黑胸大蠊浓核症病毒对雌成虫生殖的亚致死影响

用黑胸大蠊浓核症病毒(Periplaneta fuliginosa densonucleosis virus,PfDNV)三种浓度处理黑胸大蠊8-9龄雌性若虫,对雌成虫生殖有亚致死影响。试验结果表明,雌成虫寿命分别平均减少121d、145d和179d;产卵期分别平均缩短62d、56d和121d;每雌成虫产卵鞘数分别平均减少16个(占57％)、20个(占72％)和25个(占88％),每雌成虫产卵数分别平均减少354粒(占55％)、453粒(占71％)和558粒(占86％);生殖力分别平均下降177倍(占55％)、226倍(占71％)和279倍(占88％)。卵鞘活力分别下降28％、28％和20％。雌成虫在产卵盛期的前4个月持续受到DNV的影响,每雌每月平均产卵数分别减少30粒(占40％)、69粒(占48％)、63粒(占47％)和55粒(占50％),生殖力分别下降15倍、34倍、31倍和28倍。     

黑胸大蠊浓核症病毒的研究

1990年我们从黑胸大蠊(Periplaneta fuliginosa)的若虫中,首次分离发现黑胸大蠊浓核症病毒(PfDNV)。根据Kock's 法则,将它进行了回感试验,结果表明：这一病毒对该虫可引起同样的病症,并从中重新分离出完全一样的DNV。同时,对诊病毒进行了分类鉴定,结果表明：其病毒粒子的形态结构呈球状二十面体,大小一致, 直径为20 nm; 病毒核酸呈线状, 长度为1.7/μm 分子量为1.7x10⁶ Dal(ssDNA),基因组为单链DNA;结构蛋白为4条多肽,分子量分别为81k、62k、53k、29k。根据病毒分类命名原则,证明从黑胸大蠊中分离出的病毒属细小病毒科(Parvoviridae)中的浓核症病毒属(Desovirus)。我们将它命名为黑胸大蠊浓核症病毒Periplaneta fugtnosa Densonucleosis Virus简称PfDNV).     

黑胸大蠊（Periplaneta fuliginosa）病毒的分离及某些特性

从黑胸大蠊(Periplaneta fuliginosa)自然罹病的虫尸中分离得到一株非包涵体病毒。将病毒悬液均匀拌入无菌饲料并供食154～169日龄黑胸大蠊健康若虫时,能使其感染、发病,死亡率可达98％以上。在电子显微镜下观察时,病毒为球形二十面体颗粒,直径约23nm。病毒悬液具有典型核蛋白紫外吸收光谱。病毒用DNase和RNase处理并经吖啶橙染色、二苯胺和苔黑酚试验及甲醛反应证明:该病毒含有单链DNA。以上特性与细小病毒科的特征有点类似。     

黑胸大蠊的生物学

黑胸大蠊(Periplaneta fuliginosa Serville)是我国室内蠊(俗称蟑螂)的重要种,属蠊目、螊科、大蠊属。此虫分布极广,为害甚烈,不但啃食、污染和咬损室内的各种食品、衣物、书籍、皮革等,还携带传播人、畜疾病的痢疾杆菌、副伤寒杆菌、沙门氏菌、绿脓杆菌等种致病菌和蛔虫卵、钩虫卵等多种寄生虫卵,是必须防治的室内害虫。作者于1985年以来,对黑胸大蠊的生物学特性进行了初步研究,现总结如下。形态特征 (一)成虫大型,黑褐色,有较强的光泽。雌虫体长2.8-3.3cm、体宽1.2-1.5cm,前翅长2.1-2.3cm。肛上板中线隆起成脊,后缘呈三角形切口,形成左右两片,各片后端纯圆,切口顶端尖锐。下生殖板大型,中线隆起如船底。雄体长2.7-3.3cm、宽1.1-     

黑胸大蠊浓核病毒NS2蛋白亚细胞定位

黑胸大蠊浓核病毒(Periplaneta fuliginosa densonucleosis virus,PfDNV)是胡远扬等人在国内首次报道,并在国内外第一个正式分类鉴定的蟑螂浓核病毒[1],ICTV第八次会议正式将其独立列为一个属:Pefudensovirus.     

重组质粒转染蟑螂对黑胸大蠊浓核病毒的拯救

用Glassmilk法纯化PfDNV dsDNA,在其3′端和PstⅠ切开的pUC119质粒的3′端分别加dG和dC尾,连接、转化、筛选得到分子量为8.7kb的重组质粒.通过酶切证明插入DNA为PfDNV全基因组DNA.利用DEAE-dextran转染技术,将此重组质粒导入黑胸大蠊幼虫体内,此重组质粒能使虫体发病死亡.电镜超薄切片观察发现虫体细胞内存在大量的病毒粒子.同样,在免疫扩散实验中虫体PBS浸出液能与抗PfDNV的抗体产生沉淀线.用重组质粒感染致死的虫体喂食健康黑胸大蠊,也能使其发病死亡,通过电镜可以观察到在细胞内增殖的病毒粒子.     

重组质粒转染蟑螂对黑胸大蠊浓核病毒的拯救

用Ｇｌａｓｓｍｉｌｋ法纯化ＰｆＤＮＶｄｓＤＮＡ,在其３′端和ＰｓｔⅠ切开的ｐＵＣ１１９质粒的３′端分别加ｄＧ和ｄＣ尾,连接、转化、筛选得到分子量为８．７ｋｂ的重组质粒。通过酶切证明插入ＤＮＡ为ＰｆＤＮＶ全基因组ＤＮＡ。利用ＤＥＡＥｄｅｘｔｒａｎ转染技术,将此重组质粒导入黑胸大蠊幼虫体内,此重组质粒能使虫体发病死亡。电镜超薄切片观察发现虫体细胞内存在大量的病毒粒子。同样,在免疫扩散实验中虫体ＰＢＳ浸出液能与抗ＰｆＤＮＶ的抗体产生沉淀线。用重组质粒感染致死的虫体喂食健康黑胸大蠊,也能使其发病死亡,通过电镜可以观察到在细胞内增殖的病毒粒子。     

黑胸大蠊浓核病毒NS2蛋白的表达、抗体制备及亚细胞定位

ns2是黑胸大蠊浓核病毒的一个非结构基因, 所编码的蛋白质大小为30 kD, 是一个功能未知的基因。为了对该基因进行深入的功能研究, 从感染了黑胸大蠊浓核病毒的蟑螂的后肠组织中通过RT-PCR得到ns2基因编码序列, 将其构建于原核表达载体pET-28a, 转化大肠杆菌BL21(DE3) 获得融合表达产物。此融合蛋白经分离纯化后, 免疫新西兰大白兔, 制备其多克隆抗体。采用Western印迹技术, 用该抗体检测ns2基因的真核表达产物, 证明该抗体有较好的针对NS2蛋白的专一性, 可用于对NS2结构和功能的研究。同时, 将此编码序列克隆至果蝇细胞表达载体pAC, 得到重组质粒后转染果蝇S2细胞表达重组蛋白, 通过共聚焦显微镜用该抗体检测该蛋白在S2细胞中的亚细胞定位, 发现NS2蛋白主要定位于细胞质, 核内仅有少量分布。     

黑胸大蠊浓核病毒分类的相关研究

黑胸大蠊浓核病毒(pfDNV)是在我国首先发现并正式分类鉴定的蟑螂浓核病毒。该病毒属细小病毒科(Parvoviridae),浓核病毒亚科(Densovirinae)。但对该病毒的归属问题却一直没有确定,本文对此予以探讨。pfDNV的最新研究进展包括两个方面：全基因组核苷酸序列的测定,以及利用低温电镜技术和像重构方法对该病毒的三维重构(分辨率23A)。在此基础上,本文将pfDNV与其它病毒在基因组结构和三维结构方面进行了全面的对比分析,其结果并不支持目前对pfDNV的分类,因此建议对该病毒重新进行分类。     

氯氰菊酯异构体对黑胸大蠊神经钠钾通道的调制作用

用电生理油间隙、单纤维、电压钳位技术研究了氯氰菊酯顺、反异构体对黑胸大蠊[Periplaneta fulginosa(Serville)]中枢神经大轴突钠通道的调节抑制作用,并探讨了反式异构体与钾通道的作用关系.结果证明:1.2×10^-3mol/L顺式异构体作用于钠通道,先使其开放,然后抑制.2.出现钠尾电流,表明有更多数量的钠通道处于开放状态.3.5.4×10^-4mol/L反式异构体可阻滞迟缓钾通道并降低钾电流I_K的峰值.     

黑胸大蠊浓核病毒分类的相关研究

黑胸大蠊浓核病毒(pfDNV)是在我国首先发现并正式分类鉴定的蟑螂浓核病毒.该病毒属细小病毒科(Parvoviridae),浓核病毒亚科(Densovirinae).但对该病毒的归属问题却一直没有确定,本文对此予以探讨.pfDNV的最新研究进展包括两个方面全基因组核苷酸序列的测定,以及利用低温电镜技术和像重构方法对该病毒的三维重构(分辨率23(A)).在此基础上,本文将pfDNV与其它病毒在基因组结构和三维结构方面进行了全面的对比分析,其结果并不支持目前对pfDNV的分类,因此建议对该病毒重新进行分类.     

Biochemical characterization of Periplaneta fuliginosa densovirus non-structural protein NS1

The non-structural (NS) proteins of parvoviruses are involved in essential steps of the viral life cycle. Various biochemical functions, such as ATP binding, ATPase, site-specific DNA binding and nicking, and helicase activities, have been assigned to the protein NS1. Compared with the non-structural proteins of the vertebrate parvoviruses, the NS proteins of the Densovirinae have not been well characterized. Here, we describe the biochemical properties of NS1 of Periplaneta fuliginosa densovirus (PfDNV). We have expressed and purified NS1 using a baculovirus system and analyzed its enzymatic activity. The purified recombinant NS1 protein possesses ATPase- and ATP- or dATP-dependent helicase activity requiring either Mg(2+) or Mn(2+) as a cofactor. The ATPase activity of NS1 can be efficiently stimulated by single-stranded DNA. The ATPase coupled helicase activity was detected on blunt-ended double-stranded oligonucleotide substrate. Using South-Western and Dot-spot assays, we identified a DNA fragment that is recognized specifically by the recombinant NS1 protein. The fragment consists of (CAC)(4) and is located on the hairpin region of the terminal palindrome. The domain for DNA binding was defined to the amino-terminal region (amino acids 1-250). In addition, we found that NS1 can form oligomeric complexes in vivo and in vitro. Mutagenesis analysis showed that ATP binding is necessary for oligomerization. Based on these results, it seems that PfDNV NS1, a multifunctional protein, plays an important role in viral DNA replication comparable to those of vertebrate parvovirus initiator proteins.     

Biosynthesis of internally branched monomethylalkanes in the cockroach Periplaneta fuliginosa.

Sodium [1-¹⁴C]acetate, sodium [1-¹⁴C]propionate, sodium [2-¹⁴C]propionate, sodium [3-¹⁴C]propionate and sodium [methyl-¹⁴C]methylmalonate were readily incorporated into the cuticular hydrocarbons of nymphal stages of the cockroach Periplaneta fuliginosa both in vivo and in vitro, whereas no incorporation of [methyl-¹⁴C]methionine was observed. The alkanes of the nymphal stages of this insect are 25+% n-alkanes, 14% 3-methylalkanes, and 59+% internally branched monomethylalkanes, principally 13-methylpentacosane. Sodium [1-¹⁴C]acetate was incorporated into each class of alkane at about its percentage composition. In contrast, labeled sodium propionate and sodium methylmalonate were preferentially incorporated into the branched fractions. Radio-gas-liquid chromatography showed that sodium [1-¹⁴C]propionate was incorporated almost exclusively into 3-methyltricosane and 13-methylpentacosane, whereas sodium [1-¹⁴C]acetate was incorporated into each glc peak at about its percentage composition. These data suggest that propionate, incorporated during chain elongation, serves as the branching methyl group donor for both the 3-methyl and the internally branched monomethylalkanes in insects. The location of hydrocarbon synthesis in P. fuliginosa was studied using an in vitro tissue slice system. Excised cuticle slices, with adhering fat body tissue removed, gave good incorporation of labeled substrates into the hydrocarbon fraction. No hydrocarbon synthesis was observed in fat body preparations.     

蟑螂浓核病毒(pfDNV)非结构基因启动子的活性研究

为了研究蟑螂 Periplaneta fuliginosa 浓核病毒(pfDNV)非结构基因转录调控的机制,用 PCR 的方法从蟑螂浓核病毒基因组 DNA 中扩增了非结构蛋白基因 ns3 翻译起始密码子上游 325 bp 的启动子序列;并进一步以其作为模板,利用聚合酶链式反应技术,得到 6 个不同长度的启动子片段和两个定点突变体片段,构建由其驱动的萤火虫荧光素酶基因报告质粒,在 脂质体介导下转染多种昆虫细胞,体外分析了该启动子的活性。结果表明：该 325 bp DNA 片段在 Sf9,S2,Tn368 及 Ld652 细胞中均具有较高的启动子活性;其转录起始基序 CAGT 对维持该启动子的基本转录活性而言是必需的,而 TATA 盒对此则是非必需的,但它的存在可显著提高启动子的转录活性。同时,我们还发现,病毒非结构蛋白 NS1 对该启动子具有反式激活作用,并且这种激活作用的大小取决于 NS1 蛋白在细胞中的浓度。     

黑胸大蠊下颚须和下唇须上感器扫描电镜观察

利用扫描电子显微镜观察了黑胸大蠊Periplanetafuliginosa(Serville)成虫下颚须和下唇须上的感器形态。结果发现,在黑胸大蠊下颚须和下庸须末节顶端何感器密集区,尤其是下颚须第5节内侧顶端,有一狭长沟壑,内有大量的带槽锥形感器。通过重点观察感器密集区,发现主要有5~6种类型感器,分别为带槽锥形、毛形、刺形、钟形、齿状、针形感器,其中有些感器又可分为几种亚类型。比较研究发现下颚须和下唇须上感器类型除了带槽锥形感器以外基本相似,只是数量上有区别。