南美白对虾养殖底泥中氨氧化细菌与氨氧化古菌多态性分析

【目的】本研究皆在了解虾养殖底泥中氨氧化细菌与氨氧化古菌群落多态性。【方法】以功能基因为基础,构建氨氧化细菌(AOB)与氨氧化古菌(AOA)的氨单加氧酶α亚基基因(amoA)克隆文库。利用限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP)技术将克隆文库阳性克隆子进行归类分析分成若干个可操作分类单元(Operational Taxa Units,OTUs)。【结果】通过序列多态性分析,表明AOB amoA基因克隆文库中所有序列都属于变形杆菌门β亚纲(β-Proteobacteria)中的亚硝化单细胞菌属(Nitrosomonas)及Nitrosomonas-like,未发现亚硝化螺旋菌属(Nitrosospira)。AOA amoA基因克隆文库中只有一个OTU序列属于未分类的古菌(Unclassified-Archaea),其余序列都属于泉古菌门(Crenarchaeote)。AOA群落结构单一且存在一个绝对优势类群OTU3,其克隆子数目占克隆文库的57.45%。AOB和AOA amoA基因克隆文库分别包括13个OTUs和9个OTUs,其文库覆盖率分别为73.47%和90.43%。AOB amoA基因克隆文库的Shannon-Wiener指数、Evenness指数、Simpson指数、Richness指数均高于AOA。【结论】虾养殖塘底泥中存在氨氧化古菌的amoA基因,且多态性低于氨氧化细菌,表明氨氧化古菌在虾养殖塘底泥的氮循环中可能具有重要的作用。     

华北典型旱地小麦土壤amoA基因的PCR-RFLP分析

通过构建氨氧化细菌(AOB )和氨氧化古菌(AOA)的氨氧化酶基因亚基A (amoA )克隆文库,并采用限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP )技术分析了华北地区典型旱地冬小麦土壤中amoA 基因的多样性.采用MspI 和AfaI 两种限制性内切酶对amoA 基因克隆文库中阳性克隆子进行双酶切后,共得到了18 个氨氧化细菌的可操作分类单元(Operational Taxa Units, OTUs )和10 个氨氧化古菌可操作分类单元(Operational Taxa Units, OTUs ),其文库覆盖率分别达到92.9%和88.3%.氨氧化细菌的Shannon-Wiener 指数、丰富度指数、均匀度指数均高于氨氧化古菌.通过对文库中amoA细菌测序分析,所有的序列都属于Nitrosospira cluster 3 .而在氨氧化古菌中存在着一个绝对优势种群,它占到克隆文库的80 %,测序分析的结果表明,氨氧化古菌属于不可培养的泉古菌门.     

艾比湖湿地三种植物根际土壤氨氧化细菌群落的多样性

摘要:【目的】以艾比湖湿地盐节木(Halocnemum strobilaceum)、芦苇(Reed)及盐角草(Salicornia)三种植物为对象,研究其根际土壤氨氧化细菌(AOB)的群落多样性。【方法】利用PCR-RFLP的方法,构建氨氧化细菌amoA基因克隆文库,进行系统发育分析。结合三种植物根际理化因子特点,探讨三种植物根际AOB群落结构组成的特点。【结果】通过序列多态性分析表明,三种植物根际土壤AOB amoA基因克隆文库中的所有序列均属于β亚纲(β-Proteobacteria)中的亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)及Nitrosomonas-like,未发现亚硝化螺菌属(Nitrosospira)。三个AOB amoA基因克隆文库分别包括9个OTUs、12个OTUs和7个OTUs,其文库覆盖度均达99%以上,代表性强。三个文库的丰富度、Chao1指数、ACE指数、Shannon指数均为R＞H＞S。【结论】三种植物的AOB多样性为芦苇＞盐节木＞盐角草,并且其最优氨氧化菌群各不相同。本研究为系统认识艾比湖湿地植物根际氨氧化细菌群落多样性和结构组成提供了基础。     

辉腾锡勒草原干涸湖泊中氨氧化微生物群落结构分析

【目的】以内蒙古辉腾锡勒草原九十九泉湿地为对象,研究湖泊干涸过程中氨氧化微生物的群落结构及其变化。【方法】通过MPN-PCR定量测定氨氧化古菌(AOA)和氨氧化细菌(AOB)的数量;构建amoA基因克隆文库,进行系统发育分析;结合土壤环境因子,探讨湿地退化过程中影响氨氧化微生物的潜在因素。【结果】依湖泊湿地退水梯度的不同样点中,有75%的样点AOB的数量高于AOA,AOB与AOA的数量比率为0.3-18.1。从湖心到湖岸草原带,AOA和AOB的数量有明显增加,但生物多样性呈降低趋势,二者没有呈现正相关。研究发现,AOB的数量与土壤中NH 4+-N的变化存在良好响应。系统发育分析显示,退化湖泊湿地AOA克隆序列均来自于泉古菌门(Crenarchaeota);AOB的amoA基因的克隆序列大部分与亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)有一定同源性,较少部分与亚硝化螺菌属(Nitrosospira)有一定同源性。【结论】湖泊退水过程增加了湿地土壤氨氧化微生物的数量,而氨氧化微生物的种群丰度有所降低。AOA和AOB群落对湖泊湿地的退化过程做出了响应,其中AOB的响应较为明显,氧化条件和土壤铵浓度的改变可能是促成这种响应的重要原因。     

奇古菌亚硝酸盐还原酶基因相似基因的多样性

摘要:【目的】氨氧化古菌(Ammonia-oxidizing archaea,AOA)是奇古菌门中的唯一类群,广泛分布于各个生态系统中,对氮素生物地球化学循环起着重要作用。亚硝酸还原酶是反硝化作用的关键酶,目前关于AOA反硝化作用的研究较少,对AOA 亚硝酸盐还原酶基因多样性的研究有利于揭示AOA在反硝化中的作用。【方法】本研究以水体、沉积物和土壤为研究对象,构建了奇古菌样的nirK基因克隆文库,研究了这些环境中nirK相似基因的多样性。【结果】对奇古菌样的nirK基因文库及其序列分析表明:湖水及其沉积物的 nirK基因克隆文库得到10个OTUs,菜田土壤和水样则有8个OTUs;系统发育进化树表明这些nirK氨基酸序列和Candidatus Nitrosopumilus koreensis AR1,Nitrosopumilus maritimus SCM1最为相似,但相似度较低(53%－68%)。克隆文库多样性指数分析表明:所有样品都存在不同类型的nirK基因,水体样品nirK基因类型的多样性和均匀度高于土壤样品,菜田土壤的nirK基因类型多样性最高,分布最均匀。【结论】本研究表明土壤和淡水环境中奇古菌门nirK基因也具有较高的多样性,并且这些基因型与海洋样品差异非常大,这些基因编码的亚硝酸盐还原酶可能对这些环境中的反硝化作用有重要意义。     

基于amoA基因扩增子高通量测序的氨氧化古菌多样性分析方法

【背景】对于环境样品中氨氧化古菌(Ammonia-oxidizing archaea,AOA)多样性的研究,利用amoA功能基因作为分子标记会比16SrRNA基因有更强的特异性和更高的分辨率,能更准确地反映环境样品中氨氧化古菌的种群结构和分布特征。然而,目前对amoA基因扩增子高通量测序的分析存在两大限制因素:一是缺乏相应的amoA基因参考数据库;二是AOA amoA基因在种水平上的相似性阈值未知,分析过程中没有明确的划分种水平操作分类单元(Operational taxonomic unit,OTU)的阈值。【目的】构建基于amoA功能基因序列分析氨氧化古菌多样性的方法,为基于高通量测序的功能微生物多样性分析提供参考。【方法】基于目前已通过分离纯化或富集培养获得的34株氨氧化古菌及功能基因数据库中收录的环境样品amoA基因序列,构建氨氧化古菌amoA基因参考数据库。通过菌株间两两比对获得的amoA基因相似度与16SrRNA基因相似度的相关性分析,确定amoA基因在种水平上的相似性阈值。基于MOTHUR软件平台,利用建立的参考数据库和确定的阈值对南海一个垂直水体剖面样品的amoA基因序列进行多样性分析。【结果】构建了含有26 091条序列信息的古菌amoA基因参考数据库,确定了89%作为分析过程中古菌amoA基因划分种水平OTU的阈值,对南海水体样品氨氧化古菌的多样性分析结果很好地显示了南海不同深度水层水体中氨氧化古菌的种群结构和系统发育关系,有效揭示了南海氨氧化古菌的垂直分布差异。【结论】建立了基于amoA基因高通量测序的氨氧化古菌多样性分析方法,此方法可以有效分析环境样品中氨氧化古菌的多样性。     

西藏米拉山土壤古菌16S rRNA及amoA基因多样性?分析

摘要：【目的】硝化作用在全球土壤氮循环中具有重要的作用,虽然细菌一度被认为单独负责催化这个过程的限速步骤,但是最近一些研究结果表明泉古菌具有氨氧化的能力。本文通过构建古菌16S rRNA 基因克隆文库和氨氧化古菌amoA基因文库,分析西藏米拉山高寒草甸土壤中古菌及氨氧化古菌群落结构组成情况,为揭示青藏高原高寒草甸土壤古菌的多样性提供理论基础。【方法】采用未培养技术直接从土壤中提取微生物总DNA,分别利用通用引物构建古菌16S rRNA 基因和氨氧化古菌amoA基因克隆文库。【结果】通过构建系统发育树,表明古菌16S rRNA 基因克隆文库包括泉古菌门和未分类的古菌两大类,并且所有泉古菌均属于热变形菌纲。氨氧化古菌amoA基因克隆文库中序列均为泉古菌。通过DOTUR软件分析,古菌16S rRNA基因和古菌amoA基因克隆文库分别包括64个OTUs和 75个OTUs。【结论】西藏米拉山高寒草甸土壤中古菌多样性比较丰富,表明古菌在高寒草甸土壤的氮循环中可能具有重要的作用。所获得的一些序列与已知环境中土壤、淡水及海洋沉积物中获得的一些序列具有很高的相似性,其古菌及氨氧化古菌来自不同环境的可能性比较大,可能与青藏高原的地质历史变迁过程有关。米拉山古菌及氨氧化古菌与陆地设施土壤中相似性最高,说明与西藏米拉山高寒草甸土壤的退化有关。     

艾比湖湿地芦苇根际土壤氨氧化古菌的多样性和群落结构

【目的】旨在揭示耐盐植物芦苇根际与非根际土壤AOA群落结构间的差异,为深入研究盐生植物根际土壤微生物与耐盐性之间的关系提供理论基础。【方法】应用高通量测序技术以氨单加氧酶基因(amoA)为分子标记,对新疆艾比湖湿地荒漠生态系统不同季节(春、夏、秋)芦苇根际与非根际土壤氨氧化古菌(AOA)的多样性和群落结构进行研究。【结果】结果表明,不同季节芦苇根际土壤AOA多样性和丰富度存在差异,相比非根际土壤,夏季和秋季芦苇根际土壤AOA多样性较低丰富度较高,春季多样性较高丰富度较低。芦苇根际土壤中AOA的多样性为春季夏季秋季。AOA群落组成分析表明,土壤样品中AOA群落主要集中在泉古菌门(Crenarchaeota)和奇古菌门(Thaumarchaeota),其中泉古菌门为主要优势菌门。RDA分析表明,含水量(SM)、有机质(SOM)、总氮(TN)和pH是影响芦苇根际土壤AOA群落多样性和丰富度的主要环境因子。【结论】不同季节芦苇根际土壤AOA多样性及丰富度存在差异,相比非根际土壤,芦苇根际土壤AOA更丰富。     

西藏米拉山土壤古茵16S rRNA及amoA基因多样性分析

[目的]本研究旨在了解西藏米拉山高寒草甸土壤中古菌及氨氧化古菌群落结构组成情况.[方法]采用未培养技术直接从土壤中提取微生物总DNA,分别利用通用引物构建古菌16S rRNA基因和氨氧化古菌amoA基因克隆文库.利用DOTUR软件将古菌和氨氧化古菌序列按照相似性97%的标准分成若干个可操作分类单元(OTUs).[结果]通过构建系统发育树,表明古菌16s rRNA基因克隆文库包括泉古菌门和未分类的古菌两大类,并且所有泉古菌均属于热变形菌纲.氨氧化古菌amoA基因克隆文库中序列均为泉古菌.古菌16s rRNA基因和古菌amoA基因克隆文库分别包括64个OTUs和75个OTUs.[结论]西藏米拉山高寒草甸土壤中古菌多样性比较丰富,表明古菌在高寒草甸土壤的氮循环中可能具有重要的作用.     

新疆艾比湖湿地博乐河入口处土壤细菌多样性分析

【目的】了解新疆艾比湖湿地国家级自然保护区非培养土壤细菌群落组成及多样性。【方法】采用非培养法直接从湿地土壤提取总DNA进行16S r RNA基因扩增,构建细菌16S r RNA基因克隆文库。使用MspⅠ和AfaⅠ限制性内切酶对阳性克隆进行16S r RNA基因扩增片段的限制性酶切分析(Amplified r DNA restriction analysis,ARDRA),挑取具有不同双酶切图谱的克隆进行测序,序列比对并构建16S r RNA基因系统发育树。【结果】从土壤细菌的16S r RNA基因文库中随机挑取75个不同谱型的克隆子,共得到58个OTUs,系统发育归类为8个细菌类群:绿弯菌门(Chloroflexi)、蓝藻门(Cyanobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、疣微菌门(Verrucomicrob)和芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)。其中,变形菌门为第一优势菌群,拟杆菌门为第二优势菌群,两者约占总克隆的65%。【结论】艾比湖湿地博乐河入口处土壤细菌多样性丰富,且存在一定数量的潜在微生物新种。