嗜热脂肪芽孢杆菌a-淀粉酶基因的克隆和表达

用pBR322作为克隆载体,从嗜热指肪芽孢杆菌658染色体上克隆了两个a-淀粉酶同功酶基因,这两个基因分别位于5．4kb和9kb的两个HiND酶切片段上。带有这两个基因的两个大肠杆菌克隆株所产生的a-淀粉酶活力在不同程度上比原来的嗜热脂肪芽孢杆菌658菌株的活力高,除了它们的酶反应的最适pH值相同外,它们的酶活力、耐热性、分泌性、酶反应的最适温度均不相同。     

嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达

以质粒pATl53为载体,应用鸟枪法在大肠杆菌中建立了嗜热脂肪芽孢杆菌α－淀粉酶基因无性繁殖系。两个含α一淀粉酶基因的克隆的Hind Ⅲ片段均为4．5kb,内切酶谱也相同。本文还比较了从HBl01,p^a－1823和从基因供体菌中提取的α－淀粉酶的耐热性。     

芝田硫化叶菌新型α-淀粉酶基因在大肠杆菌的克隆和表达

A novel α-amylase gene was amplified from Sulfolobus shibatae by using PCR technique.The amplified 1.7kb DNA fragment was inserted into an expression vector pBV220 to yield the recombinant plasmid pSBAM. The novel α-amylase gene in pSBAM was expressed in E. coli. The production of the novel α-amylase activity reached over 8 units/100mL of the culture. The molecular weight of this enzyme was about 61kD by SDS-PAGE. The expressed novel α-amylase protein in E.coli DHSα accounted for about 20 % of the total protein in the recombinant cell. The cooperative action of the novel α-amylase and the maltooligosyltrehalose synthase from Sulfolobus shibatae was investigated and trehalose was detected by using HPLC analysis when using amylose and partial starch hydrolysates as substrates.     

耐高温α—淀粉酶基因在马铃薯中的表达

The thermostable alpha-amylase gene cloned from Bacillus lichemiformis was reconstructed into an expression vector pAMY721M under the CaMV35S promoter. The vector was transferred into A. tumerfaciens ABI. The thermostable alpha-amylase gene was transferred into Solanum tuberosum L. via Agrobacterium mediation according to the revised method of ZHAO Shu Juan et al (1997) and YANG Mei Zhu et al (1992). Shoots were induced and regenerated on MS medium with 2 mg/L ZT, 0.1 mg/L IAA and 100 mg/L kanamycin. Putative transformants were selected with kanamycin and roots induced on MS medium with 0.15 mg/L IAA. PCR analysis and thermostable alpha-amylase activity assay were done to identify the transgenic plantlets. Among them, 102,001, 102,607, and 110,402 were showed to have a higher alpha-amylase activity than untransformed control.     

α－淀粉酶和糖化酶在酿酒酵母中的表达和分泌

将地衣芽孢杆菌α－淀粉酶基因及黑曲霉糖化酶cDNA重组进大肠杆菌．酵母穿梭质粒,转化酿酒酵母,构建能分解淀粉的酵母工程菌。酶活力测定和酶学性质分析的结果显示：在酵母MF—αl因子及磷酸甘油酸激酶基因的启动子和终止信号的调控下,α－淀粉酶和糖化酶基因在酵母中获得高表达并向胞外分泌这两种酶。构建的酵母工程菌在含10％淀粉的培养基中6天内能水解97%的淀粉。重组质粒能在酵母中较稳定地存在。     

β—淀粉酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

β—淀粉酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达王峥,周蓓芸,郑幼霞（中国科学院上海植物生理研究所,２０００３）关键词高温放线菌,β—淀粉酶,基因克隆β—淀粉酶是一种外切型淀粉水解酶,它从淀粉的非还原性末端依次水解α－１,４葡萄糖昔键,产生分构型的麦芽糖。内...     

芽孢杆菌β—淀粉酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达

本工作采用新设计的营养缺陷型淘汰筛选法,从本实验室筛选的芽孢杆菌Bacillus R2中分离到能够水解生淀粉的β-淀粉酶基因。该基因所在的DNA片段为5.25kb,在大肠杆菌(E.coli)中的表达产物具有与供体菌相同的淀粉酶特性,实验室条件下酶产量为500IU/ml以上,RDA值为57%,并且可以全部分泌到培养基中。     

芽孢杆菌α-淀粉酶基因的克隆、表达和酶学性质分析

在仔猪结肠内容物中分离出一株能利用淀粉的芽孢杆菌Bacillussp.WS06,构建了全基因组DNA文库,从中筛选出α_淀粉酶基因amyF,分析测定了其核苷酸序列并进行了表达;其中amyF编码的蛋白有526个氨基酸、分子量为58.6kD;它与已报道的Bacillusmegaterium的α_淀粉酶序列有93%的同源性。经过氨基酸序列比较分析还发现,AmyF含有淀粉酶家族中4个高度保守的酶催化活性区。经多步纯化,重组酶的比活共提高了22.2倍,获得凝胶电泳均一的蛋白样品;经SDS_PAGE检测,AmyF酶分子量为57kD。该酶的最适反应温度为55℃～60℃,酶的最适反应pH为7.0,在温度不超过55℃时,酶活较稳定;AmyF能迅速降解淀粉生成麦芽寡糖,属于内切糖苷酶。     

巨大芽孢杆菌淀粉酶基因的克隆及其在枯草杆菌中的表达

以λ噬菌体为载体,采用鸟枪法由B.megaterium基因组克隆得到了1个淀粉酶基因,并已被亚克隆到E.coli和B.subtilis中,其表达水平较B.megaterium高250倍。克隆株产生的淀粉酶对直链淀粉的早期水解产物主要为麦芽三糖和麦芽糖,随着水解时间的延长,又将它们转变为葡萄糖。同时能以麦芽三糖为底物水解为麦芽糖和葡萄糖。受体菌的平行提取物无上述水解活性。因而该酶被确定为糖化型α-淀粉酶。SDS-凝胶电泳法确定酶分子量为58000道尔顿。     

枯草杆菌α-淀粉酶基因克隆及其在毕赤酵母中表达的初步研究

以B.subtilis XL-15基因组为模板,运用PCR法成功克隆了α-淀粉酶基因,其开放式阅读框(ORF)为1980bp,编码659个氨基酸残基。分别将该基因转入大肠杆菌BL21(DE3)和毕赤酵母GS115中,进行诱导表达。结果表明,大肠杆菌破碎上清液中未检出酶活,SDS-PAGE电泳分析显示表达产物均以无活性包涵体存在;而毕赤酵母在α-Factor及AOX1基因启动子和终止信号的调控下,经高密度培养,表达产物分泌至胞外,发酵液酶活力为4.3U/ml,实现了B.subtilis α-淀粉酶基因的分泌表达。     

斑节对虾α-淀粉酶基因的克隆及其表达分析

为了研究斑节对虾α-淀粉酶基因的结构和生物学功能, 根据原实验室构建的斑节对虾(Penaeus monodon) cDNA文库得到的EST序列, 利用RACE技术获得了斑节对虾α-淀粉酶基因(PmAmy)的cDNA全长序列。该基因序列全长2465 bp, 包括2175 bp的开放阅读框, 编码724个氨基酸, 分子总量为78.9 kD, 理论等电点为4.66。PmAmy包含一个α-淀粉酶家族保守的A结构域(Thr34-Ser410)和一个C结构域(Glu420-Ala496)。PmAmy氨基酸序列与其他物种的相似性为47%—99%, 利用PmAmy构建的进化树显示斑节对虾和凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的亲缘关系最近。基因表达结果显示PmAmy在肝胰腺组织中的表达量显著高于其他组织(P<0.05)。斑节对虾PmAmy基因在卵巢发育的过程中均有表达, 表达量有所变化, 虽然没有发现显著性的差异(P=0.09)。斑节对虾PmAmy在整个生长阶段的检测中都有表达, 其中幼体发育过程中存在显著性差异, 糠虾时期PmAmy表达量显著高于无节幼体、溞状幼体和仔虾时期(P<0.05)。以上实验结果初步说明了PmAmy可能与斑节对虾的幼体发育相关。     

西方许旺酵母α-淀粉酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的分泌表达

目的:将带有完整自身信号肽的西方许旺酵母α-淀粉酶基因克隆到大肠杆菌中,验证西方许旺酵母α-淀粉酶基因能否在大肠杆菌中有效表达。方法:利用PCR扩增带有完整自身信号肽的西方许旺酵母α-淀粉酶基因,并将其接入Zeocin启动子片段,构建了重组表达载体GapZA,转化大肠杆菌,验证得到的阳性克隆菌株是否表达α-淀粉酶活性。结果:阳性克隆菌株均有α-淀粉酶活性。结论:证明了许旺酵母α-淀粉酶能在自身信号肽引导下分泌到大肠杆菌细胞外,并且表现出明显酶活。     

马铃薯α-淀粉酶基因的克隆及生物信息学分析(英文)

本研究利用RT-PCR从马铃薯(Solanum tuberosum)茎段总RNA中扩增、克隆了一cDNA分子。该cDNA分子含有一长为1224bp的开放读框,可编码一含407个氨基酸残基的多肽、理论分子量为46.40kD、可能为亲水性的胞外酶。因其氨基酸序列同源于α-淀粉酶,故将该基因命名为amyA1(NCBI收录号:GQ406048.1)。采用半定量RT-PCR方法检测了amyA1基因在马铃薯茎、叶等不同组织中的表达强度,表明在茎组织中的表达丰度略高。利用生物信息学软件分析了amyA1密码子的偏好性,以期为选择适宜的表达系统提供依据;同时对amyA1的理化性质、细胞内定位、保守结构及高级结构进行了预测。基于NCBI数据库中有物种代表性的29种α-淀粉酶基因序列构建了基因进化树。与NCBI收录的马铃薯α-淀粉酶基因(NCBI收录号:M79328.1)的核苷酸及氨基酸序列同源性达98%。第20至第348范围内的氨基酸残基含有与淀粉酶13家族及亚家族相似的催化活性域(PF00128、SM00624),第349至第407范围内的氨基酸残基含有α-淀粉酶C-末端β折叠区域(PF07821)。蛋白质结构预测表明氨基酸残基序列有维持淀粉酶活性的(β/α)8桶状结构以及其它几个功能域结构。所构建的基因进化树表明,2个马铃薯α-淀粉酶基因与木薯、苹果的序列同源性较高,与菜豆的次之,与水稻、大麦和玉米等单子叶植物的序列同源性较低。     

以温和噬菌体pll为载体克隆α-淀粉酶基因

温和噬菌体p11 DNA和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168染色体DNA用BamHl酶消化和T4 DNA连接酶连接,转化到被噬菌体p11溶源化了的501菌株中,经过体内交换整人到染色体上,培养48小时后,从1020个菌落中挑出含Arol+一Amy+基因的3个转化子,分别命名为p11Amy1、p11Amy2和p11Amy3。取p11Amy1进行繁殖和丝裂霉素c诱导,诱导后的重组噬菌体用于测定噬斑形成能力和转导活性,提取其DNA再用于转化,均证明构建成了含淀粉酶基因的重组特异性转导噬菌体。     

地衣形芽孢杆菌热稳定α-淀粉酶基因的分子克隆及其在枯草杆菌中的表达

以E.coli噬菌体λ EMBL 3为载体,用鸟枪法将地衣形芽孢杆菌的热稳定α-淀粉酶基因克隆到λ噬菌体的基因组中。携带α-淀粉酶基因的杂种噬菌体λ pAmy_αL16的DNA,经限制性内切酶HindⅢ水解后,被亚克隆到枯草杆菌的质粒pNQ 122上,并得到了表达。通过重转化作用和物理图谱分析,证明α-淀粉酶基因位于3.9 kb的Hin dⅢ DNA限制片段上。 转化子枯草杆菌(pAmy_αL41)产生的α-淀粉酶的热稳定性、最适反应温度等与亲本菌株一致。α-淀粉酶的分子量和等电点也与原菌株相同。     

地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因的克隆和及其启动子功能鉴定

根据已知α-淀粉酶编码基因保守区核苷酸序列,通过PCR和反向PCR技术克隆出Bacillus licheniformisCICIM B0204α-淀粉酶编码基因amyL全长序列及其上下游序列。B.licheniformisCICIM B0204amyL由1539bp组成,其上游180bp为启动子序列,下游160bp为终止子序列;成熟肽由512个氨基酸残基组成,氨基端的29个氨基酸残基为α-淀粉酶的信号肽。通过基因及其氨基酸序列比对发现,amyL及其编码产物与芽孢杆菌来源的α-淀粉酶具有高度相似性。将amyL的结构基因在PT7介导下于大肠杆菌中诱导表达,获得具有α-淀粉酶活性的表达产物。将amyL的启动子序列和信号肽序列与B.licheniformisCICIM B2004的β-甘露聚糖酶结构基因进行读框内重组,在大肠杆菌中获得了β-甘露聚糖酶的分泌表达,重组大肠杆菌表达295U/mL的β-甘露聚糖酶酶活。     

黑曲霉葡萄糖淀粉酶Ⅰ基因的克隆及在酵母中的表达

采用RT—PCR技术,从黑曲霉的菌丝体RNA中扩增出葡萄糖淀粉酶GAI的结构基因,将其连接到pPIC9载体中,转入巴斯德毕赤酵母GSll5中,获得12株Mut＇重组酵母;甲醇诱导目的蛋白分泌表达,葡萄糖淀粉酶酶活最高达180U／ml,占上清液蛋白的38％。通过GAI在巴斯德毕赤酵母中的表达,重点讨论了目的基因拷贝数,基因的偏爱性等对外源基因分泌表达的影响。     

枯草杆菌表达载体pUB23的构建及地衣杆菌α-淀粉酶基因的表达

将克隆的解淀粉芽胞杆菌强启动子经DNA序列分析后连接到能在枯草杆菌中复制的质粒pUB18上,构建枯草杆菌表达载体pUB23。为了测试构建的表达载体能否表达外源基因,将地衣杆菌抉失了启动子的α-淀粉酶基因接到pUB23上启动子的下游,组建重组质粒,转化枯草杆菌QB1130(amy~-),获得能分泌α-淀粉酶的转化株,证明缺失了启动子的结构基因在pUB23上克隆启动子的启动下获得表达。酶活力测定结果表明,表达水平是用原启动子时的2.5倍.