三疣梭子蟹NF-κB家族基因Relish和Dorsal的克隆及表达特征

为研究Relish和Dorsal在三疣梭子蟹免疫过程中所起到的作用, 研究利用RACE技术克隆获得三疣梭子蟹Relish(Pt-Rel)、Dorsal基因(Pt-Dor) cDNA全长, 并通过实时荧光定量PCR技术分析了Pt-Rel和Pt-Dor基因在健康蟹不同组织及其原代培养的血淋巴细胞在感染不同微生物后的表达情况。结果显示, Pt-Rel cDNA长3254 bp, ORF长2949 bp, 编码983个氨基酸, Pt-Dor cDNA长2348 bp, ORF长1911 bp, 编码637个氨基酸; 蛋白结构预测分析发现Pt-Rel和Pt-Dor均包含RHD (Rel homology domain)及IPT (Immunoglobulin-like fold, Plexins, TranscriPtion factors)Rel/NF-κB家族蛋白经典结构域。Pt-Rel和Pt-Dor与其他节肢动物Relish、Dorsal氨基酸序列具有很高的相似性; 在系统进化分析中Pt-Rel和Pt-Dor分别与中华绒螯蟹等甲壳动物的Relish、Dorsal聚在一支, 而昆虫类聚在另一支。Pt-Rel和Pt-Dor在检测的6种组织中均有表达, 且2个基因均在血淋巴细胞中表达量最高。蟹血淋巴细胞体外感染实验结果表明, 不同病原微生物对2个基因表达的影响非常相似, 假丝酵母在2h明显诱导了Pt-Rel和Pt-Dor基因的表达, 而金黄色葡萄球菌及溶藻弧菌在感染4h后使Pt-Rel和Pt-Dor基因的表达显著上调。上述研究结果表明Pt-Rel和Pt-Dor基因很有可能参与了三疣梭子蟹的抗感染免疫过程。     

三疣梭子蟹蜕皮抑制激素cDNA的克隆与序列分析

甲壳动物的蜕皮是由位于头胸部前鳃腔的一对Y-器通过分泌蜕皮激素（Molting hormone）来控制的（Lachaise et al．,1993）,而蜕皮激素的分泌又受到蜕皮抑制激素（Molt-inhibiting hormone,MIH）的调控（Watson et al．,2001）。MIH和性腺抑制激素（Gonad-inhibiting hormone,GIH）、甲壳动物高血糖激素（Crustacean hyperglycemic hormone,CHH）、     

三疣梭子蟹HMGBa基因克隆及其应答不同病原入侵的表达特征

为研究三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)高迁移率族蛋白B (High-mobility group box protein, HMGB)在其先天免疫中发挥的功能, 利用RACE技术首次克隆得到了三疣梭子蟹HMGBa基因, 命名为PtHMGBa。其cDNA序列全长1030 bp, 其中5′端非编码区(UTR)为94 bp, 3′端非编码区(UTR)为255 bp, 开放阅读框(ORF)为681 bp, 编码一个含有227个氨基酸, 分子量25.82 kD, 理论等电点为5.94的蛋白质。PtHMGBa蛋白包含2个HMG盒结构域和一个酸性尾部结构域。分析表明, 三疣梭子蟹HMGBa氨基酸序列与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei) HMGBa相似度最高。实时荧光定量PCR结果显示, PtHMGBa基因在血细胞和肝胰腺的表达量最高, 在眼柄中表达量最低。在副溶血弧菌和WSSV感染过程中, PtHMGBa基因在肝胰腺和血细胞中均出现了表达上调。其中, 经副溶血弧菌感染后, 该基因在上述2种组织中分别于48h和6h达到表达量的峰值; 经WSSV感染后, 该基因在2种组织中均在12h达到表达量的峰值。结果表明PtHMGBa基因参与了三疣梭子蟹抵御外来病原的免疫响应, 研究为深入开展三疣梭子蟹和其他甲壳动物的免疫调控机理提供了科学依据。     

三疣梭子蟹UHRF1基因在胚胎、幼体和性腺发育过程中的表达分析

为探讨泛素样含PHD和环指域蛋白1(UHRF1)基因在三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)发育过程中的作用, 实验采用SMART RACE方法, 克隆了三疣梭子蟹UHRF1(PtUHRF1)基因。该基因cDNA全长为2849 bp, 开放阅读框(ORF)为2298 bp, 预测其编码1个含有765个氨基酸的蛋白质。结构域分析显示, 该蛋白质包含UBL、PHD、TTD、SRA、RING finger 5个功能结构域。同源分析表明, 三疣梭子蟹PtUHRF1的氨基酸序列与其他物种有较高的同源性。qRT-PCR结果显示, PtUHRF1基因在三疣梭子蟹所有组织中均有表达, 但在精巢中表达量显著高于其他组织。该基因在胚胎和幼体发育不同时期表达差异显著, 在受精卵中的表达量最高, 并显著高于胚胎发育其他时期, 是多细胞时期表达量的2.5倍。PtUHRF1基因在性腺发育不同时期表达存在显著差异, 在卵巢II期表达量达到峰值, 之后逐渐下降; 在精巢Ⅰ期的表达量最高, 随着精巢发育逐渐下降。实验结果表明, PtUHRF1参与了三疣梭子蟹胚胎、幼体和性腺发育调控, 为进一步深入研究该基因在三疣梭子蟹及甲壳动物生长发育中的作用提供参考。     

三疣梭子蟹胚胎发育早期的组织学研究

对三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus)胚胎发育早期（卵裂至原肠胚期）进行了组织学观察。结果发现：卵排至体外约５２h后开始卵裂,卵裂方式为表面卵裂,卵裂至２５６细胞时,胚胎发育进行了囊胚期。囊胚为实囊胚,囊胚后期,１６个排成例嗽叭形的预定内胚层细胞与聚在其附近的其他细胞一起内陷形成原肠。预定内胚层细胞脱离原肠后,进行１次切向分裂,形成卵黄细胞和内胚层细胞,与此同时,胚工细胞不断分裂,产生视叶原基和胸腹原基,不久,２个胞腹原基逐渐愈合形成胸腹突。随胚胎发育,在似桥细胞带上出现大颚原基、大触角原基,随后大大触角原基与视叶原基之间的腹中线上发生口凹,在小触角原基产生后,胚肥发育进入卵内无节幼体期。     

三疣梭子蟹卵子发生的研究

１９８９年９月－１９９１年１月、作者利用透射电镜在超微结构水平研究了浙江舟山沿海的三疣梭蟹的卵子发生过程。实验结果得自于１２次取得的１５０号样品。根据核和胞质的变化我们把该蟹的卵子发生分为五期；卵原细胞分裂转化为卵原细胞；卵母细胞发育早期；卵母细胞发育中期；卵母细胞发育晚期；卵子形成期。     

三疣梭子蟹不同组织同工酶的分析

采用垂直板状聚丙烯酰胺凝胶电泳技术 ,分析了三疣梭子蟹 (Portunustriuberbuculatus)雌性成体心脏、鳃、肌肉、眼睛、肝胰腺和卵巢 6种组织中的 1 0种同工酶 (ADH、MDH、ME、LDH、α AMY、GDH、SOD、SDH、EST和GOT)的分化表达模式 ,并对各种酶的同工酶位点表达及酶谱表型进行了分析。结果显示 ,三疣梭子蟹的同工酶系统具有明显的组织特异性。     

三疣梭子蟹脂多糖-β-1,3-葡聚糖结合蛋白基因的克隆及表达模式分析

脂多糖-β-1,3-葡聚糖结合蛋白(LGBP)作为一种模式识别受体在甲壳动物的先天免疫中占有重要地位。利用SMART RACE技术,从三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)血细胞中克隆得到一条LGBP基因。该基因cDNA序列全长为1378bp,包括1095bp的开放阅读框(ORF),共编码365个氨基酸,在基因的5'端还含有138bp的非编码区(UTR),3'端含有144bp的UTR。预测的成熟肽相对分子质量为39825.24k,等电点为4.49。同时,用生物信息学方法对该基因的序列和二级结构进行了初步分析。RT-PCR结果显示:LGBP基因在被检测的组织,包括血细胞、肝胰腺、心脏、鳃和肌肉中都有表达。用金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)和溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)刺激三疣梭子蟹后,发现在实验48h内,混合细菌刺激组血细胞中LGBP基因的表达量明显高于生理盐水对照组,推测该基因在抵抗细菌感染的免疫过程中发挥着积极的作用。     

三疣梭子蟹胚胎发育过程中消化系统的发生和发育

对三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus)不同发育阶段的胚胎进行连续组织切片,以揭示其消化系统的发生和发育。结果显示前肠,中肠和后肠皆发生于原肠胚期,前肠在第1期卵内蚤状幼体阶段发育成胃与食道,胃开口于卵黄囊,后肠肠上皮细胞在第1,2期卵内无节幼体阶段尚未形成有序排列,至第1期卵内蚤状幼体时始形成后肠腔,到第2期卵蚤状幼体时与中有肠连接,中肠在第2期卵内蚤状幼体阶段发育成杯状结构,孵化前与前肠贯通,形成完整的消化系统。     

三疣梭子蟹的第二次卵巢发育规律

2005年3-5月,在室内养殖条件下对第二次卵巢发育的三疣梭子蟹进行连续采样,系统研究了其第二次卵巢发育期间的卵巢指数(GSI)、肝胰腺指数(HSI)、卵巢外部特征、卵巢发育分期及其组织学变化.结果表明:①三疣梭子蟹第二次卵巢发育过程可以分为4期,Ⅰ期卵巢为乳白色或者淡黄色细带状,卵巢中主要为卵黄合成期的卵母细胞和内源性卵黄合成前卵母细胞;Ⅱ期为淡黄色或橘黄色,主要为外源性卵黄合成期的卵母细胞;Ⅲ期卵巢为橘红色,主要为外源性卵黄合成期的卵母细胞和近成熟期的卵母细胞;Ⅳ期卵巢发育基本成熟,肉眼可见卵粒,主要为成熟期的卵母细胞;②三疣梭子蟹第二次卵巢发育期间,GSI显著增加,HSI变化不显著,GSI和发育天数呈显著正相关性,HSI和GSI的变化没有显著的相关性.     

池塘养殖三疣梭子蟹雄体生长和性腺发育规律

池塘养殖是三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)的主要养殖方式,但关于池塘养殖三疣梭子蟹雄体的生长和性腺发育规律尚不清楚。本研究通过定点连续采样,首先系统研究池塘养殖过程中三疣梭子蟹雄体的生长和成熟雄体生殖系统的外观及组成的变化,其次研究池塘养殖三疣梭子蟹雄体性腺发育过程中性腺各部分组织学特征及其指数的变化,以及不同月份雄体性腺发育的情况和比例。结果表明:(1)三疣梭子蟹雄体的体重和壳宽增长率及特定增长率均在8月份最高,且体重与壳宽呈显著正相关关系。(2)三疣梭子蟹成熟雄体的生殖系统由体外(阴茎、交接器)和体内(精巢、输精管)两部分构成。(3)根据精巢和输精管的外观、组织学特征及其指数的变化,可将三疣梭子蟹雄体性腺发育分为3期。精子发生期,即精巢内主要细胞类型是精原细胞和初级精母细胞,精巢指数为0.07%～0.16%,此时输精管呈透明状,肉眼很难发现;精荚形成期,精巢内主要细胞类型为次级精母细胞和精子细胞,精巢指数为0.10%～0.51%,输精管内有大量精荚和分泌物,输精管指数为0.01%～0.41%;成熟期,精巢内主要细胞类型是精子细胞和成熟精子,精巢指数为0.10%～0.41%,输精管进一步膨大,输精管指数为0.20%～0.65%。(4)在雄体性腺发育期间,性腺指数和输精管指数呈显著上升趋势,而精巢指数呈现先上升后下降的趋势,且统计分析发现性腺指数与肝胰腺指数无明显的相关性。(5)池塘养殖雄体性腺发育不同步,7月份主要处于精子发生期,8月底,有76%的雄体性腺发育达到精荚形成期,至9月底,达到成熟期雄体的比例为47%,此后雄体性腺发育趋于成熟,10月中下旬至12月份池塘养殖雄体均主要处于成熟期。     

室内养殖条件下三疣梭子蟹的生殖蜕壳和交配行为

本文采用外部特征观察和红外线摄像,对室内配对养殖三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)的生殖蜕壳和交配行为进行了系统研究。结果发现:近交配季节,雌性三疣梭子蟹腹甲出现蓝黑色并不断加深,游泳足掌节则最终汇聚成一轮红色月牙,这些体表特征集中出现在生殖蜕壳前期,可能是除信息素外,另一类用于交配活动的视觉信号。三疣梭子蟹的交配活动起始于两性间的求偶抱对行为,雌性完成生殖蜕壳便进行软壳交配,这是一个连续的过程,包括随后的抱对守护行为;期间,相对于交配前后的抱对行为,三疣梭子蟹用于实质性交配活动的时间十分有限。然而,这可能是一种生殖策略:一方面,雌性可以采用抱对这种方式确保随后进行的生殖蜕壳及软壳交配过程能在有限的时间内安全有序地完成;另一方面,作为补偿,雄性可通过交配活动在雌性生殖道内生成精子塞来保证父权,减少个体间的竞争。     

三疣梭子蟹胚胎发育过程中肝胰腺的发生与卵黄物质利用的关系

通过对三疣梭子蟹胚胎进行连续采样和组织切片,系统研究了三疣梭子蟹胚胎发育过程中卵黄囊和肝胰腺的发生与卵黄物质利用的关系。结果表明:(1)三疣梭子蟹胚胎的卵黄岛和卵黄囊结构分别出现在原肠期和无节幼体期,胚胎从原肠期至卵内第一期溞状幼体期,始终存在卵黄岛结构,且卵黄岛中的卵黄物质不断被分解和利用. (2)卵内第二期溞状幼体后,卵黄囊分为两个区域,卵黄囊壁中出现肝胰腺细胞(柱状上皮细胞),此时肝胰腺前体已开始形成,卵黄岛开始融合. (3)卵内第三期溞状幼体阶段,卵黄囊发育成一双肝胰腺,由于肝胰腺中的卵黄物质互相融合,卵黄岛结构消失。此阶段胚胎对卵黄物质的利用加快, 卵黄物质中存在许多空泡状结构;(4)胚胎发育进入孵化前期后,肝胰腺腔内的卵黄物质极少,而初孵溞状幼体肝胰腺腔内卵黄物质已完全消失,肝胰腺为一对囊状结构。这些结果表明在三疣梭子蟹胚胎发育从原肠期到孵化前的过程中,卵黄岛和肝胰腺细胞对于卵黄物质分解和利用起着十分重要的作用。     

油菜profilin基因的克隆和表达分析

profilin是高等植物中的一种与肌动蛋白结合的蛋白,采用RT-PCR技术克隆了油菜（Brassica napus L.cv.canadian tween)花粉中的一个369bp的cDNA片段,序列分析结果表明,该cDNA与已报道的其他植物的profilin基因具有较高核酸序列同源性,与玉米（Zea maysL.)基因同源性为82%,拟南芥（Arabidopsis)基因同源性为85%,水稻（Oryza sativa L.)基因同源性为81%,烟草（Nicotiana tabacum L.)基因同源性为82%,结论5′RACE和3′RACE技术,获得了全长cDNA,其为672bp。该cDNA包含一个开放密码框。5′未翻译区和一个带有Poly(A)的3′区域。Northern杂交结果显示它主要在花粉和花药中表达。     

三疣梭子蟹胚胎发育过程中生殖腺的形态

对三疣梭子蟹胚胎切片做显微观察,至第二期卵内涵状幼体阶段才见形态结构明显的生殖腺。其外观囊状,内部具空腔,细胞排列成管状,开口于胚胎表面。左右两个生殖腺以管状结构相连。     

蟹板茗荷在三疣梭子蟹体上的附着定向及种群变动

研究蟹板茗荷在三疣梭子蟹鳃及口肢上的定向、附着和种群特征 ,结果显示蟹板茗荷主要附着在三疣梭子蟹鳃的腹面 ,占 67.86% ,以在第五对鳃上的附着量最大。位于鳃腹面的蟹板茗荷主要以 0°方式定向 ,鳃背面的蟹板茗荷则主要以± 90°方式定向 ,鳃室壁上的蟹板茗荷主要以 0°方式定向。蟹板茗荷在不同的附着部位形态上有差异 ,口肢上的个体柄短、壳板厚而硬 ,鳃室里的柄长、壳板薄而软。附着于三疣梭子蟹鳃及口肢上的蟹板茗荷 ,其种群年龄结构和数量组成有明显的季节变化。     

中国红豆杉紫杉烯合酶cDNA的分离、表达和鉴定

紫杉烯合酶是一种二萜环化酶,催化牛儿基牛儿基焦磷酸形成紫杉醇生物合成过程中的中间体紫杉烯.利用PCR扩增同源探针筛选cDNA文库,克隆了一个编码中国红豆杉(Taxus chinensis (Pilg.) Rehd.)紫杉烯合酶3′端的2 151 bp的cDNA片段,也通过PCR扩增得到了该基因5′端的611 bp的cDNA片段,将这两个cDNA片段拼接在一起,得到长2 712 bp的cDNA片段,具有一个2 586个碱基的开放阅读框架(ORF),编码包括质体转移肽在内的共862个氨基酸残基;该酶与太平洋红豆杉紫杉烯合酶有97%的同源性(identity),与其他植物萜类环化酶也有较高的同源性.利用融合表达载体pET-32a在大肠杆菌BL21trxB中表达,所表达的融合蛋白以包含体形式存在.包含体经过变性、复性和再折叠,利用His残基亲和凝胶柱层析得到融合的紫杉烯合酶.用毛细管气相色谱-质谱联用对酶促反应产物进行分析,结果表明,融合的紫杉烯合酶能催化产生4(5),11(12)-紫杉烯.