灰盖拟鬼伞核定位蛋白重组表达系统的构建

为构建灰盖拟鬼伞Coprinopsis cinerea的核定位蛋白重组表达系统,本研究通过蛋白序列比对和信息学分析,预测了灰盖拟鬼伞组蛋白H2B的核定位序列,构建了融合组蛋白H2B核定位序列的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)重组表达载体,将该载体转入灰盖拟鬼伞AmutBmut菌...     

鸭甲肝病毒3型2012年山东分离株VP1基因的序列分析

为揭示近年来鸭甲肝病毒3型(DHAV-3)中国分离株VP1基因的遗传变异规律,本研究对2012年从山东省分离到的13株DHAV-3的VP1基因分别进行PCR扩增、序列测序与分析。结果显示,13株DHAV-3的VP1基因均由720个核苷酸组成,共编码240个氨基酸,核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为94.6%～99.9%和95.0%～100%。与GenBank中公布的31株DHAV-3的VP1基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为92.5%～100%和90.8%～100%。系统进化分析显示,DHAV-3可分为两个基因型,其中除疫苗毒B63之外所有中国分离株均属于GⅠ型,越南分离毒株主要属于GⅡ型S1亚型,而韩国分离株组成GⅡ型中的S2亚型,具有明显的地域特征。     

PTD4-GFP-VP3融合蛋白在人肝癌细胞HepG2中的定位观察及凋亡诱导效应的实验研究

目的 观测PTD4-GFP-VP3融合蛋白诱导人肝癌细胞HepG2的凋亡效应及其在肿瘤细胞中的定位与其凋亡效应关系的研究.方法 构建PTD4-GFP-VP3融合蛋白的原核表达载体,利用人源肝癌细胞株HepG2,经细胞透膜实验在激光共聚焦显微镜下观察PTD4介导的融合蛋白透膜效应,DAPI染色观测该蛋白在细胞中的定位;利用TUNEL法观察PTIM-GFP-VP3融合蛋白诱导肿瘤细胞的凋亡效应,并利用流式细胞仪检测其凋亡率.结果 PTD4-GFP-VP3融合蛋白在孵育细胞0.5 h后即可透过细胞膜进入到细胞质中,12 h后定位于细胞核并诱导肿瘤细胞凋亡,48 h达到最高凋亡效应.结论 PTD4能携带GFP-VP3融合蛋白穿透细胞膜,在肿瘤细胞中具有核定位效应,并能诱导肿瘤细胞凋亡,为后期进一步研究VP3的凋亡机制及其抗肿瘤治疗奠定了基础.     

传染性法氏囊病毒VP2 蛋白的分子生物学研究进展

本文综述了IBDV的保护性抗原蛋白VP2与病毒形态、毒力变异、抗原变异间的关系及在诱导宿主细胞凋亡中的作用。同时也探讨了其在新型疫苗开发中的应用等方面的研究进展。     

口蹄疫病毒株AF72 VP3的结构模拟与分析

以口蹄疫病毒株AF72 RNA为模板,反转录并扩增目的基因,PCR纯化产物与pGEM TEasy载体连接并转化JM109菌株,用凝胶电泳、PCR和Spe I/Sph I双酶切法鉴定为阳性的重组质粒进行测序.比对测序结果确定AF72 VP3的核苷酸序列,利用同源建模的方法建立AF72 VP3结构蛋白的3D结构,在此基础上,综合亲水性、可塑性、抗原指数以及表面可能性等参数预测AF72 VP3结构蛋白的B细胞抗原表位.分析表明,口蹄疫病毒VP1、VP2、VP3和VP4在核苷酸水平上的变异率是无差异的(P＞0.05);而它们在氨基酸水平上的变异率差异显著(P＜0.05).该毒株与20株源于GenBank中的VP3氨基酸序列比对发现其保守区主要位于第1～24、24～35、36～42、45～56、65～122、124～172、177～210、211～219位.AF72 VP3结构蛋白三维空间结构可分为A、B和C 3个结构区域,蛋白呈现较规则的空间构象,其中18～23、30～44、60～75、113～124、130～142、193～220氨基酸区段是AF72VP3结构蛋白可能的B细胞抗原表位区域,该结果将为进一步的FMDV多表位疫苗研究提供更有价值的参考信息.     

B19病毒XA株VP1独特区蛋白对Hela细胞凋亡的影响

目的:构建B19病毒XA株VPlu基因的真核表达载体和稳定转染细胞系,探讨B19病毒XA株VPl独特区蛋白对Hela细胞凋亡的影响。方法:采用本课题组前期构建的真核表达载体plRES2-EGFP-Vplu及plRES2-EGFP对照质粒,将其稳定转染至Hela细胞,通过流式细胞术检测EGFP阳性细胞的比例以确定稳定转染的细胞系是否成功构建;提取稳定转染的Hela细胞的总蛋白,通过Western blot检测细胞内凋亡相关基因Caspase3的表达;转染plRES2-EGFP-Vplu及plRES2-EGFP的Hela细胞经过Annexin V和PI的染色后,通过流式细胞术检测其凋亡率。结果:本实验成功构建了plRES2-EGFP-VPlu稳定转染的Hela细胞系,plRES2-EGFP-Vplu稳定转染的Hela细胞中Caspase3的表达较转染对照质粒的Hela细胞明显增加,细胞凋亡率亦显著升高,差异均具有统计学意义(P0.05)。结论:B19病毒XA株VP1独特区蛋白能够显著促进Hela细胞的凋亡。     

烟草质体分裂蛋白NtFtsZs在大肠杆菌中的定位分析

分别构建了两个烟草(Nicotiana tabacum L.)质体分裂基因NtFtsZ1和NtFtsZ2与编码绿色荧光蛋白的gfpS65A、V68L、S72A基因相融合的原核表达载体,并导入大肠杆菌( Escherichia coli ) JM109菌株中进行表达.全长NtFtsZs∶GFP融合蛋白在菌体中有规律地定位,暗示NtFtsZs能识别大肠杆菌潜在的分裂位点,并能与大肠杆菌的内源FtsZ发生聚合作用;融合蛋白的诱导表达抑制了宿主菌的分裂,形成了明显的丝状菌体,证明真核生物的 ftsZ 基因与大肠杆菌的 ftsZ 基因有相似的作用.同时构建了NtFtsZs不同缺失的原核表达载体,对这两个基因所编码蛋白不同结构域的功能做了初步分析.实验结果表明,烟草FtsZ蛋白的C端结构域与其在大肠杆菌细胞中的正确定位有关;而N端结构域与NtFtsZs∶GFP融合蛋白的聚合有关.     

拟南芥血红蛋白3的亚细胞定位

拟南芥的血红蛋白3（AtGLB 3）属于截短的血红蛋白。与拟南芥血红蛋白1相比,拟南芥血红蛋白3具有不同的起源、不同的生化特性和结构;但其功能还不清楚。蛋白质的定位与蛋白质的功能息息相关。为深入研究该基因功能,构建了拟南芥血红蛋白3基因与绿色荧光蛋白融合的植物表达载体pUCGFP/AtGLB3。利用基因枪转化法将重组载体转入洋葱表皮细胞瞬时表达,通过检测融合蛋白在洋葱表皮细胞中的分布来确定拟南芥血红蛋白3在细胞中的定位。荧光显微镜检测结果表明,AtGLB3基因表达产物主要定位在细胞膜上。     

PNRC1核定位信号序列的鉴定

为鉴定富含脯氨酸核受体辅调节蛋白1(PNRC1)分子的核定位信号序列（nuclear localization signal sequence, NLS）,在生物信息学方法预测的基础上,先构建野生型PNRC1及删除预测NLS的PNRC1突变体的绿色荧光蛋白（GFP）重组表达载体,转染细胞后通过激光共聚焦显微镜观察PNRC1分子在删除预测NLS后细胞内的定位变化.然后,将预测的NLS编码序列直接连到GFP表达载体上,以及将预测的NLS加到胞浆蛋白上构建其GFP重组表达载体,转染细胞,观察预测的NLS能否把构建的重组体都带到细胞核内.结果显示,删除PNRC1中预测的NLS后,其定位从细胞核中变为主要定位在细胞浆中,而预测的NLS能把GFP或胞浆中的蛋白带到细胞核中.研究表明,预测的NLS为PNRC1分子真正的NLS.     

蛋白质通量化定位体系的建立及初步应用

目的:对于蛋白质功能而言,蛋白质定位与蛋白质的表达和修饰等同等重要。传统的蛋白质定位一直沿用单个基因、逐个的研究方法,本实验拟建立一种通量蛋白质定位研究体系。方法:采用并优化了细胞微阵列技术,结合绿色荧光蛋白(GFP)标签、激光扫描共聚焦显微镜及反转染技术,用于大规模蛋白质定位研究。结果:初步建立的蛋白质定位微阵列包含107个GFP标记的cDNA表达载体,分别编码107个重要细胞信号传导通路的蛋白质,并与定位数据库中的已知结果进行了比对;对该系统的有效性进行了验证评价。结论:本定位系统可有效地用于通量化蛋白质定位研究,并可以发展用于蛋白质相互作用、泛素-蛋白酶体通路底物筛选等进一步的功能研究。     

核糖体蛋白L6/Taxreb107的核定位信号的分析

核糖体蛋白L6（RpL6,Taxreb107）含有三个具有核定位信号特征的基序.用作者构建的核定位信号捕获系统分析了这些核定位信号是否具有介导蛋白质进行核转位的功能.将RpL6/Taxreb107分段插入核定位信号捕获载体的克隆位点后转化宿主酵母,发现其前两个核定位信号可以介导融合蛋白进入细胞核,而第三个核定位信号无此作用.将RpL6/Taxreb107分段与绿色荧光蛋白融合后转染培养的哺乳类细胞,证实了以上在酵母中所得的结果.进一步发现RpL6/Taxreb107的前两个核定位信号同时具有核仁定位的功能.当在细胞中表达的早期,进入核内的融合蛋白优先定位于核仁.这些结果一方面有助于理解RpL6/Taxreb107核转位的机理,同时说明作者构建的核定位信号捕获系统也可用在蛋白质中寻找核定位信号.     

核定位信号分析示踪载体——pGST-EGFP的构建及功能鉴定

目的 构建谷胱甘肽转硫酶（GST）与EGFP相融合的新型蛋白质示踪载体--pGST-EGFP,以用于蛋白质细胞亚定位信号序列的深入分析.方法 以质粒pEGFP-N1为骨架,融合从pGEX-2TK载体中扩增的GST编码序列,构建成pGST-EGFP融合表达质粒;再插入人工合成的已知核定位蛋白SV40的核定位序列（NLS）,构建成pGST-EGFP-SV40 NLS作为阳性对照;另外,构建小分子量蛋白TNNI2在pGST-EGFP的融合表达质粒.将对照pEGFP-N1和各重组质粒分别用脂质体介导,瞬时转染HeLa细胞,荧光显微镜下观察蛋白的核定位情况.结果 单独表达的EGFP呈全细胞分布,而GST-EGFP融合蛋白只存在于细胞浆;SV40 NLS能将GST-EGFP融合蛋白带进细胞核.虽然TNNI2-EGFP融合蛋白的细胞亚定位呈现核内丰度更高的特点,但TNNI2-GST-EGFP融合蛋白仅限定于胞浆分布,提示TNNI2不能主动定位到细胞核中.结论 成功构建了蛋白质细胞亚定位示踪载体--pGST-EGFP.作为核定位信号分析系统,其对小分子蛋白细胞亚定位的示踪效果优于传统的pEGFP载体,更适用于科研工作中小分子量蛋白质核定位信号序列的研究.     

Nuclear Localization Signals in p170, the Large Subunit of Translation Initiation Factor 3

Apart from their role in translation, eukaryotic translation factors or their individual subunits may perform other functions, in particular, regulating nuclear processes. Primary structure analysis revealed four potential nuclear localization signals (NLS) in the human eIF3 large subunit, p170. NLS were tested for ability to direct p170 into the nucleus. For this purpose, cDNAs coding for p170 fragments fused with the green fluorescent protein were expressed in CV-1 and Cos-1 cultured monkey cells. The location of the expression product was studied by fluorescence microscopy. At least two of the four putative bipartite NLS proved to direct the corresponding p170 fragments into the nucleus. Larger p170 fragments with the same NLS were retained in the cytoplasm. It was assumed that, with the help of some specific factors or after limited proteolysis, p170 enters the nucleus and participates in regulating genome expression. Alternatively, the cytoplasmic function of p170 might be regulated via a reversible binding of integrins to NLS.     

细胞基质蛋白3的功能及其参与病毒复制的分子机制

基质蛋白3(matrin 3, MATR3)是细胞核基质蛋白重要成员之一,它与细胞的基因转录调节、mRNA前体剪接和稳定性、DNA损伤修复以及细胞增殖等活动密切相关。近年来的研究表明, MATR3在逆转录病毒的复制过程中也有着重要作用。鉴于MATR3参与病毒复制的作用机制研究少有报道,该文主要从MATR3的结构特征、在细胞核中的功能、参与病毒复制的作用机制等方面进行综述,以期为深入研究MATR3在病毒生活史中的作用提供参考。     

c-flag-ago3质粒在人293细胞系中的表达及AGO3蛋白复合物的细胞定位

将c-flag-ago3质粒转入人293细胞系中,使c-flag-ago3基因稳定表达,为进一步研究AGO3蛋白复合物的结构、功能奠定了基础.利用亲和标签flag对目标蛋白进行检测和监测,将已合成的c-flag-ago3质粒和用于对照的质粒si-ago3(能使ago3基因沉默的质粒)导入人293细胞系中,在荧光镜下观察转染效果.RT-PCR法检测基因含量,蛋白印迹法(WB)检测人293细胞表达的flag-ago3,并对其蛋白复合物进行细胞定位.结果显示,c-flag-ago3质粒和si-ago3质粒成功地导入人293细胞系中,免疫细胞化学显示c-flag-ago3基因在细胞中高表达、并检测到AGO3复合物定位于细胞质中.AGO3复合物在细胞中可稳定表达,为进一步研究AGO3蛋白复合物的构成及其在人体中的功能奠定了基础.     

Sweet Killing in Obesity and Diabetes: The Metabolic Role of the BH3-only Protein BIM

Diabetes is a metabolic disorder affecting more than 400 million individuals and their families worldwide. The major forms of diabetes (types 1 and 2) are characterized by pancreatic β-cell dysfunction and, in some cases, loss of β-cell mass causing hyperglycemia due to absolute or relative insulin deficiency. The BCL-2 homology 3 (BH3)-only protein BIM has a wide role in apoptosis induction in cells. In this review, we describe the apoptotic mechanisms mediated by BIM activation in β cells in obesity and both forms of diabetes. We focus on molecular pathways triggered by inflammation, saturated fats, and high levels of glucose. Besides its role in cell death, BIM has been implicated in the regulation of mitochondrial oxidative phosphorylation and cellular metabolism in hepatocytes. BIM is both a key mediator of pancreatic β-cell death and hepatic insulin resistance and is thus a potential therapeutic target for novel anti-diabetogenic drugs. We consider the implications and challenges of targeting BIM in the treatment of the disease.