哈维氏弧菌胞外蛋白酶基因的克隆表达及免疫原性

根据实验室分离的大黄鱼弧菌病主要病原菌哈维氏弧菌(Vib rio harveyi)GYC1108-1株的胞外蛋白酶基因序列,设计胞外蛋白酶基因(ΔProA)特异性引物,扩增获得1552bp的ΔProA基因,克隆于pUC57-T载体;将ΔProA基因亚克隆到原核表达载体pET-28a进行融合表达,SDS-PAGE电泳检测发现,ΔProA融合蛋白经IPTG诱导后在大肠杆菌中以包涵体形式表达,分子量大小约55kD,诱导5h的表达蛋白产量约占细菌总蛋白的21%。Western blot分析,表达的55kD蛋白具有较高免疫原性。用纯化的ΔProA融合蛋白对大黄鱼进行免疫试验,结果免疫保护率达到75%。       

两株致病性哈维氏弧菌胞外产物的特性分析

采用硫酸铵分级盐析从哈维氏弧菌EcGY020401株和SpGY020601株培养物中提取其胞外产物,并对胞外产物的一些特性进行了分析。结果表明,两株哈维氏弧菌的胞外产物均具有较强的毒力,对鲫鱼的半致死剂量LJ50为7．1g蛋白／g鱼体重;均具有淀粉酶、酪蛋白酶、脂肪酶活性,而无脲酶和明胶酶活性;除EcGY020401株胞外产物对斜带石斑（Epinephelus coioides）红细胞有较强溶血作用外,对小鼠、鲫、人O型血等红细胞的溶血性都较弱或无;对草鱼吻端成纤维细胞（PSF）都具有细胞毒性。此外,经聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶柱层析和离子交换柱层析,对SpGY020601株的胞外产物中蛋白酶进行了初步提纯,SDS-PAGE分析得一分子量约为38Kda的蛋白酶,该蛋白酶对鲫鱼有致死毒性,半致死剂量为3．3g蛋白／g鱼体重。     

两株致病性哈维氏弧菌胞外产物的特性分析

采用硫酸铵分级盐析从哈维氏弧菌EcGY020401株和SpGY020601株培养物中提取其胞外产物,并对胞外产物的一些特性进行了分析。结果表明,两株哈维氏弧菌的胞外产物均具有较强的毒力,对鲫鱼的半致死剂量LD50为7.1g蛋白/g鱼体重;均具有淀粉酶、酪蛋白酶、脂肪酶活性,而无脲酶和明胶酶活性;除EcGY020401株胞外产物对斜带石斑(Epinephelus coioides)红细胞有较强溶血作用外,对小鼠、鲫、人O型血等红细胞的溶血性都较弱或无;对草鱼吻端成纤维细胞(PSF)都具有细胞毒性。此外,经聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶柱层析和离子交换柱层析,对Sp-GY020601株的胞外产物中蛋白酶进行了初步提纯,SDS-PAGE分析得一分子量约为38Kda的蛋白酶,该蛋白酶对鲫鱼有致死毒性,半致死剂量为3.3g蛋白/g鱼体重。     

大黄鱼细菌性病原哈维氏弧菌培养特性的研究

弧菌是危害水产养殖动物的最为严重的病原之一.从患病大黄鱼肝脏分离致病的细菌哈维氏弧菌GYC1108-1为材料,对哈维氏弧菌GYC1108-1株的最佳生长条件及培养基优化进行了测定.综合考察不同的培养温度、培养时间、培养基盐度、培养基的pH值对细菌生长的影响,并采用正交实验法,对培养基配方进行优化.结果表明:不同的培养温度、培养时间、培养基盐度、培养基pH值等均会影响细菌的产量.GYC1108-1适宜生长的盐度为1%-5%、pH为5～9.5、温度为15～35℃、在培养基中添加硫酸铜、硫酸氨会明显促进生长;最佳培养条件及培养基成份为:NaCl 2%,pH8.0,温度30℃,蛋白胨1.0%、牛肉膏0.75%、CuSO4 0.3mg/L、(NH4)2SO4 0.1g/L.     

鳗弧菌胞外金属蛋白酶的化学修饰研究

用DEPC、EDC、DTNB、PMSF等8种化学修饰剂对鳗弧菌胞外金属蛋白酶进行了化学修饰。结果表明化学修饰后酶的活力发生了改变,其中组氨酸、酸性氨基酸、半胱氨酸残基的化学修饰引起酶活性的明显降低,说明组氨酸残基、酸性氨基酸、半胱氨酸残基及其二硫键在维持酶活力中发挥重要作用,是酶活力所必需;而对精氨酸、丝氨酸、ε-氨基等修饰后酶活性影响较小,表明不是酶的活性所必须的基团。     

大黄鱼病原哈维氏弧菌单克隆抗体的制备及其应用

用甲醛灭活哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）GYC1108-1制备免疫原免疫8周龄雌性BALB/c小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术,用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）对杂交瘤进行筛选,阳性克隆经2－3次亚克隆后,共获得5株针对GYC1108-1的单克隆抗体。选取1B7制备小鼠腹水抗体,其细胞上清及腹水效价分别为1∶3200和1∶32000。同样用灭活的哈维氏弧菌免疫新西兰大白兔,5次免疫后颈动脉采血,离心取血清,并用饱和硫酸铵法进行纯化,制备了兔抗哈维氏弧菌多克隆抗体,其ELISA效价为1∶51200。利用1B7单克隆抗体和兔抗哈维氏弧菌多克隆抗体以及山羊抗小鼠HRP酶标二抗,建立了检测哈维氏弧菌的三抗体夹心酶联免疫吸附试验（TAS-ELISA）方法。该方法对哈维氏弧菌的最小检出浓度为1×104个/mL。用该TAS-ELISA方法检测大黄鱼（Pseudosciaena crocea）样品,54尾患病大黄鱼中有45尾检出哈维氏弧菌,而14尾健康大黄鱼都没有检出哈维氏弧菌。由此可见,本试验建立的TAS-ELISA方法,可以用于患病大黄鱼哈维氏弧菌的快速诊断。     

粘质赛氏菌胞外蛋白酶的化学修饰

用九种化学修饰剂研究了粘质赛氏菌Ｓｅｒｒａｔｉａ Ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ４１００３（２）胞外蛋白酶分子中氨基酸侧链基团与酶催化活性的关系,结果表明组氨酸、丝氨酸、赖氨酸、精氨酸、谷氨酸及天冬氨酸等残苈与酸活性无关;半胱拟定酸箕与酶活性 直接关系;而酪氨酸和色氨酸残基侧链的修饰引起酶活力大幅度下降,说明酪氨酸和色氨酸残基为酶活力必需。     

粘质赛氏菌胞外蛋白酶的化学修饰

用九种化学修饰剂研究了粘质赛氏菌ＳｅｒｒａｔｉａＭａｒｃｅｓｃｅｎｓ４１００３（２）胞外蛋白酶分子中氨基酸侧链基团与酶催化活性的关系,结果表明组氨酸、丝氨酸、赖氨酸、精氨酸、谷氨酸及天冬氨酸等残基与酶活性无关;半胱氨酸残基与酶活性也无直接关系;而酪氨酸和色氨酸残基侧链的修饰引起酶活力大幅度下降,说明酪氨酸和色氨酸残基为酶活力必需．     

鮸鱼弧菌病病原菌(哈维氏弧菌)的分离与鉴定

【目的】2009年春季,浙江省舟山地区养殖鮸鱼暴发弧菌病。症状主要表现为体表病灶部位出血、肌肉溃烂、内脏器官有白斑等。【方法】从病鱼体表溃疡部位及内脏分离出优势菌株090212,经人工感染证实该菌即为致病菌。通过API系统和菌体常规形态特征、培养特性和生理生化反应指标测定以及16S rRNA测序分析等综合鉴定,【结果】确认090212为哈维氏弧菌(Vibrio harveyi),该菌为革兰氏阴性,菌体呈短杆状,极生单鞭毛。该菌对氟苯尼考、四环素等5种抗生素敏感。【结论】哈维氏弧菌是海水养殖鱼类的常见致病菌,但作为养殖鮸鱼的病原菌尚属首次报道,将对鮸鱼的病害防治和健康养殖具有重要的指导意义。     

黄芩乙醇提取物通过下调NAD特异的谷氨酸脱氢酶抑制哈维氏弧菌生长

哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）是水产动物的常见致病菌,对人类健康和水产经济带来巨大威胁。抗生素的滥用使得药物残留和耐药性问题变得日益严重。因此,迫切需要寻找新型、不易产生耐药性和低毒的抗菌物质。本文研究黄芩醇提物对哈维氏弧菌的抑制作用及抑菌机制。实验结果表明,黄芩醇提物对哈维氏弧菌的抑菌圈为18.33±0.58 mm,最低抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）分别为7.92 mg/mL和15.84 mg/mL。经分析型扫描电镜（SEM）观察和细菌胞内外蛋白质浓度测定,发现实验组菌体表面虽有细小破裂,但形态依然完整,表面光滑,菌体细胞膜仍保持相对完整性;通过SDS-PAGE、蛋白质质谱(MALDI-TOF-TOF MS)和实时荧光定量PCR分析,显示黄芩醇提物抑制哈维氏弧菌体内NAD特异性的谷氨酸脱氢酶（NAD-specific glutamate dehydrogenase, NAD-GDH）及其mRNA的表达。本研究表明,黄芩醇提物通过下调NAD特异性的谷氨酸脱氢酶表达而抑制哈维氏弧菌的生长,为中药应用于水产养殖提供了新的证据。     

人丝氨酸蛋白酶抑制因子Hespintor的基因克隆与序列分析

目的:克隆得到人丝氨酸蛋白酶抑制因子Hespintor基因,并应用生物信息学方法进行序列分析。方法:提取HepG2细胞总RNA,RT-PCR扩增Hespintor基因片段,连接至pMD 20-T克隆载体中,转化JM109宿主菌,蓝白斑法筛选阳性克隆菌落,菌落PCR及测序鉴定。利用在线工具软件对Hespintor进行信号肽预测、亚细胞定位、结构域、三级结构、基因染色体定位及组织分布表达分析。结果:人丝氨酸蛋白酶抑制因子Hespintor基因全长285bp,共编码94aa,其中1-23aa编码信号肽,符合亚细胞定位于细胞外的预测;53-93aa编码一个典型的Kazal结构域。Hespintor基因的染色体定位于5号染色体短臂3区3带1亚带(5q33.1);正常组织中仅在睾丸有表达,而肿瘤组织中仅在生殖细胞瘤有表达。结论:Hespintor是一个在机体中静止表达的Ka-zal型丝氨酸蛋白酶抑制因子家族的分泌型新成员。     

哈氏弧菌谷胱甘肽还原酶基因克隆及原核表达

经克隆哈氏弧菌谷胱甘肽还原酶(GR)基因,并构建其原核表达载体,以获得相应的表达蛋白。将GR和p ET-32a(+)通过Bam H I和Xho I双酶切后,体外用T4连接酶连接,构建重组质粒p ET-GR;然后转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,应用SDS-PAGE分析表达情况和表达条件。SDS-PAGE电泳获得分子量约为68.9 k D融合蛋白条带。在E.coli BL21(DE3)中重组质粒p ET-GR的表达条件为28℃,0.7 mmol/L的IPTG浓度诱导4 h表达量最高,且主要以包涵体形式表达。哈氏弧菌谷胱甘肽还原酶基因在大肠杆菌中获得了高效表达。     

哈氏弧菌dam基因的克隆与分析

利用兼并PCR的方法克隆得到哈氏弧菌T4的DNA腺嘌呤甲基化酶(dam)基因,序列分析表明该基因编码279个氨基酸,与其它已知弧菌的Dam具有较高的同源性,其中与副溶血弧菌Dam的相同性达95%。功能检验表明所克隆的dam基因在大肠杆菌中具有DNA腺嘌呤甲基化酶活性,能够甲基化大肠杆菌染色体DNA GATC序列中的腺嘌呤。运用染色体步移法获得dam基因上游的3251 bp DNA,发现该区域含有3个基因,其与dam在染色体上的相对排列顺序为:莽草酸激酶-脱氢奎尼酸合成酶-damX-dam。对dam上游DNA序列研究发现位于翻译起点ATG上游的78bp、112bp和477bpDNA片段皆具有启动子活性,但前者的活性明显高于后二者。     

木瓜凝乳酶基因的克隆及序列分析

通过设计一对特异性的引物,采用RT－PCR方法从未成熟的木瓜组织中扩增得到木瓜凝乳酶基因,并将其重组到pPIC9K载体中,转化大肠杆菌并筛选阳性克隆,序列测定并利用BLAST软件进行核酸及氨基酸序列相似性分析,结果表明：通过序列组成及特征结构分析,扩增得到的基因为木瓜凝乳酶基因。     

Purification and Characterization of a Cysteine Protease Produced by Pathogenic Luminous Vibrio harveyi

The purification and characterization of an extracellular protease produced by pathogenic luminous Vibrio harveyi strain 820514, originally isolated from diseased tiger prawn (Penaeus monodon), was presented in this paper. The purification steps included ammonium sulfate precipitation, with columns of hydrophobic interaction chromatography and anion exchange on fast protein liquid chromatography. The protease is an alkaline cysteine protease, heat labile, inhibited by iodoacetamide, iodoacetic acid, N-ethylmaleimide, p-chloromercuribenzoate, and p-chloromercuribenzene-sulfonic acid, and showed maximal activities at pH 8 and 50°C, having a molecular mass of 38 kDa as estimated by SDS-PAGE and gel filtration column. In addition, the protease was also completely inhibited by CuCl₂ and HgCl₂, but not or only partially inhibited by other inhibitors tested. Furthermore, 2-mercaptoethanol was the most effective reducing agent in the activation of the enzyme. The present protease is the first cysteine protease found in Vibrio species. Received: 20 November 1996 / Accepted: 7 January 1997     

双烯内酯水解酶基因的克隆和序列分析*

从土壤中分离到一株降解2,4-二氯酚能力较强的假单胞菌菌株GT241-1,从中克隆出参与降解2,4-二氯酚的双烯内酯水解酶基因(dcpD)。该基因编码的双烯内酯水解酶可将顺式-2-氯双烯内酯水解成2-氯马来乙酸。采用的基因克隆策略是用Southem杂交对其邻近基因进行定位后构建基因组库,再用斑点杂交筛选目的转化子。经序列测定得知dcpD基因编码区702bp。核苷酸和推测编码的氨基酸序列分析表明,dcpD与已在GenBank登记的相关基因有一定的差异。     

苯胺双加氧酶基因的克隆与序列分析

通过设计苯胺双加氧酶基因特异引物,以苯胺降解菌株ANA5基因组DNA为模板,PCR扩增出目的基因片断。然后利用粘粒pLAFR3作为载体,以E．coliEPI100作为受体,构建了菌株ANA5的基因组粘粒文库。以PCR扩增产物作为探针,通过菌落原位杂交筛选得到两个阳性克隆,经Southern杂交及亚克隆测序分析,初步确认克隆到苯胺双加氧酶基因。同时完成了苯胺双加氧酶基因atdA3A4A5序列的测定,并对其核苷酸及其推导的氨基酸序列进行分析,结果表明克隆到的苯胺双加氧酶基因与GenBank报道的基因有一定的差异,同时体现了该基因在进化上的保守性。     

蚯蚓纤溶酶基因的克隆与序列分析

目的:获取蚯蚓纤溶酶(EFE)的基因,并对其进行序列分析。方法:从赤子爱胜蚓中提取总RNA,然后利用RT-PCR技术扩增EFE的基因,并将其插入pUCm-T载体,经PCR和酶切鉴定后进行序列测定及分析。结果:DNA序列分析表明,所克隆的EFE基因全长为738bp,其中编码区段为735bp,共编码245个氨基酸残基,成熟肽为238个氨基酸残基。与GenBank中已报道的粉正蚓的EFE序列F-Ⅲ-2的同源性最高,两者在核苷酸序列上有2处不同,即第137位(T→C)和第632位(G→T),密码子也因而分别由GTC、GGT变为GCC、GTT,导致第46位、211位的氨基酸残基分别由缬氨酸、甘氨酸变为丙氨酸和缬氨酸。结论:从赤子爱胜蚓中成功克隆了1条EFE基因F245。序列测定及同源性分析表明,蚯蚓纤溶酶F245与已报道的多条EFE基因序列具有高度同源性,且具备完整的编码区。该序列的克隆为用基因工程的方法生产单一成分的高酶活性EFE奠定了基础。     

军曹鱼肌生成抑制素基因的克隆与序列分析

肌生成抑制素(Myostation,MSTN)是一种骨骼肌生长的负调控因子,其生物功能主要是抑制骨骼肌的生长。肌生成抑制素的活性降低或丧失,可使肌肉与其他组织的比例大大提高,因此在动物育种和医疗上有很大的潜在应用价值。目前包括鱼类在内的20多种脊椎动物的MSTN cDNA已经得到克隆和测序。本实验依据已知的鱼MSTN cDNA的保守区域设计一对特异引物,利用PCR技术分别从军曹鱼基因组中扩增出一个约1000bp的特异片段和300bp片段,所得目的片段回收纯化,将其酶切产物连接到pMDl8-T克隆载体上,转化入JM109感受态细胞中,挑取阳性克隆进行转化子鉴定,其质粒测序结果与文献报道的一致,证明成功地克隆了军曹鱼肌生成抑制素基因。