纳豆激酶,一种潜在的用于预防与治疗心血管疾病的功能食品添加剂

纳豆激酶是一种具有高效纤维蛋白溶解活性的丝氨酸蛋白酶,由枯草属菌株、假单胞菌属菌株和海洋生物合成。与常规的纤维蛋白溶解酶相比,纳豆激酶具有高效、无毒、半衰期长、可以口服、成本低廉等优点,在功能性食品添加剂和心血管疾病预防与治疗等方面极具应用潜力。对纳豆激酶及其生产菌株选育、发酵条件优化、重组表达、分子改造、分离纯化、功能研究和安全评估等方面进行了简单介绍,并归纳总结了纳豆激酶现有问题,同时就其生产和应用前景进行了展望。     

纳豆激酶的研究与应用

纳豆激酶是一种枯草芽孢杆菌产生的丝氨酸蛋白酶 ,具有强烈的纤溶活性 ,有望开发成为新型口服溶栓药。综述了纳豆激酶的生化特性、生物学活性、结构与功能及开发应用前景等。     

纳豆激酶的研究现状与展望

纳豆激酶是从日本传统食品纳豆中提取的一种枯草杆菌蛋白酶,具有高效的抗血栓作用.与其他传统溶栓剂相比,纳豆激酶具有安全性好、成本低、易被人体吸收、作用直接迅速、作用持续时间长等优点,因此极有可能开发为新一代的溶栓剂.概括了纳豆激酶的分子结构、理化性质、溶栓作用机理、活性检测方法,介绍了其分子生物学研究进展,并对其开发应用进行了展望,证明纳豆激酶具有广阔的市场应用前景.     

纳豆芽孢杆菌菌种纯化及不同氮源对其产纳豆激酶的影响

纳豆激酶(nattokinase, NK)是一种由纳豆芽孢杆菌发酵产生的丝氨酸蛋白酶,具有良好的纤溶活性。本研究从wako Nattokinase中分离纯化出高品质的纳豆芽孢杆菌,旨在探究最适宜该菌产纳豆激酶的发酵培养基氮源。研究人员选择了6种氮源对其进行发酵实验,通过连续测定发酵液的菌量、pH和纤溶活性以观察不同氮源对纳豆芽孢杆菌产纳豆激酶的影响。研究结果表明:最优氮源为乳清蛋白,在以此为氮源的培养基中发酵培养120 h后,纳豆激酶的纤溶活性高达1 757.79 U/mL。以乳清蛋白发酵培养基对纳豆芽孢杆菌进行发酵,不仅可以得到高活性的纳豆激酶,还可为纳豆激酶应用于食品、保健品领域提供思路。     

重组纳豆激酶的研究进展

纳豆激酶是一种碱性丝氨酸蛋白酶,具有较强的直接溶解血纤维蛋白的特性,与当前的溶栓药物相比具有诸多优点,已成为新型溶栓药物开发的焦点。本文首先简要介绍了纳豆激酶基因及纳豆激酶分子的理化特性和生物学功能,对当前国内外采用基因工程技术（密码子优化、点突变、高效表达系统构建等）重组表达纳豆激酶的研究进展进行了综述,分析了其中存在的主要问题和不足以及商业化生产重组纳豆激酶的可能性,对纳豆激酶在医药、食品等行业中的应用前景进行了展望。     

纳豆激酶基因的表达及纯化

利用PCR方法从分泌纳豆激酶的枯草杆菌基因组DNA中扩增得到纳豆激酶基因(NK),利用基因重组技术构建了纳豆激酶基因的表达载体pETNK。在诱导下,实现了在大肠杆菌中高效表达,经SDS-PAGE电泳分析和薄层扫描结果显示,表达的目的蛋白占菌体蛋白的21．5％。将表达产物经过DEAE-Cellulos-DE52和Sephedax-G100两个柱分离纯化,得到纯的纳豆激酶蛋白干粉,经琼脂糖-纤维蛋白平板法测出纳豆激酶干粉的溶栓活性相当于200u尿激酶。从基因工程角度研究纳豆激酶基因的克隆、表达及纯化,为用基因工程菌生产纳豆激酶奠定了基础。     

药食两用纳豆激酶的研究进展

本文从血栓栓塞疾病的形成机制为依据,综述了纳豆激酶的药理作用。介绍了国内外产纤溶酶菌株的筛选方法,纳豆激酶的分离、纯化常用技术,纳豆激酶的生理生化特性、活性测定方法。并说明了影响纳豆激酶稳定的4个因素,和增加纳豆激酶产量的有效方法。通过药食两用纳豆激酶的研究进展,希望对纳豆激酶的研究提供理论基础。     

纳豆激酶

纳豆激酶 (ｎａｔｔｏｋｉｎａｓｅ)是一种枯草杆菌蛋白激酶 ,是在纳豆发酵过程中由纳豆枯草杆菌 (Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ/ｎａｔｔｏ)产生的一种丝氨酸蛋白酶。 1 987年由日本的须见洋行等首先发现[1～ 3] 。研究发现 ,纳豆激酶具有纤溶活性 ,可治疗和预防血栓病 ,它还可激活体内的纤溶酶原 ,从而增加内源性纤溶酶的量与作用[4] 。目前常用的及一些还在开发的治疗心脑血管栓塞疾病的药品 ,如链激酶 (ｓｔｒｅｐ ｔｏｋｉｎａｓｅ ,ＳＫ)、尿激酶 (ｕｒｏｋｉｎａｓｅ ,ＵＫ)、重组组织型纤溶酶原激活剂 (ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ…     

纳豆激酶的研究与应用

纳豆激酶的研究与应用付利,杨志兴（黑龙江省科学院应用微生物研究所）纳豆为日本的传统发酵大豆食品,已食用了２０００年以上。它是由枯草杆菌（ＢａｃｉｌｌｕｓＳｕｂｔｉｌｉｓ）或纳豆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｎａｔｔｏ）发酵大豆制造成的,日本民众十分喜欢食用。同时也被用作民间药品,以预防和治疗心脑血管性疾病。     

纳豆激酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

纳豆激酶纳是从日本传统食品纳豆中发现的一类具有溶栓效果的蛋白酶,由于其具有安全,高效,作用时间长,易吸收,廉价等优点,现在正成为一个开发治疗血栓类疾病药物的研究热点。从本实验室保存的一株高溶栓的纳豆杆菌N07出发,提取总基因组DNA,利用PCR手段扩增获得了纳豆激酶长为825bp的成熟肽基因片段。构建重组表达质粒pPICZaA-NK,经EcoR I、Xba I双酶切、PCR、测序验证得出重组表达质粒上的外源基因即为825bp的目的片段;将重组质粒pPICZaA-NK用内切酶Sac I线性化后电击导入毕赤酵母X33,通过含Zeocin的YPDS平板筛选获得重组酵母。重组酵母在BMMY培养基中发酵培养,用1%甲醇诱导目的蛋白表达。用纤维蛋白平板法检测发现发酵上清具有纤溶活性,经硫酸铵盐析、透析、Sephadex-G50过柱等步骤分离得到纳豆激酶蛋白,进行SDS-PAGE鉴定表明,表达的纳豆激酶蛋白分子量为27KD。以尿激酶为标准,实验所得纳豆激酶发酵上清液溶栓活性约为195U/mL。成功的将纳豆激酶成熟肽基因在毕赤酵母X33中表达,为纳豆激酶基因工程进一步研究奠定基础。     

纳豆激酶集成化分离技术

综述了纳豆激酶的分离纯化技术的研究现状和发展趋势。通过对常规分离技术的分析,重点讨论了集成化分离技术的应用及其优势,包括集成化双水相分配技术、扩张床吸附技术以及耐盐性混合模式吸附技术等分离方法。并指出集成化分离技术在生产纳豆激酶以及其他活性蛋白方面,具有广阔的应用前景。     

纳豆激酶的原核表达、纯化及其特性分析（英文）

纳豆激酶(Nattokinase)作为一种新型溶解血栓的纤维蛋白溶解酶,有着广阔的市场前景和巨大的产业化潜力。本研究从枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis natto)发酵液中提取、纯化纳豆激酶,依次通过硫酸铵盐析、凝胶过滤层析和疏水层析方法纯化纳豆激酶,纯化倍数为5.2,纯化率为46.3%。纯化后的纳豆激酶经SDS-PAGE电泳显示相对分子量约为28 kD a,纤维蛋白平板法显示活性为4 580 IU/mg。但纳豆激酶在枯草芽胞杆菌发酵液中的含量较低,因此在原核表达载体大肠埃希菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中克隆并高效表达了纳豆激酶基因,其纳豆激酶产量显著提高,但酶活相对降低。     

纳豆激酶基因在大肠杆菌中活性表达的比较研究

实现纳豆激酶基因 (nattokinasegene)在大肠杆菌中高活性表达 ,并说明前肽 ( pro序列 )对纳豆激酶的活性表达必不可少。以纳豆芽孢杆菌基因组DNA为模板 ,采用PCR方法分别扩增编码信号肽、前肽及成熟肽的序列 ( pre pro NK)和编码前肽、成熟肽的序列 (pro NK) ,构建了大肠杆菌表达质粒 pTYB1 0 1 ,pTYB1 0 2 ,转化大肠杆菌ER2 5 66。在IPTG诱导下 ,分别在 1 5℃ ( 1 4h) ,3 0℃ ( 3h)和 3 7℃ ( 2h)培养。结果可见 ,pTYB1 0 2能表达有活性的纳豆激酶。SDS PAGE表明 ,1 5℃表达杂蛋白更少。薄层扫描显示表达的纳豆激酶占菌体总蛋白的 3 0 %以上。成功制备了表达纳豆激酶的工程菌。     

纳豆激酶基因的克隆与表达

利用ＰＣＲ方法从分泌纳豆激酶的枯草杆菌基因组ＤＮＡ 中扩增得到了纳豆激酶基因,并测定其核苷酸序列．利用基因重组技术构建了纳豆激酶基因的表达载体,并在大肠杆菌中进行了表达．ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳表明,表达蛋白占菌体蛋白的１５．２％ ,琼脂糖－纤维蛋白平板法测出表达产物具有溶解血栓活性．     

纳豆激酶酶原基因和纳豆激酶基因的克隆及在大肠杆菌中表达

目的：构建可高效生产有活性的纳豆激酶的大肠杆菌工程菌。方法：将纳豆激酶酶原（pro-nattokinase,pro-NK)基因和纳豆激酶（natokinase,NK)基因,并分别克隆到表达融合蛋白的高效表达载体pJN上,构建出表达质粒pJNK1和pJNK2,并转化大肠杆菌BL21（DE3）。结果：IPTG诱导下,两个融合蛋白的表达量均达到30%,活性检测显示表达纳豆激酶酶原融合蛋白的菌株pJNK-1(BL)诱导后菌体破碎上清的溶栓活性比表达纳豆激酶融合蛋白的菌株pJNK-2(BL)高2-3倍,结论：纳豆激酶酶原融合蛋白部分自减切产生纳豆激酶成熟肽。     

纳豆激酶粗提液的体外溶栓抑菌实验

目的探讨纳豆激酶粗提液的体外溶栓、抑菌作用.方法以大豆为培养基,米曲霉为菌种,发酵制得成熟纳豆,用不同饱和度(NH4)2SO4对粗提液进行盐析,所得沉淀溶于生理盐水中,用纤维蛋白平板法测定其活性,确定提取纳豆激酶的分级沉淀范围.用体外溶栓法测纳豆激酶粗提液的体外溶栓作用.用平板打孔法及纸片扩散法测不同浓度纳豆抑菌物质的体外抑大肠杆菌作用.结果纳豆激酶的(NH4)2SO4分级沉淀范围选择在60%.纳豆激酶粗提液对血块的溶解作用较同样活力大小的尿激酶强.纳豆抑菌物质粗提液对大肠杆菌都具有一定的体外抑制作用,当浓度大于50%,抑菌圈直径随着浓度的增高而增大.结论纳豆激酶粗提液具有较好的体外溶栓作用,并对大肠杆菌具有一定的抑制作用.     

纳豆激酶的液体发酵条件优化

以纳豆素中分离的纳豆芽孢杆菌进行纳豆激酶发酵试验,考察装液量、接种量、摇床转速等因素对生物量和纳豆激酶纤溶活性的影响,揭示产酶规律并确定最优产酶条件。发酵培养基配方为2%葡萄糖、2%蛋白胨、0.05%Mg SO4、0.01%Ca Cl2、0.6%Na2HPO4、0.4%Na H2PO4。最终确定的发酵条件为:p H 6.9,2%接种量,45 m L/250 m L的装液量,33.5℃,摇床转速为165 r/min,在此条件下发酵33~34 h为产酶高峰期,纳豆激酶的纤溶活性达到1 004 U/m L,结果也表明纳豆激酶是一种生长关联型代谢产物,纤溶活性与生物量变化趋势高度一致。     

纳豆激酶豆乳液体发酵条件优化

心脑血管疾病已经严重威胁人类健康,其发病率和死亡率均居各种疾病之首。纳豆激酶作为一种理想的预防和治疗血栓的天然功能食品被广泛关注,因此研究纳豆激酶的规模化生产对于推进溶栓类功能食品的开发具有重要意义。在前期发酵豆乳工艺优化的基础上,对因素顺序及因素水平稍作调整,以全豆豆乳为发酵基质,以纳豆激酶为功能评价指标,发酵后出渣率及终点p H为参考指标,通过单因素及正交试验确定最佳发酵工艺。结果表明,发酵豆乳的最佳工艺条件为:发酵时间30 h,装液量5%,初始p H5.5,接菌量1.5%。在此发酵条件下,酶活可高达660 184.14 IU/mL,是优化前(79 434.68 IU/mL)的8.31倍,是前期最佳工艺下纳豆激酶表达量(429 869.34 IU/mL)的1.54倍。与前期全豆豆乳最佳工艺条件相比,通过调整初始pH和接菌量的先后顺序,可以在更低接菌量(前期研究,最佳接菌量为1.75%)的基础上,显著增加纳豆激酶表达量。通过本实验研究既节约了成本也提升了纳豆激酶的表达量,对纳豆激酶的规模化生产具有重要意义。     

纳豆激酶基因在大肠杆菌中的表达及活性分析

目的:构建纳豆激酶基因的表达载体,鉴定其在大肠杆菌中的表达及表达产物的生物活性鉴定.方法:以纳豆芽胞杆菌基因组为模板,PCR技术克隆出纳豆激酶基因的成熟肽序列,分别克隆进具有信号肽的pMAL-p2x及无信号肽pMAL-c2x质粒中,经酶切和测序鉴定其正确性,分别将重组质粒转化至大肠杆菌中表达.结果:成功构建的两组重组质粒在IPTG诱导下,均能分别在37℃及16℃条件下表达出可溶性的融合蛋白,SDS-PAGE胶检测证实重组质粒在大肠杆菌中可表达出相对分子量约76kDa的纳豆激酶蛋白.纤维蛋白平板实验证明两种融合蛋白均有活性,且有信号肽的融合蛋白的酶活较无信号肽的融合蛋白高.结果:成功构建了两组重组纳豆激酶基因的表达质粒,且该两组重组基因在大肠杆菌中可溶性表达并具有生物活性,因此为下一步研究表达产物纳豆激酶的功能、应用和生产奠定了基础.     

纳豆激酶生产菌的筛选及发酵纳豆特性研究

为开发具有特定生理活性的新型纳豆保健品,从发酵豆制品中分离筛选得到一株纳豆激酶高产菌株。利用该菌株以及市售的3种纳豆中的纳豆菌进行纳豆发酵,比较了4株纳豆菌发酵纳豆的特性,并对纳豆激酶活性进行分析。结果表明5号菌株发酵生产纳豆周期短,颜色金黄,具有酱香味,拉丝长度最佳。同时,对产纳豆激酶的最佳发酵时间进行研究,结果表明发酵至17 h纳豆激酶活性达到最大值。