).将二聚体与pET-28a( + )连接构建原核表达载体,IPTG诱导重组菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到相对分子质量为26.6×103 kD的重组蛋白.上述结果为进一步开展有关转蜘蛛拖丝蛋白基因在绵羊被毛中表达的研究奠定了基础.     

蜘蛛拖牵丝蛋白基因的克隆与表达

蜘蛛丝具有极高的强度和韧度,工业和医学应用价值很高,但由于蜘蛛的不可驯养性使其应用受到限制.因此,本文尝试利用基因工程的方法获得蛛丝蛋白的表达.我们利用巢式PCR技术从大腹圆蛛Araneus ventricosus基因组中克隆了长度为837 bp的拖牵丝蛋白基因(ASP),并分别将其构建至原核表达载体pGEX-6p-1和真核表达载体pGFP-N2上,分别命名为pASG和pASN.pASG在大肠杆菌中16℃下24 h诱导表达后,经蛋白质印迹证明成功地表达了GST-ASP融合蛋白;pASN转染昆虫sf9细胞48 h后观察到了绿色荧光蛋白GFP的表达,表明ASP基因在大肠杆菌和真核细胞中分别得到了正确表达.本研究为利用基因工程的方法开发蛛丝蛋白的生产途径提供了有益的尝试.     

拟蜘蛛拖丝蛋白基因重组蛋白的纯化及其抗血清制备

为了制备可用于拟蜘蛛拖丝蛋白体外检测的抗血清,利用前期工作中获得的蜘蛛拖丝蛋白基因重组原核表达载体2S-pET-52b( + ),采用原核表达方法获得大量重组蜘蛛拖丝蛋白2S-His,对此重组蛋白进行His标签特异性的亲和纯化,再依次经SDS-PAGE、切胶和与佐剂混合后作为抗原;皮下多点注射法将抗原注入新西兰大白兔皮...     

兔抗仿蜘蛛牵丝蛋白抗体的制备及应用

将仿蜘蛛牵丝基因s6 0 0克隆到GST融合蛋白表达质粒pGEX KG中 ,利用大肠杆菌表达系统表达并纯化了仿蜘蛛牵丝蛋白S6 0 0 ,以之作为抗原制备了兔抗血清。S6 0 0的氨基酸组分分析与理论值相吻合。蛋白质免疫印迹发现该抗血清能与天然蜘蛛丝反应 ,表明设计的仿蜘蛛丝与天然蜘蛛丝有相似的免疫原性。为了定量检测仿蜘蛛牵丝蛋白在转基因家蚕丝腺中 (或茧壳中 )的表达 ,建立了用ELISA方法定量检测茧壳中仿蜘蛛牵丝蛋白量的工作系统     

High-Toughness Silk Produced by a Transgenic Silkworm Expressing Spider (Araneus ventricosus) Dragline Silk Protein

Spider dragline silk is a natural fiber that has excellent tensile properties; however, it is difficult to produce artificially as a long, strong fiber. Here, the spider (Araneus ventricosus) dragline protein gene was cloned and a transgenic silkworm was generated, that expressed the fusion protein of the fibroin heavy chain and spider dragline protein in cocoon silk. The spider silk protein content ranged from 0.37 to 0.61% w/w (1.4–2.4 mol%) native silkworm fibroin. Using a good silk-producing strain, C515, as the transgenic silkworm can make the raw silk from its cocoons for the first time. The tensile characteristics (toughness) of the raw silk improved by 53% after the introduction of spider dragline silk protein; the improvement depended on the quantity of the expressed spider dragline protein. To demonstrate the commercial feasibility for machine reeling, weaving, and sewing, we used the transgenic spider silk to weave a vest and scarf; this was the first application of spider silk fibers from transgenic silkworms.     

高分子量RGD-蛛丝蛋白重组体的构建、高密度发酵及纯化

蜘蛛丝是自然界综合性能优良的天然蛋白质纤维之一,因其具有良好的生物相容性和可降解性在生物医学领域具有潜在的应用前景。在本室已经构建的RGD-蜘蛛拖丝蛋白基因16多聚体基础上,通过首尾相连、倍加等方法进一步多聚化,得到RGD-蜘蛛拖丝蛋白基因32和64多聚体,分别将这两种多聚体与原核高效表达载体pET-30a( )连接,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,得到的32多聚体表达重组子命名为pNSR32,64多聚体表达重组子命名为pNSR64。通过酶切、琼脂糖电泳鉴定及对目的片段的测序均与理论值相符。将32和64多聚体基因序列注册GenBank,序列号分别为DQ469929和DQ837297。重组体pNSR32和pNSR64经IPTG诱导表达,SDS-PAGE图谱显示表达产物分子量分别为102kD和196.6kD,与天然蛛丝蛋白分子量接近并与理论值相吻合。高分子量的蛛丝蛋白在原核生物成功实现高效表达,在国内外尚未见报道。在此基础上对pNSR32工程菌进行高密度发酵,建立了简单高效的目的蛋白纯化工艺。     

表皮生长因子受体干扰序列与白细胞介素24融合蛋白的原核表达

目的：在大肠杆菌中表达表皮生长因子受体干扰序列（EGFRi）与白细胞介素24（IL-24）的融合蛋白。方法：人工合成肿瘤细胞表面受体特异性结合位点EGFRi核苷酸序列,应用重叠延伸PCR技术将其与IL-24基因连接,其间引入一段柔软短肽编码基因;将融合基因克隆入pET-22b原核表达载体,IPTG诱导融合蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中表达,对表达条件进行优化;用His·Bind纯化试剂盒对表达产物进行纯化,SDS-PAGE进行鉴定。结果：酶切和测序结果证实EGFRi-IL-24融合基因的原核表达载体构建正确;在IPTG浓度为0.8mol／L、28℃诱导10h的条件下,可溶性融合蛋白表达量最高;表达产物的相对分子质量与预期值一致,为22000;经纯化得到了均一的融合蛋白。结论：获得大肠杆菌表达的融合蛋白EGFRi-IL-2,可用于活性分析。     

蜘蛛拖丝蛋白基因的构建及在大肠杆菌中的表达

蜘蛛大壶腹线产生的拖丝是非常优良的纤维蛋白, 具有独特的强度和弹性。基于拖丝蛋白高度重复序列和部分cDNA序列, 合成蜘蛛拖丝蛋白基因单体, 通过头尾相连的构建策略, 得到拖丝蛋白多聚体, 与原核高效表达载体pET30a(+)连接, 转化大肠杆菌BLR(DE3), 用IPTG诱导表达。 表达产物经His.Bind树脂金属螯合亲和层析一步纯化, 纯度达90%以上, 表达量为20mg/L。SDS-PAGE和蛋白质印迹图谱显示表达产物分子量为37kD, 其值与氨基酸组分分析结果与理论推算值基本符合。      

SARS冠状病毒非结构蛋白Nsp的原核表达

严重急性呼吸综合征病毒,即SARS冠状病毒((Severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV),为具有囊膜的单股正链RNA病毒,基因组约长29~31kb。基因组从5'到3'端依次编码复制酶蛋白(Rep)、刺突蛋白(S)、囊膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和核蛋白(N)以及其他一些辅助性蛋白[1]。编码复制酶蛋白的基因,从基因组5'端起约占全长的2/3区域(≈21.2kb),在该区域的nt13392-13398存在保守的UUUAAAC位点,此位点含有-1位的核糖体翻译移框(frameshift),可引发自单一起始位点的蛋白翻译扩展,即由ORF1a编码的Pp1a(约486kDa)扩展为由ORF1b编…