联合补充维生素D、胶原肽和钙对成骨细胞发育的影响研究

目的：观察联合补充维生素D、胶原肽和钙对MC3T3-E1成骨细胞增殖及对骨保护素细胞内核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of NF-κB ligand,RANKL）、骨保护素（Osteoprotegerin,OPG）基因表达的影响。方法：α-MEM培养基培养MC3T3-E1细胞。检测Ca2+（20 μg/mL）、维生素D（0、10-12、10-11mol/L）、胶原肽（0、50、100μg/mL）三者交互作用剂量对MC3T3-E1细胞增殖的作用及RANKL、OPG mRNA表达。结果：维生素D、胶原肽和钙交互剂量作用下细胞增殖水平无明显差异。维生素D联合钙能够明显降低RANKL mRNA表达水平,提高OPG mRNA表达水平,降低RANKL/OPG比值。而胶原肽联合钙对RANKL以及 OPG mRNA表达无明显影响。结论：维生素D联合钙可通过抑制小鼠成骨细胞RANKL mRNA表达、促进OPG mRNA表达,从而促进骨的形成,抑制骨的吸收。维生素D和钙联合补充胶原肽,对成骨细胞RANKL,OPG mRNA表达并无明显影响。     

葛根异黄酮对去卵巢大鼠骨骼生物力学的影响

目的:观察葛根异黄酮对去卵巢大鼠骨骼生物力学的影响。方法:选用健康3月龄SD雌性大鼠50只,随机分为5组:假手术组、模型对照组、低、中、高剂量葛根异黄酮组;假手术组切除卵巢旁脂肪组织,其余各组均切除双侧卵巢,建立去卵巢大鼠动物模型。按25、50、100 mg/kg 3个剂量葛根异黄酮分别给去卵巢大鼠灌胃6个月,并于实验结束后处死大鼠,检测腰椎骨骼生物力学功能、骨矿含量和股骨骨钙含量及子宫重量。结果:高剂量葛根异黄酮治疗组6个月后腰椎最大负荷、结构强度和骨矿含量均较模型对照组明显改善,股骨骨钙含量也明显增高;各个葛根异黄酮治疗组子宫重量均较模型对照组明显增加。结论:葛根异黄酮可改善去卵巢大鼠骨骼生物力学功能,具有雌激素样的抗骨质疏松作用。     

不同温度下成骨细胞增殖及其OPG/RANKL mRNA表达的影响

目的:探讨不同温度下对小鼠成骨细胞MC3T3-E1的增殖以及OPG/RANKL表达水平的影响。方法:1.以小鼠成骨细胞MC3T3-E1为体外实验模型,MTT法检检测细胞的增殖情况。2.RT-PCR方法检测MC3T3-E1OPG/RANKL mRNA的表达水平。结果:设定对照组为37℃,高于对照组(38℃-39℃-40℃-41℃-42℃)分别作用于MC3T3-E1细胞1小时/天,连续1周,可刺激细胞增殖,OD值显著增加(P<0.05)。同时可增加OPG mRNA表达,降低RANKL mRNA表达,呈温度梯度依赖性。结论:热刺激促进MC3T3-E1细胞增殖,同时通过调节OPG/RANKL mRNA的表达,直接促进骨形成,抑制骨吸收。     

雷奈酸锶在高糖诱导的成骨细胞损伤中的保护作用

目的:探究雷奈酸锶(SR)在高糖诱导的成骨细胞损伤中的保护作用。方法:体外培养MC3T3-E1成骨细胞,用MTT法筛选出能够诱导成骨细胞活性显著降低的高糖浓度,以及能够促进成骨细胞活性的最优SR浓度,随后观察SR对高糖诱导的成骨细胞的作用效果。采用MTT法检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测凋亡水平,PCR和ELISA分别检测骨形成相关基因表达和蛋白分泌水平。结果:0.50 mmol/L的SR能够显著增强高糖诱导的MC3T3-E1成骨细胞的增殖能力和细胞活性,降低细胞凋亡水平,改善细胞形态,并显著促进Runx2、OCN、COL-1、BMP-2、IGF-1等的表达。结论:SR能够通过增加成骨细胞活性、抑制成骨细胞凋亡、促进骨形成相关因子的表达和分泌,发挥对高糖诱导的成骨细胞损伤的保护作用,为SR发挥糖尿病骨质疏松的治疗作用提供了实验依据。     

力生长因子及其E肽对成骨细胞分化的影响

力生长因子(mechano growth factor,MGF)是新近发现的一种生长因子,由Igf-1基因剪接变异产生,拉伸刺激会促使成骨细胞表达力生长因子.比较分析了MGF及其羧基端E肽(MGF-Ct24E)对成骨细胞前体细胞MC3T3-E1分化的影响.结果显示:MGF和MGF-Ct24E具有显著激活胞外信号调节激酶1/2(Erk1/2)的作用,并降低了成骨细胞碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原的表达,促进了骨桥蛋白(OPN)的表达,减少了核心绑定因子(corebinding factor1,Cbfα-1)的核转运量,对成骨细胞的分化具有延迟效应,这种效应通过抑制剂PD98059抑制Erk1/2的活化得到逆转;MGF还能显著激活磷脂酰肌醇3-激酶信号通路中的蛋白激酶B(Akt),该活化作用对成骨细胞分化是必需的,钙沉积分析显示长期培养下的细胞MGF促进了矿化节结的形成.这些结果说明,MGF-Ct24E对成骨细胞的分化具有抑制作用,这种作用与Erk1/2的活化有关,MGF因为包含E肽和IGF-1部分,能分别激活Erk1/2和Akt,因此对成骨细胞分化表现出双重效用,在成骨细胞分化早期,具有一定的延迟效应,而在分化晚期对成骨...     

锌协同三羟异黄酮对成骨细胞MC3T3-E1的影响

目的:观察锌协同三羟异黄酮对成骨细胞MC3T3-E1增殖、细胞中碱性磷酸酶(ALP)含量、骨形成蛋白-2(BMP-2)表达的影响,探讨锌协同三羟异黄酮对骨质疏松的防治作用.方法:采用四甲基偶氮噻唑蓝比色法检测(1×10-7)mol/L、(1×10-6)mol/L、(1x 10-5)mol/L、(1×10-4)mol/L的三羟异黄酮以及与(1×10-5)mol/L锌联合作用时对MC3T3-E1增殖的作用;应用Western blot法检测三羟异黄酮与锌联合作用前后,成骨细胞中BMP-2蛋白的表达水平,用比色法检测MC3T3-E1中ALP的含量.结果:锌与三羟异黄酮单独作用或协同作用于MC3T3-E1细胞,其增殖率随着三羟异黄酮浓度的增加和作用时间的延长而升高,(1×10-5)mol/L的三羟异黄酮协同(1×10-5)mol/L的锌作用72h,其细胞增殖率为(160.1±14.3)%.细胞中的LP含量及BMP-2的表达也随着三羟异黄酮浓度的增加及作用时间的延长而增加.三羟异黄酮和锌联合作用后,对ALP活性的增强、BMP-2表达的增加作用均较各自单独作用时更为明显(P＜0.05).结论:三羟异黄酮与锌协同作用表现出雌激素效应,可通过促进骨形成蛋白的合成从而促进成骨细胞的增殖、增加骨量.     

体外培养所形成的细胞外基质对MC3T3-E1细胞生长和分化的影响

细胞外基对组织细胞起支持、保护、营养作用,对细胞的增殖、分化有重要影响,在细胞和组织工程中,应该充分考虑细胞外基质的作用。本研究首先脱去培养板中融合培养的原代小鼠心肌成纤维细胞和成骨细胞,获得两种体外形成的细胞外基质包被的培养板,其中成骨细胞细胞外基质中含有骨形成蛋白2。然后将MC3T3-E1成骨前体细胞接种在这种培养板中,发现成纤维细胞胞外基质包被的培养板中的细胞增殖活性最高,而成骨细胞胞外基质包被的培养板中细胞的碱性磷酸酶活性、骨形成蛋白2和骨桥蛋白的相对蛋白表达量最高,细胞外钙沉积量比其他组高1倍左右。结果表明：包被在培养板上的这两种细胞外基质有不同的生物活性,成纤维细胞胞外基质可促进成骨前体细胞增殖,成骨细胞胞外基质可促进成骨前体细胞骨向分化。     

饲料钙磷含量和钙磷比对生长期大鼠体重增长与骨骼发育的影响

目的研究饲料中不同的钙磷含量和钙磷比对生长期实验大鼠体重及骨骼发育的影响。方法采用完全随机化设计方案,取1月龄（100±10）g清洁级Wistar雄性大鼠70只,随机分成7组,每组10只,饲喂7种不同钙磷含量的饲料。自由采食,饮用去离子水,试验期42 d。各组于实验开始和结束时称重。试验结束后,处死动物并分离一侧胫骨和股骨用于实验指标的检测。结果当保持饲料中钙或者磷中的一种含量不变的情况下,调整另一种的含量即改变钙磷比例时,1.2∶1的正常钙磷比例组生长期实验大鼠增重及骨骼发育要明显好于0.4∶1的低钙磷比例组和4∶1的高钙磷比例组（P〈0.05）,并且当保持饲料中钙磷比例不变时,即使在低钙低磷和高钙高磷进食水平下,正常钙磷比例组大鼠增重及骨骼发育都较好,但低钙磷比例组和高钙磷比例组大鼠增重及骨骼发育则由于饲料中钙磷含量的变化波动较大（P〈0.05）。结论饲料中钙和磷需按比例添加,如果两者绝对含量相差过大就会影响到动物的增重及骨骼发育,本实验证明饲料钙磷比为1.2∶1时生长期实验大鼠增重及骨骼发育较好。     

高浓度葡萄糖通过p38MAPK-TXNIP/TRX-ROS通路抑制MC3T3-E1细胞成骨分化

目的：研究高浓度葡萄糖抑制MC3T3-E1细胞成骨分化的机理。方法：建立MC3T3-E1细胞成骨分化诱导体系,观察不同浓度葡萄糖（5.5mM和22mM）对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响;用不同浓度的p38 MAPK抑制剂Fr167653（0.1μM、1.0μM和10μM）进行药物干预,观察MC3T3-E1细胞在22mM葡萄糖浓度下成骨分化的变化情况。通过钙含量检测、Real time PCR检测相关分化的变化;用Western Blot方法检测MC3T3-E1细胞分化过程中p38 MAPK磷酸化状态、TXNIP表达水平的变化;使用胰岛素二硫键还原法检测细胞内TRX活性水平;使用活性氧检测试剂盒检测细胞内自由氧生成水平。结果：体外诱导条件下,高浓度（22mM）葡萄糖通过升高p38 MAPK磷酸化水平,上调TXNIP表达水平,同时降低TRX活性,使细胞内自由氧生成增加,抑制MC3T3-E1细胞的成骨分化;Fr167653通过抑制p38 MAPK磷酸化,下调TXNIP表达同时升高TRX活性,抑制细胞内自由氧生成,解除高浓度葡萄糖对细胞成骨分化的抑制作用。结论：高浓度葡萄糖通过p38 MAPK-TXNIP/TRX-ROS信号通路抑制MC3T3-E1细胞成骨分化。     

生物活性肽-蛋氨酸脑啡肽对成骨细胞增殖的影响

蛋氨酸脑啡肽（Methionine Enkephalin,MENK）作为内源性物质,通过与阿片受体结合,发挥阿片样物质的生物学作用。研究表明,MENK在成熟的骨组织和成骨细胞中均有分布,并且在成骨细胞表面发现了阿片受体。实验旨在进一步研究MENK对成骨细胞增殖的影响。体外培养MC3T3-E1成骨细胞,MTT方法检测MENK对成骨细胞增殖的影响。结果表明,10-7、10-8、10-9mol/L的MENK对成骨细胞的增殖具有促进作用（P〈0.05）。提示MENK可在骨缺损疾病中发挥促进骨组织重建的作用。     

染料木黄酮对去势大鼠骨骼矿化的影响

目的: 研究染料木黄酮对去势大鼠骨骼矿化的影响.方法: 雌性Wistar大鼠47只随机分为假手术组,去势对照组、去势 雌激素组(己烯雌酚20 μg.kg bw-1.d-1)、去势 染料木黄酮组(剂量分别为25、50、100 mg.kg bw-1.d-1).饲养三个月后处死,测定骨密度、骨矿化相关参数、骨钙、磷、锌、镁、锰、血清甲状旁腺激素、降钙素和雌激素含量.结果: 大鼠去势后,股骨骨密度降低,平均类骨质宽度增大,骨矿化延迟时间和类骨质成熟时间延长,骨中钙、磷、锌、镁和血清雌激素含量降低,与假手术组相比均有显著性差异(P＜0.05);补充染料木黄酮后,股骨骨密度有改善的趋势,平均类骨质宽度变窄,骨矿化延迟时间和类骨质成熟时间缩短,骨中钙、磷、镁含量升高.结论: 染料木黄酮通过促进类骨质矿化,减少骨中钙、磷、镁丢失,预防骨质疏松的发生.     

高浓度葡萄糖通过p38MAPK-TXNIP/TRX-ROS通路抑制MC3T3-E1 细胞成骨分化

目的：研究高浓度葡萄糖抑制MC3T3-E1细胞成骨分化的机理。方法：建立MC3T3-E1 细胞成骨分化诱导体系,观察不同浓 度葡萄糖（5.5mM 和22mM）对MC3T3-E1 细胞成骨分化的影响;用不同浓度的p38 MAPK 抑制剂Fr167653（0.1 滋M、1.0 滋M 和 10 滋M）进行药物干预,观察MC3T3-E1 细胞在22mM葡萄糖浓度下成骨分化的变化情况。通过钙含量检测、Real time PCR 检测 相关分化的变化;用Western Blot 方法检测MC3T3-E1 细胞分化过程中p38 MAPK 磷酸化状态、TXNIP 表达水平的变化;使用胰 岛素二硫键还原法检测细胞内TRX活性水平;使用活性氧检测试剂盒检测细胞内自由氧生成水平。结果：体外诱导条件下,高浓 度（22mM）葡萄糖通过升高p38 MAPK 磷酸化水平,上调TXNIP 表达水平,同时降低TRX 活性,使细胞内自由氧生成增加,抑制 MC3T3-E1 细胞的成骨分化;Fr167653通过抑制p38 MAPK 磷酸化,下调TXNIP 表达同时升高TRX活性,抑制细胞内自由氧生 成,解除高浓度葡萄糖对细胞成骨分化的抑制作用。结论：高浓度葡萄糖通过p38 MAPK-TXNIP/TRX-ROS 信号通路抑制 MC3T3-E1细胞成骨分化。     

氟骨症不同动物模型的建立与评价

目的 为选择合适的实验动物并建立氟骨症动物模型,研究不同动物对氟化物致骨骼损伤的敏感性.方法 分别选取离乳新西兰兔、Hartley豚鼠、Wistar大鼠、KM小鼠各16只,每种动物随机分为两组,每组8只,即对照组(C):饲喂标准饲料,饮用去离子水;模型组(M):饲喂标准饲料,饮用150 mg/L氟化钠(NaF)去离子水.在饲喂60 d后取股骨制作组织切片观察组织形态变化,并测定股骨骨氟、骨钙、骨磷的含量及血清碱性磷酸酶(ALP)活性.结果 与对照组相比,各种实验动物模型组生长发育受到显著的抑制,股骨形态破坏明显,骨矿化显著减少,骨氟含量显著升高,血清ALP活性显著增强,但股骨钙和磷含量差异无显著性(P＞0.05).结论 高氟可不同程度的损害豚鼠、家兔、小鼠、大鼠的生长发育及骨骼系统,导致产生氟骨症,但综合考察,以豚鼠、家兔较为敏感,其次为小鼠、大鼠.     

川陈皮素通过RORα/SOST信号通路改善自然衰老小鼠的骨流失

随着世界人口老龄化的加速,老年性骨质疏松症的发病率呈现出明显的上升趋势。衰老相关的骨质流失的机制研究对寻找有效的治疗骨质疏松药物具有重要意义。天然产物为治疗骨质疏松症药物的发现提供了丰富的来源。川陈皮素是柑橘属植物果实中含量最丰富的黄酮类成分之一,具有多种生物活性。在本研究中我们以20个月自然衰老小鼠为模型,连续15天腹腔注射给予川陈皮素,Micro-CT结果表明川陈皮素可以增加自然衰老小鼠骨体积分数和降低骨小梁分离度,改善自然衰老小鼠的骨微观结构,HE染色结果表明川陈皮素可增加骨小梁表面成骨细胞数量,川陈皮素处理小鼠血清中骨钙蛋白（Osteocalcin）水平显著增加。在细胞水平,川陈皮素处理小鼠前成骨细胞（MC3T3-E1）,Mki67水平显著增加,骨碱性磷酸酶水平和骨钙蛋白水平增加,茜素红染色明显增强,表明川陈皮素能促进MC3T3-E1细胞增殖、分化和矿化。进一步机制研究发现川陈皮素可直接激活视黄酸受体相关孤儿受体α（retinoic acid receptor-related orphan receptors, RORα),并以RORα依赖的方式下调骨硬化蛋白（Sclerostin, SOST）水平、上调骨钙蛋白水平,从而调节成骨细胞功能。本研究揭示了川陈皮素改善自然衰老相关骨流失的新功能和新机制,为川陈皮素这一天然产物在自然衰老骨质疏松方面应用提供了新的依据。     

毕赤酵母中表达的鲑鱼降钙素与骨生长肽融合蛋白的活性检测

通过体外和体内活性实验 ,检测在毕赤酵母中的表达、纯化后的鲑鱼降钙素与骨生长肽融合蛋白是否具有抑制破骨细胞和促进成骨细胞活性的作用 ,期望通过这两个方面同时进行骨质疏松症的治疗。利用MTT法检测此融合蛋白在体外对成骨细胞和成纤维细胞增殖的刺激作用 ,利用碱性磷酸酶检测试剂盒与血清钙检测试剂盒检测此融合蛋白在体内对成骨细胞和破骨细胞活性的影响。细胞实验 (体外 )和动物实验 (体内 )其结果都证明表达的融合蛋白既可以抑制破骨细胞的活性 ,又可以促进成骨细胞的活性 。     

洛伐他汀促进成骨细胞增殖、BMP-2表达和矿化的实验研究

目的研究洛伐他汀对体外培养大鼠颅骨成骨细胞生物学功能的影响,探讨其促进骨形成的作用机制.方法洛伐他汀作用于体外培养大鼠颅骨成骨细胞,化学染色观察对成骨细胞矿化结节形成的影响;用免疫细胞化学单标计数测定成骨细胞增殖率及染色吸光度测定BMP-2的表达的变化;BMP-2和BrdU免疫双标染色吸光度测定新生成骨细胞BMP-2的表达情况.结果实验组成骨细胞矿化结节的数量和面积、细胞增殖率及BMP-2的表达明显高于空白对照组(P<0.05);实验组新生成骨细胞BMP-2的表达显著高于对照组(P<0.01).结论洛伐他汀可促进成骨细胞的增殖、分化、BMP-2的表达和矿化结节的形成,从而发挥促进骨形成的作用.     

PGE2抑制肿瘤坏死因子诱导的成骨细胞凋亡

前列腺素E2(PGE2)通过自分泌或旁分泌方式调节成骨细胞的增殖和分化。本文以小鼠原代成骨细胞和成骨样细胞MC3T3-E1为实验材料,研究了PGE2对肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导的成骨细胞凋亡的调节作用。检测发现,振荡型流体剪切力(OFSS)刺激可诱导成骨细胞内环氧合酶2(COX-2)表达升高,进而促进PGE2合成,并抑制TNF-α诱导的成骨细胞凋亡。COX-2选择性活性抑制剂NS-398显著促进TNF-α诱导的成骨细胞内半胱天冬酶3(caspase-3)的激活,且呈时间依赖性。Hoechst 33258/PI染色检测发现,NS-398促使TNF-α诱导的成骨细胞膜通透性进一步增强,核染色质浓缩加剧,而PGE2可显著抑制这一效应。Caspase-3活性检测证实,NS-398显著促进TNF-α诱导的成骨细胞内caspase-3活性增强,外源性PGE2可有效对抗该效应。这些结果表明,内源性和外源性PGE2可抑制TNF-α诱导的成骨细胞凋亡发生。     

甲状旁腺素、胰岛素样生长因子-1可加速成骨样细胞ROS17/2.8增值周期的进程

甲状旁腺素(parathyroid hormone,PTH)不仅在调节钙磷代谢中可促进骨发生破骨细胞性溶骨,也可促进骨的合成代谢作用。近年发现PTH还可促进成骨细胞的增殖分化。其细胞生物学和分子生物学机理尚待研究。本实验以成骨样细胞ROS17/2.8为研究材料,以胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)为细胞增殖的阳性对照,检测了PTH对DNA合成、细胞周期进程及cyclin E和cyclinA的表达,以求探讨PTH促成骨细胞增殖时对细胞周期的影响。结果表明,PTH可促进DNA合成,改变细胞周期各时相细胞比例及增加cyclin E和cyclin A的表达。该结果提示PTH可加速成骨细胞增殖周期的进程。     

NMDA型谷氨酸受体在骨祖细胞和成骨细胞表达并介导力学信号转导

目的：鉴定骨髓间充质干细胞D1和成骨细胞MC3T3-E1、MC3T3-E1亚克隆14是否表达NMDA型谷氨酸受体（NMDAR）,并初步探讨NMDAR是否参与力学信号转导。方法：采用RT—PCR技术、免疫荧光染色技术、蛋白免疫杂交技术和体外细胞循环拉伸装置,鉴定了上述3个细胞系中NMDAR的表达情况,并初步探讨了在MC3T3-E1亚克隆14细胞系中,NMDAR在力学信号转导中的可能作用。结果：3个细胞系均表达NMDA受体亚基1（NR1）和不同的亚基2（NR2A—NR2D）。细胞微丝骨架的破坏并没有阻断力学应变诱导的c-jun、C—fos的表达上调;而阻断NMDAR后,却抑制了力学应变诱导的c-jun、C—fos和成骨细胞特异的转录因子Cbfa1／Runx2的表达上调。结论：NMDAR在骨中表达并发挥功能,参与了骨的力学信号转导过程。     

热作用下成骨细胞HSP70 mRNA的表达变化及其对破骨细胞增殖的影响

目的:研究不同温度热作用对小鼠成骨细胞系中HSP70 mRNA表达水平的影响及其培养液对小鼠破骨细胞增殖的影响.方法:取小鼠成骨细胞系MC3T3,不同温度(37℃-39℃-41℃-42.5℃)作用其一周,RT PCR方法观察其HSP70表达水平变化,同时取其培养液上清与小鼠破骨前体细胞RAW264.7共培养,MTT法观察其增殖情况.结果:经不同温度热(37℃-39℃-41℃-42.5℃)处理后,MC3T3细胞系中HSP70表达水平明显增加,并且呈现与温度梯度依赖性,其处理后的上清液分别与小鼠破故前体细胞系RAW264.7共培养,MTT法测定其增值水平,结果其增殖受到抑制,且抑制水平与温度呈梯度依赖关系.结论:热刺激可以促进成骨细胞中HSP70的表达,促使成骨细胞抑制破骨细胞增殖,HSP70可能是参与调控成骨细胞与破骨细胞平衡的重要因子.