基于肠道菌群研究枳术丸治疗脾虚证慢传输型便秘的作用机制

观察枳术丸对脾虚证慢传输型便秘（slow transit constipation,STC）小鼠肠道菌群、短链脂肪酸（SCFAs）、5-羟色胺（5-HT）和肠道传输功能的影响,探讨枳术丸治疗STC的机制。

将50只健康的KM小鼠按随机数字表法分为正常组（15只）和造模组（35只）,正常组小鼠基础饲料喂养,造模组小鼠以番泻叶灌胃和限制饮食饮水方法制作脾虚证STC小鼠模型。造模成功后,将造模组小鼠分为模型组、莫沙必利组和枳术丸组,每组10只,对应给药治疗7 d。治疗结束后分别采用16S rRNA基因测序技术分析小鼠粪便菌群多样性和菌群结构,气相色谱/质谱法检测粪便中SCFAs水平,HE染色观察各组小鼠结肠组织病理形态改变,使用ELISA法检测小鼠脑组织、结肠组织中5-HT水平。

造模后,各造模组小鼠体质量显著低于正常组（均P＜0.01）;治疗结束后,模型组小鼠体质量和肠道推进率显著低于正常组（均P＜0.01）;与模型组比较,莫沙必利组和枳术丸组小鼠体质量和肠道推进率升高（均P＜0.05）。小鼠结肠组织HE病理显示模型组腺体排列不齐,结肠黏膜轻微水肿、充血,轻度炎症浸润。与正常组比较,模型组小鼠肠道菌群丰富度和多样性皆降低,枳术丸组和莫沙必利组小鼠肠道菌群多样性和丰富度更趋近于正常组。在门分类水平上,与正常组比较,模型组小鼠厚壁菌门、疣微菌门相对丰度降低,拟杆菌门、变形菌门相对丰度增加;与模型组比较,枳术丸组小鼠疣微菌门相对丰度增加,拟杆菌门相对丰度降低。在属分类水平上,与正常组比较,模型组小鼠拟杆菌属、乳杆菌属相对丰度增加,异形藻属、梭菌属、另枝菌属相对丰度降低;与模型组比较,枳术丸组小鼠拟杆菌属相对丰度降低,异形藻属、梭菌属相对丰度增加。与正常组比较,模型组小鼠粪便乙酸、丙酸水平降低（均P＜0.05）,结肠组织、脑组织5-HT水平降低（均P＜0.05）;与模型组小鼠比较,枳术丸组小鼠粪便乙酸、丙酸水平显著升高（均P＜0.01）,结肠组织、脑组织5-HT水平升高（均P＜0.05）。

枳术丸可通过调节肠道菌群的平衡,促进SCFAs的分泌和5-HT的分泌释放,提高推进率,促进肠道蠕动治疗脾虚证STC。

     

枳术丸汤剂中枳实不同剂量配伍对慢传输型便秘小鼠肠道菌群多样性的影响

基于攻补兼施法探讨在大剂量生白术的配伍下不同枳实剂量配伍的作用及枳术丸（ZZW）对慢传输型便秘（STC）小鼠肠道菌群的影响。

将65只SPF级别昆明（KM）小鼠随机分为空白对照组10只与模型组50只,空白对照组正常喂养,模型组使用番泻叶0.8 g/kg灌胃7 d,制成脾虚模型后禁食禁水,隔天喂食生大米,饮水0.5 h,连续8 d建立脾虚便秘模型。15 d后将模型组随机分为5组,每组10只,即模型组、西药组、ZZW低剂量组、ZZW中剂量组、ZZW高剂量组。ZZW低、中、高剂量分别为9.7 g/kg、11.6 g/kg、13.7 g/kg,西药组给予莫沙必利2.5 mg/kg。空白对照组和模型组灌胃同等量蒸馏水。治疗1周后收集肠道内容物,行16S rRNA测序,取结肠组织HE染色行病理形态学观察。

ZZW高剂量组能够显著提高肠道推进率（P＜0.05）。结肠切片肉眼观察发现小鼠结肠组织黏膜光滑,未见充血、糜烂及器质性损伤。HE病理学检查结果显示,模型组存在轻微水肿,腺体不齐现象,其余各组小鼠结肠黏膜无变薄、固有层炎症浸润,结肠腺体形态正常。16S rRNA测序结果显示,STC小鼠肠道菌群物种丰富度和均匀度显著下降（P＜0.05）,菌群多样性升高（P＜0.01）。门水平上,与空白对照组比较,模型组拟杆菌门相对丰度升高、厚壁菌门相对丰度降低,但差异无统计学意义（P＞0.05）。与模型组比较,ZZW低剂量组较模型组拟杆菌门相对丰度显著降低（P＜0.01）,厚壁菌门、变形菌门相对丰度升高（P＜0.05）,ZZW高剂量组较模型组拟杆菌门相对丰度降低（P＜0.05）,厚壁菌门相对丰度升高（P＜0.05）。属水平上,模型组较空白对照组Prevotellamassilia、葡萄球菌属、拟杆菌属、丁酸弧菌属相对丰度升高（P＜0.05）,螺杆菌属、另枝菌属相对丰度显著降低（P＜0.01）,经治疗后ZZW低剂量组Prevotellamassilia、葡萄球菌属、拟杆菌属相对丰度降低（P＜0.05）,ZZW中剂量组丁酸弧菌属相对丰度降低（P＜0.05）;ZZW高剂量组Prevotellamassilia、葡萄球菌属相对丰度显著降低（P＜0.01）。此外,与模型组比较,ZZW低剂量组狄氏副拟杆菌属相对丰度降低（P＜0.05）。

攻补兼施代表方ZZW能明显缓解STC小鼠便秘症状,以ZZW高剂量组效果最佳,但治疗效果与枳实剂量不存在量效关系,其治疗机制可能与ZZW水煎液调整菌群丰度、多样性及菌群物种数目,恢复正常肠道生态环境有关。

     

基于16S rRNA高通量测序技术分析福州地区慢传输型便秘患者肠道菌群的变化

运用16S rRNA高通量测序技术分析福州地区慢传输型便秘(STC)患者肠道菌群变化的特征。

纳入60例STC患者和健康志愿者20例, 留取新鲜粪便样本, 冰块运送至实验室并存放于-80度冰箱, 应用16S rRNA高通量测序技术, 分析各组肠道菌群的生物多样性与结构组成。

测序后共得到1 702 004 524条有效序列, 样本序列平均有效长度为414.1 bp, 总样本平均序列条数为2 127 505.7条。与对照组比较, STC患者肠道菌群丰度指数Ace指数、Chao指数和肠道菌群多样性指数Shannon指数下降(P < 0.05), 肠道菌群多样性指数Simpson指数显著升高(P < 0.05)。在门水平上, STC组以拟杆菌门、放线菌门为主, 正常对照组以厚壁菌门为主。在属水平上, STC组以拟杆菌属(Bacteroides)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、丹毒杆菌属(Erysipelatoclostridium)、巨单胞菌属(Megamonas)为主, 正常对照组以乳酸杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、布劳特菌属(Blautia)为主。

STC患者肠道菌群发生紊乱, 表现为丰度及多样性下降, 菌群结构发生改变, 可能与慢传输型便秘的发生发展有关。

     

基于16S rDNA测序技术分析功能性便秘患者粪便菌群

运用16S rDNA测序技术分析功能性便秘（FC）患者粪便菌群特征,以期寻找FC特征菌,为FC诊治寻找新的治疗靶点。

收集福建中医药大学附属第二人民医院60例实验组（FC患者）和30例正常组的粪便,采用16S rDNA测序技术分析粪便菌群结构,并进行基因功能的预测。

两组在门水平上,主要由厚壁菌门和拟杆菌门组成;在属水平上,主要优势菌以粪杆菌属和拟杆菌属为主。实验组粪便菌群丰富度指数Chao1、Observed_OTUs较正常组升高（P＜0.05）,多样性指数Shannon指数和Simpson指数虽有上升趋势,但差异无统计学意义（P＞0.05）。布劳特菌属、罗氏菌属、Ruminococcus_gnavus_group、Ruminococcus_gauvreauii_group、Eubacterium_hallii_group、Anaerostipes、Lachnospiraceae_ND3007_group、Dorea、乳球菌属在实验组中丰度均显著降低（P＜0.01）。实验组特征菌为小杆菌属,正常组为布劳特菌属和埃希菌−志贺菌属。实验组蔗糖降解Ⅲ（PWY-621）、丙酮酸发酵成乙酸和乳酸（PWY-5100）和琥珀酸发酵成丁酸盐（PWY-5677）功能下降（P＜0.05）。

功能性便秘患者主要表现为肠道菌群丰度与多样性升高,FC的发病可能与菌群结构发生改变有关。

     

慢传输型便秘患者肠道粪便菌群的变化特征

目的通过16S rDNA高通量测序技术,研究慢传输型便秘(slow transit constipation,STC)患者粪便菌群的变化特征。方法选取12例慢传输型便秘患者(STC组)及12例健康志愿者(对照组),留取粪便标本后,应用16S rDNA高通量测序技术对标本进行测序,并分析测序结果。结果 STC组与对照组人群肠道在菌群物种种类(Chao1指数和Sobs指数)上差异存在统计学意义(Z=-2.771,P=0.006;Z=-2.425,P=0.015),对照组人群肠道菌群物种种类明显高于STC组;两组在物种均一性(Shannon指数、Simpson指数)上差异无统计学意义(Z=-0.520,P=0.603;Z=-0.348,P=0.728)。在门水平,两组人群粪便菌群多样性差异无统计学意义。在属水平,Phascolarctobacterium(Z=-2.194,P=0.028)、Streptococcus(Z=-4.157,P0.001)、Eggerthella(Z=-2.427,P=0.015)和Actinomyces(Z=-2.310,P=0.021)在STC组人群肠道中相对丰度增加,而Faecalibacterium(Z=-2.887,P=0.004)、Roseburia(Z=-3.118,P=0.002)、Sphingomonas(Z=-4.157,P0.001)、Variovorax(Z=-2.732,P=0.006)、Holdemania(Z=-1.970,P=0.049)、Phyllobacterium(Z=-2.732,P=0.006)、Pseudomonas(Z=-2.439,P=0.015)、Acinetobacter(Z=-2.732,P=0.006)、Aquabacterium(Z=-2.134,P=0.033)和Novosphingobium(Z=-2.134,P=0.033)在STC组中相对丰度减少。结论 STC组与对照组人群肠道在菌群物种种类丰富度上差异存在统计学意义,而在菌群分布均一性上差异无统计学意义;在菌属水平,两组人群的粪便菌群构成也存在较大差异。     

细菌性阴道病肠道菌群与阴道菌群16S rDNA测序分析

目的通过对细菌性阴道病(BV)患者肠道菌群及阴道菌群16S rDNA扩增子测序,分析其结构、多样性、相关性以及BV对肠道菌群的影响,为今后治疗BV提供新的思路。方法选取符合纳入标准的BV患者11例(BV组),健康者9例(C组),留存阴道分泌物及新鲜粪便进行16S rDNA基因检测分析。结果C组阴道菌群以乳杆菌属为主,BV与加德纳菌属、普雷沃菌属、Sneathia、窄食单胞菌属(Stenotrophomonas)、阿托波菌属、Shuttleworthia、巨型球菌属密切相关。BV组肠道、阴道菌群丰富度均高于C组。Alpha多样性分析中C组和BV组肠道菌群、阴道菌群的Shannon指数组间比较,χ²值为29.137, P=0.000<0.05,两组阴道菌群Shannon指数组间比较差异具有统计学意义(P<0.05),BV组高于C组。物种多样性曲线反映本研究样本测序数据量的合理性,表明BV组的肠道菌群多样性、丰富度均高于C组,主坐标分析表明C组肠道与阴道的菌群结构差距较大,BV组肠道与阴道的菌群结构有相似之处,且两组肠道菌群结构接近。BV组阴道菌群中厚壁菌门丰度较C组低,放线菌门、拟杆菌门较C组高;BV组肠道菌群中拟杆菌门丰度较C组低;C组肠道中拟杆菌门明显高于阴道,厚壁菌门明显低于阴道; BV组阴道菌群中放线菌门丰度高于C组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论BV阴道菌群与肠道菌群具有相关性,BV可能引起肠道菌群结构比例和多样性的改变。     

16S rDNA测序研究高脂饮食诱导的高脂血症大鼠肠道菌群变化

通过高脂饮食诱导大鼠高脂血症, 采用16S rDNA测序检测高脂血症大鼠肠道菌群变化情况。

SD大鼠20只(清洁级), 按体质量随机分为模型组和对照组, 对照组大鼠给予维持饲料, 模型组大鼠给予高脂饲料。1周后检测血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平。采集大鼠粪便, 采用16S rDNA测序法对大鼠肠道菌群进行分析, 考察高脂血症大鼠肠道菌群变化情况。

高脂血症大鼠肠道菌群生物多样性(Alpha多样性和Beta多样性)发生显著变化, 肠型与对照组差异明显, 在门、科、属等多个水平差异均具有统计学意义。其中, 厚壁菌门(Firmicutes)和念珠菌门(Candidatus saccharibacteria)数量显著下降, 拟杆菌门(Bacteroidetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)数量显著升高。

高脂饮食诱导的高脂血症可引起大鼠肠道菌群发生显著变化。

     

基于16S rDNA测序绝经综合征抑郁患者肠道菌群结构与功能性分析

目的 通过16S rDNA测序技术对绝经综合征抑郁患者肠道菌群分布、多样性和基因功能进行分析,探讨肠道菌群与绝经综合征抑郁发生的关联。方法 选取2021年6月至2022年3月就诊于我院妇科门诊的绝经综合征抑郁患者19例为观察组（A组）,同期绝经综合征患者10例为对照组（C组）。利用16S r DNA基因测序法对患者肠道菌群进行物种注释分析和功能比较,统计两组肠道菌群分布、多样性和基因功能的变化。结果 两组肠道菌群差异明显。GraPhlAn物种组成图显示,患者肠道菌群总体以厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门和变形菌门组成。在门水平,与C组相比,A组放线菌门、变形菌门相对丰度较低,拟杆菌门相对丰度较高。在属水平,与C组相比,A组拟杆菌属、小杆菌属、巨单胞菌属、Lachnospiracea＿incertae＿se相对丰度较高,而Gemmiger、布劳特菌属、普雷沃菌属、粪球菌属、粪杆菌属、双歧杆菌属相对丰度偏低。进一步在属水平上选取了10种相对丰度差异具有统计学意义的菌群（P<0.05）：韦氏球菌属、消化球菌属、巨单胞菌属、史雷克菌属在A组的相对丰度较高（P<0.05）,柯林斯菌属、C...     

16S rDNA高通量测序分析腹膜透析胃肠功能障碍患者肠道菌群特征

采用16S rDNA高通量测序技术分析腹膜透析（PD）胃肠功能障碍患者的肠道菌群变化特征,探讨肠道菌群在腹膜透析胃肠功能障碍中的具体作用。

收集25例PD胃肠功能正常者（PDGF组）、25例PD胃肠功能障碍者（PDGD组）和13例健康者（Normal组）的粪便样本,提取肠道菌群基因组,应用16S rDNA高通量测序技术对各组测序结果进行菌群多样性、物种组成差异和菌群功能分析。

3组的Observed species指数（H = 6.905,P = 0.032）和Shannon指数（H = 6.993,P = 0.030）差异具有统计学意义。与Normal组相比,PDGD组Shannon指数显著降低（P = 0.027）,PDGF组Observed species指数显著升高（P = 0.044）;与PDGF组相比,PDGD组Observed species和Shannon指数显著降低（P＜0.05）。PCoA结果显示3组各自聚集,区分较明显。UPGMA聚类分析结果显示3组大部分样本均在本组中聚类后再与其他组进一步合并。LEfSe分析结果显示,Normal组优势菌群包括颤螺菌目（Oscillospirales）、瘤胃菌科（Ruminococcaceae）、栖粪杆菌属（Faecalibacterium）、拟杆菌科（Bacteroidaceae）等;PDGF组优势菌群包括毛螺菌目（Lachnospirales）、毛螺菌科（Lachnospiraceae）、布劳特菌属（Blautia）;PDGD组优势菌群包括芽孢杆菌纲（Bacilli）、乳杆菌目（Lactobacillales）、链球菌属（Streptococcus）、链球菌科（Streptococcaceae）等。KEGG L1水平的功能组成集中在代谢、遗传信息处理和环境信息处理;KEGG L2水平的功能主要集中在碳水化合物、氨基酸代谢、遗传信息的复制和修复及转运、膜运输途径;与Normal组和PDGF组相比,PDGD组在碳水化合物、氨基酸代谢途径富集减少,感染性疾病、聚糖生物合成和代谢途径富集增加。

PD胃肠功能障碍患者存在肠道菌群失调,调整肠道微生态是防治PD患者出现胃肠功能障碍的潜在干预靶标。

     

基于16S rDNA测序技术分析薏苡附子败酱散对急性溃疡性结肠炎小鼠肠道菌群的影响

目的从肠道菌群的角度探索薏苡附子败酱散治疗溃疡性结肠炎(UC)的作用机制。方法将24只雄性SPF级C75BL/6J小鼠随机分为空白组、模型组、阳性药对照组、中药组4个组别,通过自由饮用3% DSS溶液的方法制作急性UC小鼠模型。造模成功后,中药组予以1.048 g/mL的薏苡附子败酱散溶液,阳性药对照组予以0.031 g/mL的嗜酸乳杆菌(益君康)溶液,空白组和模型组予以同等体积的生理盐水,7 d的治疗结束后处死所有小鼠,取小鼠结肠组织和肠内容物。实验过程中监测小鼠的体质量、精神等一般情况,进行DAI评分,HE染色法在光镜下观察小鼠肠道病理变化,进行HS评分。提取肠道菌群的DNA,采用高通量测序技术对其16S rDNA V4区进行测序分析,并采用PCR荧光定量技术对肠道菌群中的乳杆菌进行定量检测。结果模型组小鼠DAI评分明显高于空白组(t=4.137 0,P=0.000 4),药物干预后,中药组和阳性药对照组DAI评分明显下降(t=2.240 3,P=0.035 0;t=2.081 6,P=0.048 6),差异均有统计学意义;病理HS评分显示,与模型组比较,其余组别小鼠HS评分均明显降低(空白组:t=5.452 8,P=0.000 2;中药组:t=3.117 1,P=0.009 8;阳性药对照组:t=3.306 2,P=0.007 0),差异均有统计学意义;测序结果显示模型组小鼠肠道菌群物种多样性和丰度均明显降低,药物干预后菌群多样性和丰度提高,模型组致病菌丰度较高,药物治疗后可增加有益菌数量,减少致病菌数量。PCR荧光定量检测乳杆菌结果显示,与模型组相比,其余组别小鼠肠道中乳杆菌含量均明显增加(空白组:t=3.871 8,P=0.002 6;中药组:t=2.224 3,P=0.048 0;阳性药对照组:t=2.976 4,P=0.012 6),差异均有统计学意义,而阳性药对照组和中药组之间未见明显区别(t=2.007 0,P=0.070 0)。结论薏苡附子败酱散能够调节肠道菌群的结构,增加物种多样性,改善和恢复有益菌和有害菌的丰度比例,从而发挥对急性UC的治疗作用,其中乳杆菌发挥了明显作用。     

基于16S rDNA技术研究隔药饼灸对高脂血症兔肠道菌群属水平的影响

研究隔药饼灸对高脂血症兔属水平肠道菌群的作用,筛选相关菌属。

将24只兔按随机数表法分为正常组、模型组和隔药饼灸组,每组8只;干预12周后,观察TC、TG、LDL-C水平的变化,采用16S rDNA高通量测序技术分析属水平菌落差异。

与模型组比较,隔药饼灸组兔血清LDL-C、TG、TC水平均下降（均P＜0.05）。隔药饼灸组肠道菌群结构发生改善,un_f_Muribaculaceae、un_o_Gastranaerophilales、瘤胃球菌科UCG-014属、阿克曼菌属相对丰度均显著提高（均P＜0.05）,毛螺菌属NK4A136、瘤胃梭菌属6、拟杆菌属相对丰度均降低（均P＜0.05）。

隔药饼灸能改善异常血脂及调整菌群结构,可能与上调un_f_Muribaculaceae、un_o_Gastranaerophilales、瘤胃球菌科UCG-014属、阿克曼菌属相对丰度,降低毛螺菌属NK4A136、瘤胃梭菌属6、拟杆菌属相对丰度有关。