Throughput screening of a high succinic acid-producing strain

以琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes F3-21为出发菌株,分别用吖啶黄、紫外线、紫外线-硫酸二乙酯和亚硝基胍进行诱变,产生突变菌库.用“96孔板培养-HPLC浓缩检测.厌氧瓶复筛”的模式筛选高产突变株.从1056株突变株中,筛选到一株高产菌株Ⅵ-10-C.连续传代10次,产酸水平不变.在5L发酵罐中补料分批发酵72 h,Ⅵ-10-C产琥珀酸87.6 g/L,生产强度1.22 g/(L·h),糖酸转化率0.66 g/g;琥珀酸产量比出发菌提高了30％.代谢通量与关键酶活性分析表明:相比于F3-21,Ⅵ-10-C发酵过程中从磷酸烯醇式丙酮酸节点处流向草酰乙酸的代谢流量增加了28.9％,相对应的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(PEPCK)酶活提高了23.5％.结果表明用“96孔板培养-HPLC浓缩检测-厌氧瓶复筛”的模式能快速有效筛选高产琥珀酸菌株.     

过量表达Bacillus subtilis磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶对大肠杆菌产琥珀酸的影响

在大肠杆菌厌氧混合酸发酵途径中,磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(PCK)皆可催化由磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)到草酰乙酸(OAA)的反应。鉴于经由PCK催化的反应伴有ATP的生成,理论上更有利于菌体生长和产酸,本研究以大肠杆菌W3110(△pfl,△ldh)为出发菌株,利用λ-Red同源重组系统构建了其ppc缺陷菌株并在此基础上过量表达了Bacillus subtilispck基因。初步的厌氧发酵实验表明:过量表达pck可在一定程度上恢复初始菌株厌氧代谢葡萄糖的能力。其中又以ppc缺陷株更为明显,其耗糖能力和产酸能力分别为对照菌株的4.2和15.3倍。     

高产琥珀酸菌株的通量筛选

以琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes F3—21为出发菌株,分别用吖啶黄、紫外线、紫外线．硫酸二乙酯和亚硝基胍进行诱变,产生突变菌库。用“96孔板培养－HPLC浓缩检测－厌氧瓶复筛”的模式筛选高产突变株。从1056株突变株中,筛选到一株高产菌株Ⅵ-10-C。连续传代10次,产酸水平不变。在5L发酵罐中补料分批发酵72h,Ⅵ－10－C产琥珀酸87．6g／L,生产强度1．22g/（L·h）,糖酸转化率0．66g／g;琥珀酸产量比出发菌提高了30％。代谢通量与关键酶活性分析表明：相比于F3-21,Ⅵ-10-C发酵过程中从磷酸烯醇式丙酮酸节点处流向草酰乙酸的代谢流量增加了28．9％,相对应的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶（PEPCK）酶活提高了23．5％。结果表明用“96孔板培养-HPLC浓缩检测-厌氧瓶复筛”的模式能快速有效筛选高产琥珀酸菌株。     

产酸丙酸杆菌耐酸菌株的选育及其应用

为了解除微生物发酵生产丙酸过程中代谢产物(丙酸)对菌体生长的抑制作用,以实验室保藏的产酸丙酸杆菌(耐30g/L丙酸)为出发菌株P-0,通过丙酸压力筛选获得了一株耐10g/L丙酸的产酸性能良好的菌株P-10,降低了发酵过程中丙酸对菌体生长的抑制作用。菌株P-10做摇瓶发酵,发酵周期168h,丙酸浓度为49.66g/L,产酸速率为0.30g/(L·h),较出发菌株P-0提高了53.04%;7L发酵罐实验表明,菌株P-10发酵周期168h,丙酸浓度为55.63g/L,产酸速率0.33g/(L·h)。同时对菌株P-10做二次接种实验,结果表明,84h为二次接种最适时间段,且84h进行二次接种时,丙酸浓度提高了17.77%,二次接种实验不但有利于有机酸的积累,而且可以提高菌株的产酸能力和耐酸能力;经过选育的菌株P-10具有优良的产酸稳定性,有利于菌种的工业化生产和应用,同时对后续的发酵分离耦合具有重要意义。     

产酸丙酸杆菌耐酸菌株的选育及其应用

为了解除微生物发酵生产丙酸过程中代谢产物(丙酸)对菌体生长的抑制作用,以实验室保藏的产酸丙酸杆菌(耐30g/L丙酸)为出发菌株P-0,通过丙酸压力筛选获得了一株耐10g/L丙酸的产酸性能良好的菌株P-10,降低了发酵过程中丙酸对菌体生长的抑制作用。菌株P-10做摇瓶发酵,发酵周期168h,丙酸浓度为49.66g/L,产酸速率为0.30g/(L·h),较出发菌株P-0提高了53.04%;7L发酵罐实验表明,菌株P-10发酵周期168h,丙酸浓度为55.63g/L,产酸速率0.33g/(L·h)。同时对菌株P-10做二次接种实验,结果表明,84h为二次接种最适时间段,且84h进行二次接种时,丙酸浓度提高了17.77%,二次接种实验不但有利于有机酸的积累,而且可以提高菌株的产酸能力和耐酸能力;经过选育的菌株P-10具有优良的产酸稳定性,有利于菌种的工业化生产和应用,同时对后续的发酵分离耦合具有重要意义。     

琥珀酸发酵高产菌株的选育

以富马酸钠为唯一碳源的选择性平板,从牛的瘤胃中筛选出一株产琥珀酸的菌株Actinobacillus succinogenes CGMCC1593。以该菌株为出发菌株进行NTG诱变,挑选在含有50~100 mmol/L氟乙酸平板生长较快的菌落,经过初筛和复筛,发现SF-9菌株产琥珀酸能力强且积累的乙酸较少。以50 g/L的葡萄糖为碳源,在培养瓶厌氧发酵条件下其琥珀酸产量(35.09 g/L)比出发菌株(28.91 g/L)提高了21.4%,琥珀酸/乙酸比率(w/w)从3.3∶1提高到7.5∶1。用SF-9菌株在5 L发酵罐上进行分批发酵,发酵36 h时琥珀酸积累量达到40.51 g/L,对葡萄糖的转化率为0.81(w/w),琥珀酸/乙酸比率为9∶1,副产物乙酸量比出发菌株降低了约50%。     

酶水解菊芋糖浆发酵生产琥珀酸的初步研究

用产菊粉酶的一株黑曲霉菌株进行产酶发酵条件和水解条件研究,在30℃,pH 6.0,摇床转速200 r/min,发酵时间为3 d的最适产酶条件下,酶活可以达到45.9 U/mL.以总糖含量为85.2 g/L的菊芋粉为初始底物,最适酶水解条件为温度50℃,加黑曲霉培养液的量为10%(v/v),水解12 h后,水解率达到99.6%.用此酶解液在5 L搅拌发酵罐中进行琥珀酸发酵,初始还原糖浓度53.5 g/L,36 h发酵产琥珀酸43.8 g/L,琥珀酸产率0.83 g/g,糖利用率99.0%,琥珀酸生产强度1.22 g/(L·h).     

发酵产氢菌株的筛选及影响因素研究

采用双层平板法从污泥池中筛选出一株产氢较高的发酵菌株,经生理生化鉴定表明,分离菌株初步鉴定为消化链球菌属(Peptostreptococcus).研究静态培养条件下葡萄糖、pH、温度及和酵母膏对菌株产氢的影响及不同发酵时间段的产氢情况.结果表明,在葡萄糖浓度20.0 g/L,pH 7.0,温度37 ℃和酵母膏2.0 g/L时,产氢量达21.07 mmol/L,为初始培养条件下的4.14倍.同时,在24～36 h时间段产氢率达到最高,为0.44 mmol/(L·h),并且在60 h时产氢量达到最大累计产氢量的89.2%.     

ppc基因敲除对大肠杆菌L-色氨酸发酵的影响

目的：减少大肠杆菌L-色氧酸前体物质磷酸烯醇式丙酮酸向草酰乙酸的代谢流,提高其L-色氨酸的产量。方法：以大肠杆菌TRTH0709为出发菌株,利用Red重组敲除技术敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（Ppc）编码基因PPc,并经测序和酶活性检测确证;对出发菌株和基因敲除菌株进行L-色氖酸发酵,对比分析发酵结果。结果：测序和酶活性检测结果表明ppc基因被成功敲除。发酵结果表明,与出发菌株相比,基因敲除菌株TRTH0709△ppc生长速度减慢,最终生物量减少32％,L-色氯酸产量降低27％,但糖酸转化率提高6％;向发酵培养基中添加1％琥珀酸后,TRTH0709△ppc的生长速率和产酸量有所提高,但仍与出发菌株有一定差距。结论：虽然ppc基因敲除对菌体生长和产酸量影响较大,但能有效提高其糖酸转化率;选育Ppc弱化的突变株以达到减弱代谢流且不影响菌体生长,以及增加,L-色氨酸积累的目的,将是本研究今后的主要方向。     

Actinobacillus succinogenes 130Z厌氧发酵产丁二酸条件初步研究

对Actinobacillus succinogenes130Z厌氧发酵产丁二酸的培养条件进行了初步研究。研究了不同有机氮源,不同碳、氮源浓度配比、CO2供体、培养温度,培养基起始pH值对菌株生长和产酸的影响,并在5 L发酵罐中进行了放大试验。结果表明最佳培养基配方为(g/L):葡萄糖10,酵母膏5,NaHCO310,Na2HPO40.3,NaH2PO4.2H2O 9.6,K2HPO43,MgCl20.2,MnCl20.2,NaCl 0.1;pH7.0。在最佳条件下,血清瓶37℃培养24 h,丁二酸产量达到8.3 g/L,在5 L发酵罐中培养,葡萄糖质量浓度分别为10和100 g/L时,丁二酸产量分别达到8.2和45.6 g/L,收率分别为80%和65%。     

过量表达苹果酸脱氢酶对大肠杆菌NZN111产丁二酸的影响

大肠杆菌NZN111是敲除了乳酸脱氢酶的编码基因 (ldhA) 和丙酮酸-甲酸裂解酶的编码基因 (pflB) 的工程菌,厌氧条件下由于辅酶NAD(H) 的不平衡导致其丧失了代谢葡萄糖的能力。构建了苹果酸脱氢酶的重组菌大肠杆菌NZN111/pTrc99a-mdh,在厌氧摇瓶发酵过程中通过0.3 mmol/L的IPTG诱导后重组菌的苹果酸脱氢酶 (Malate dehydrogenase,MDH) 酶活较出发菌株提高了14.8倍,NADH/NAD+的比例从0.64下降到0.26,同时NAD+和NADH浓度分别     

碳源对重组大肠杆菌两阶段发酵产丁二酸的影响

研究了在好氧培养基中分别添加不同碳源对两阶段发酵菌体生长、酶活及代谢产物分布的影响,结果表明添加4mmol/L葡萄糖和12,54,80mmol/L乙酸钠均可以提高好氧阶段的菌体密度和相关酶活。将不同条件下培养的菌体转接厌氧发酵后,厌氧阶段的酶活和代谢产物分布也发生改变。进一步对酶活及代谢产物分析表明：Escherichia coli NZN111(sfcA)厌氧发酵过程中,磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(PCK)是产丁二酸的关键酶,丙酮酸激酶(PYK)主要和副产物丙酮酸的积累有关,异柠檬酸裂解酶(ICL)对丁二酸产量也有一定影响。好氧培养基中添加80mmol/L乙酸钠,厌氧发酵结束时丁二酸的质量收率可达89.0%,相比对照提高了16.6%。     

外源添加代谢中间体对产琥珀酸放线杆菌厌氧发酵制备丁二酸的影响

考察了外源添加中间代谢产物对菌体生长及发酵产酸的影响,结果表明添加0.5g/L磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)时丁二酸产量最高。围绕产琥珀酸放线杆菌NJ113厌氧发酵产丁二酸的代谢网络进行代谢通量分析,发现添加PEP后己糖磷酸途径(HMP)与糖酵解途径(EMP)的通量比由39.4∶60.3提高至76.8∶22.6,解决了丁二酸合成过程中还原力不足的矛盾,导致PEP生成草酰乙酸的通量提高了23.8%,丁二酸代谢通量从99.8mmol/(gDCW·h)增至124.4mmol/(gDCW·h),而副产物乙酸及甲酸的代谢通量分别降低了22.9%、15.4%;关键酶活分析结果表明,添加0.5g/LPEP后PEP羧化激酶比酶活达到1910U/mg,与对照相比提高了74.7%,而丙酮酸激酶的比酶活降低了67.5%。最终丁二酸浓度为29.1g/L,收率达到76.2%,比未添加PEP时提高了11.0%。     

过量表达异柠檬酸裂解酶对ldh-1谷氨酸棒状杆菌产丁二酸的影响

谷氨酸棒状杆菌SA001是缺失了乳酸脱氢酶基因 (ldhA) 的菌株。为了增加厌氧条件下经异柠檬酸到丁二酸的代谢通量,以提高丁二酸的产量。将来自大肠杆菌Escherichia coli K12的异柠檬酸裂解酶基因导入谷氨酸棒状杆菌SA001 (SA001/pXMJ19-aceA) 中。该菌经0.8 mmol/L的IPTG有氧诱导12 h后,转入厌氧发酵16 h,丁二酸的产量为10.38 g/L,丁二酸的生产强度为0.83 g/(L·h)。与出发菌株比较,异柠檬酸裂解酶的酶活提高了5.8倍,丁二酸的产量提高了48%。结果表明过量表达异柠檬酸裂解酶可以增加由乙醛酸途径流向丁二酸的代谢流。     

代谢工程改造大肠杆菌合成丁二酸及发酵罐放大工艺

【背景】Escherichia coli AFP111发酵生产丁二酸时大量副产乙酸,丁二酸得率低。【目的】代谢工程改造EscherichiacoliAFP111,提高丁二酸得率,降低副产物乙酸的生成,建立100 L规模的丁二酸发酵工艺。【方法】一步同源重组敲除乙酸合成途径关键酶基因,改造丁二酸合成途径关键酶启动子实现过表达;单因素优化5L发酵罐培养条件。【结果】敲除乙酸产生途径编码乙酸激酶和磷酸转乙酰酶的基因ackA-pta、苏氨酸脱羧酶和2-酮丁酸甲酸裂解酶的基因tdcDE获得SX02菌株,摇瓶发酵条件下其乙酸产量下降了53.42%,丁二酸得率提高9.85%。在SX02菌株基础上,经启动子改造过表达编码葡萄糖激酶的基因glk后获得菌株SX03,其Glk酶活性提高3.66倍,乙酸产量下降了31.62%,丁二酸得率提高8.28%。SX03菌株发酵生产丁二酸在5 L发酵罐进行放大,其乙酸产量为3.97 g/L,丁二酸得率为1.62 mol/mol葡萄糖,相比出发菌株的乙酸产量下降了75.76%,丁二酸得率提高19.12%。在5L发酵罐上对比研究了中和剂Na2CO3和NaOH混合液替换碱式MgCO3的发酵效果,并优化了发酵pH、搅拌转速和葡萄糖浓度,获得如下最适发酵条件:pH6.8,搅拌转速250r/min,葡萄糖100g/L,发酵结束时乙酸产量为2.24 g/L,丁二酸得率为1.66 mol/mol葡萄糖。中和剂替换优化后乙酸产量下降了20.65%,丁二酸得率提高2.47%。菌株SX03发酵工艺进一步在100 L发酵罐上实现放大,其乙酸产量为1.91 g/L,丁二酸得率为1.30 mol/mol葡萄糖。【结论】通过代谢工程改造的大肠杆菌,其副产物乙酸含量显著下降,丁二酸得率提高,并在5 L和100 L发酵罐上实现了工艺放大,展现出较大的工业化利用潜力。     

Effect of carbon sources differing in oxidation state and transport route on succinate production in metabolically engineered Escherichia coli

In mixed-acid fermentation, succinate synthesis requires one mole of phosphoenolpyruvate (PEP), one mole of CO₂, and two moles of NADH for every mole of succinate to be formed. Different carbon sources with different properties were used to address these requirements. Sorbitol generates one more mole of NADH than glucose. Fermentation of sorbitol was shown in this study (and by others) to produce significantly more succinate than fermentation of glucose, due to increased NADH availability. Xylose fermentation conserves the intracellular PEP pool, since its transport does not require the phosphotransferase system normally used for glucose transport. The extra PEP can then be assimilated in the succinate pathway to improve production. In this study, fermentation of xylose did yield higher succinate production than glucose fermentation. Subsequent inactivation of the acetate and lactate pathways was performed to study metabolite redistribution and the effect on succinate production. With the acetate pathway inactivated, significant carbon flux shifted toward lactate rather than succinate. When both acetate and lactate pathways were inactivated, succinate yield ultimately increased with a concomitant increase in ethanol yield.     

Homolactate fermentation by metabolically engineered Escherichia coli strains

We report the homofermentative production of lactate in Escherichia coli strains containing mutations in the aceEF, pfl, poxB, and pps genes, which encode the pyruvate dehydrogenase complex, pyruvate formate lyase, pyruvate oxidase, and phosphoenolpyruvate synthase, respectively. The process uses a defined medium and two distinct fermentation phases: aerobic growth to an optical density of about 30, followed by nongrowth, anaerobic production. Strain YYC202 (aceEF pfl poxB pps) generated 90 g/liter lactate in 16 h during the anaerobic phase (with a yield of 0.95 g/g and a productivity of 5.6 g/liter . h). Ca(OH)(2) was found to be superior to NaOH for pH control, and interestingly, significant succinate also accumulated (over 7 g/liter) despite the use of N(2) for maintaining anaerobic conditions. Strain ALS961 (YYC202 ppc) prevented succinate accumulation, but growth was very poor. Strain ALS974 (YYC202 frdABCD) reduced succinate formation by 70% to less than 3 g/liter. (13)C nuclear magnetic resonance analysis using uniformly labeled acetate demonstrated that succinate formation by ALS974 was biochemically derived from acetate in the medium. The absence of uniformly labeled succinate, however, demonstrated that glyoxylate did not reenter the tricarboxylic acid cycle via oxaloacetate. By minimizing the residual acetate at the time that the production phase commenced, the process with ALS974 achieved 138 g/liter lactate (1.55 M, 97% of the carbon products), with a yield of 0.99 g/g and a productivity of 6.3 g/liter . h during the anaerobic phase.     

产丁二酸工程菌的构建及其厌氧发酵

为了考察过量表达苹果酸酶对于E.coli NZN111(ldhA::Kan pfl::Cam)厌氧发酵产丁二酸的影响, 将连接有苹果酸酶基因sfcA的表达载体pTrc99a-sfcA转化进NZN111中, 构建了重组NZN111(pTrc99a-sfcA)。0.5 mmol/L IPTG诱导8 h后, 测定的苹果酸酶比酶活为30.67 u/mg, 比受体菌提高了140倍。采用两阶段发酵模式, 结果表明: 过量表达的苹果酸酶在NZN111体内催化了从丙酮酸到苹果酸的逆向反应, 丁二酸是发酵过程中积累的主要有机酸, 且当加入0.7 mmol/L IPTG诱导, 初始葡萄糖糖浓度为18.5 g/L时, 选择对数生长期后期的菌种以10%的接种量转入厌氧发酵, 发酵结束时发酵液中丁二酸的浓度为12.84 g/L, 对葡萄糖的收率为69.43%, 乙酸为0.58 g/L, 二者浓度比为22:1, 没有检测到甲酸和乳酸。构建的菌种具有高产丁二酸和副产物极少的优点, 在同类菌种中处于先进水平。     

选育耐受复合抑制剂酿酒酵母提高乙醇产量

能够耐受纤维素预处理中抑制剂的酿酒酵母对高效、经济生产纤维素乙醇至关重要。利用诱变结合驯化工程选育了一株可耐受复合抑制剂(1.3g/L糠醛、5.3g/L乙酸及1.0g/L苯酚)的工业酿酒酵母YYJ003。在pH 4.0的含有抑制剂的培养基中,耐受菌株乙醇产率是原始菌株的7.8倍,糠醛转化速率提高了5倍。在pH 5.5的复合抑制剂条件下,YYJ003发酵时间(16h)比野生菌株发酵时间(22h)缩短6h。在pH 4.0的未脱毒的玉米秸秆水热法预处理水解液中YYJ003的乙醇产率达到0.50g/g(乙醇/葡萄糖),乙醇产速达到4.16g/(L·h),而对照菌株无乙醇产出。