石油发酵长链二元酸的研究——Ⅲ.热带假丝酵母(Candida tropicalis)多倍体变种生产十三烷1∶3二羧酸的发酵条件研究

对热带假丝酵母(Candida tropicalis)多倍体变种NP_(CO)N22的十三烷1:13二羧酸高产发酵进行了研究。乙醇、可溶性淀粉、尿素、磷酸氢二铵等为较好的碳、氮源,但尿素等氮源的量增加时则完全抑制了二元酸的合成。烷烃发酵的适宜起始pH值在6～7之间,而发酵过程中则以维持pH值在8～8.5为佳。通气量Ks=0.8毫克分子O_2/升/分时,二元酸的产量最高。苯巴比妥和巴比妥酸钠能明显促进二元酸的合成。以乙醇和蔗糖为碳源,结合补料及调节pH,发酵190小时,十三烷1:13二羧酸产量分别达77.2克/升和72.5克/升。热带假丝酵母多倍体变种能氧化从癸烷至十八烷的正烷烃为相应碳链的长链二元酸,但以十三烷1:13二羧酸的产量为最高。     

石油发酵长链二元酸的研究——(Ⅳ)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)休止细胞转化正烷烃为相应长链二元酸的研究

热带假丝酵母(Candida tropicalis)变种N-15的休止菌体能转化十五烷为十三烷1:13二羧酸。菌龄48小时休止菌体转化活力最高。转化的最适反应系统为pH 7`5之0`5 M磷酸缓冲液。通气量对转化有很大影响,在高通气条件下,菌浓为15×10~8/毫升时,十三烷1:13二羧酸产量可高达109克/升。而且休止菌体可将从癸烷至十七烷的正烷烃氧化为相应碳链的长铸二元酸,产量都很高。转化的方法工艺简单,效率高,有应用价值。N-15休止菌体还可以氧化不同长度碳链的醇、醛及一元脂肪酸,但不能氧化烯烃及二元醇,可能N-15的烷烃初始氧化不经过脱氢及二元醇氧化途径。     

石油发酵长链二元酸的研究——(Ⅱ)热带假丝酵母(Candida tropicalis)多倍体的诱变育种

热带假丝酵母(Candida tropicalis)79经 MNNG诱变后获得产长链二元酸突变株N—26,十三烷1:13二羧酸产量为10克/升。N-26％用秋水仙碱和樟脑分别诱发产生多倍体细胞 NP_(CO)2和NP_(Oa)18,十三烷1:13二羧酸产量分别提高到17.3克/升和18.3克/升。多倍体NP_(CO)2和NP_(Oa)18的个体大,生长速率快,DNA含量分别为3.2×10~(-6)微克/细胞和4.O×10~(-6)微克/细胞,而 N-26则为1.6×10~(-6)微克/细胞。 多倍体NP_(OO)2和NP_(Ca)18对MNNG均较敏感,致死率较N—26高一倍,诱变之总突变频率则较原种高8—10％,以0.25毫克/毫升MNNG处理时正突变频率可提高一倍左右,因此获得高产突变株的机率显著提高。从多倍体NP_(OO)2和NP_(Ca)18经0.25毫克/毫升MNNG处理所得高产菌株、NP_(CO)N22和 NP_(Oa)N39,十三烷 1:13二羧酸的产量分别提高到33.5克/升和34.5克/升。 对多倍体高产变种生理特性的初步观察指出多倍体细胞较易为蜗牛细胞壁溶解酶作用生成原生质体,电子显微镜初步观察指出多倍体细胞的细胞壁可能较薄。 离体酶活力的测定指出多倍体变种的三羧酸循环酶系、呼吸链酶系和过氧化氢酶活力增加,因而推测多倍体变种之所以提高长链二元酸的产量可能是由于ATP的供应增加,促进了烷烃的氧化,而过氧化氢酶的增加可能是对于烷烃氧化过     

丙氨酸对热带假丝酵母NPcoN22长链二元酸发酵的调节

本文研究了丙氨酸对热带假丝酵母(Candida tropicalis)NPcoN22长链二元酸发酵的调节,并把它与尿素的调节作了比较。在蔗糖利用、烷烃利用、菌体生长、发酵液pH变化和十四烷一1,14一二羧酸积累诸方面以及在三羧酸循环、乙醛酸循环、过氧化氢酶等酶的活力方面,丙氨酸具有与尿素相同的调节作用。丙氨酸加尿素作为混合氮源或在正常发酵过程中补加尿素或丙氨酸,其调节效果与过量尿素或过量丙氨酸单独存在条件下的情况一样,说明尿素和丙氨酸的调节作用具有相加效应。发酵过程中菌体对丙氨酸的利用特点表明了丙氨酸是菌体生长的限制因子。Β一氧化的抑制剂——丙烯酸能显著提高十四烷一1,14-二羧酸的积累。     

生产长链二元酸菌株的诱变筛选

能用于正烷烃发酵生产长链二元酸的较好微生物都是酵母菌,尤其是假丝酵母属中的热带假丝酵母（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）和阴沟假丝酵母（Ｃａｎｄｉｄａ ｃｌｏａｃａｅ）。 关于二元酸,知道Ｃ１０以下的短链二元酸在自然界广泛存在,确立起来的工业制造方法也多,而Ｃ１０以上的长链二元酸,天然存在的少,化工上难以合成。迄今为止,对二元酸的研究主要集中在Ｃ１０以上的长链二元酸。但是,所有野生菌株都难以积累和基质链长相同的长链二元酸,也就是说,它们的β-氧化能力太强。 Ｕｃｌｉｏ等研究了阴沟假丝酵母３１０…     

烷烃发酵产生1，13-十三碳二元酸及其诱导作用的研究

从能利用正十二烷产生1,12-十二碳二元酸的热带假丝酵母突变株D28出发,经两次紫外线照射诱变,选育到一株从正十三烷产生1,13-十三碳二元酸较高的突变株2—23号菌。该突变株较出发菌株提高产酸率20％,达40．4g／L。突变株2—23也能将一定链长的长链烷烃以较高的产率转变成相应的单一二元酸。此外,在产酸摇瓶条件试验中观察到烷烃的诱导作用,使突变株产酸能力得以提高。用烷烃预培养的种子发酵正十三烷,其产生1,13一十三碳二元酸的量较糖质碳源培养的种子发酵时要提高30％。     

烷烃发酵产生1，13-十三碳二元酸及其诱导作用的研究

从能利用正十二烷产生1,12-十二碳二元酸的热带假丝酵母突变株D28出发,经两次紫外线照射诱变,选育到一株从正十三烷产生1,13-十三碳二元酸较高的突变株2—23号菌。该突变株较出发菌株提高产酸率20％,达40．4g／L。突变株2—23也能将一定链长的长链烷烃以较高的产率转变成相应的单一二元酸。此外,在产酸摇瓶条件试验中观察到烷烃的诱导作用,使突变株产酸能力得以提高。用烷烃预培养的种子发酵正十三烷,其产生1,13一十三碳二元酸的量较糖质碳源培养的种子发酵时要提高30％。     

正烷烃发酵产生长链二羧酸的优良菌株U_(3-21)

我们由热带假丝酵母(Candida tropicalis)1230菌株经硝基胍及紫外线诱变,得到突变菌株U_(3-21),该菌株不仅能利用C_(10)—C_(14)正烷烃混合物产生较多的混合长链二羧酸,在最适条件下也能利用一系列单一的C_(10)—C_(18)正烷烃产生     

热带假丝酵母ctpxa1基因缺失菌的构建及对长链二元酸积累的影响

Pxa1p为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae过氧化物酶体上的膜蛋白,与Pxa2p组成二聚体,参与转运长链脂肪酸进入过氧化物酶体过程。热带假丝酵母能够发酵烷烃和脂肪酸生产长链二元酸,而过氧化物酶体中发生的β-氧化会消耗产生的长链二元酸造成产率降低。本研究以热带假丝酵母Candida tropicalis 1798为宿主菌,通过基于PCR片段的同源单交换法,快速构建ctpxa1基因敲除菌株C.tropicalis 1798-pxa1。利用半定量RT-PCR技术,检测ctpxa1基因在C.tropicalis 1798、C.tropicalis 1798-pxa1的表达量,灰度值比值为2.03,表明ctpxa1在C.tropicalis 1798-pxa1中的表达被弱化。经144 h发酵,C.tropicalis 1798-pxa1比C.tropicalis 1798的十二碳二元酸产量明显提升,其产出浓度为10.3 g/L,比野生型菌株C.tropicalis 1798提高了94.3%。     

十二碳二元酸发酵研究

长链二元酸(long-chain dicarboxylic acid,DCA)是指C10以上的脂肪族二元羧酸。它们是一类重要的精细化工原料,广泛用于大环麝香、工程塑料、耐寒增塑剂、尼龙纤维、热熔胶以及液晶的合成,也是医药和农药合成的原料。其中十二碳二元酸(DCA12)市场需求量较大,主要用于合成高级工程塑料尼龙1212、服装用尼龙热熔胶和高级涂料等,目前由化学法和发酵法生产。由于发酵法其原料来源容易、生产条件温和、产品纯度高等待点,深受重视。国内外对发酵法制取DCA12的研究较为深入^[1-6],1998年我国已实现了工业化生产^[7]。热带假丝酵母(Candida tropicalis)突变株SP—UV—56是一株高产十三碳二元酸(DCA13)生产菌^[8],已用于工业发酵生产DCA13。现报道该突变株在10L罐发酵生产DCA12的结果。     

尿素对热带假丝酵母合成长链二元酸途径的调节III．菌体生长和碳代谢平衡

本文通过热带假丝酵母(Candida tropicalts)在不同量尿素中的生长、磷和碳代谢方面的研究来探讨尿素的调节作用。结果指出,过量尿素(0 3％)培养1 20小时的酵母凶体干重为适量尿素(0．1％)培养的菌体干重的162％,但二元酸及其它代谢产物的量却大为减少。发酵过程氧的吸收和二氧化碳的释出明显地高于0.1％尿素的发酵过程。     

十三碳二元酸的发酵条件初探

就假丝酵母对石油烷烃进行发酵生成十三碳二元酸进行了研究。当湿菌体含量升至 6 .0 %以上时 ,在pH7.0、温度 30℃和发酵时间 12 0h的条件下 ,流加轻油发酵 ,十三碳二元酸的生成量可达 70 g/L以上。     

N^＋离子注入热带假丝酵母对长链二元酸产量的影响

用热带假丝酵母(Candidatropicalis)SCB412作为出发菌株,经能量50KeV、剂量l×1011～5×1015ions/cm2的N+离子注入诱变处理,以产生可遗传的诱变.N+离子注入后,存活率与剂量呈指数衰减关系log(存活率%)=8.23-0.604×log(剂量),在培养过程中可观察到酵母菌菌落和细胞形态均发生了变化.经筛选,获得了一株能够利用正十二烷烃发酵产生长链二元酸的高产菌热带假丝酵母SCB609.在初始正十二烷烃浓度为15%(v/v)下产酸量由43.5g/L上升到73.2g/L.比较两株菌发酵生长特性的差异,产酸过程有一定的变化.     

尿素对热带假丝酵母(Candida tropicalis)多倍体变种形成微体的影响

对热带假丝酵母(Candida tropicalis)多倍体变种NP_(co)N22的超显微形态、结构和长链二元酸合成的关系进行了研究。烷烃能诱导热带假丝酵母微体(microbody)的形成。在适量尿素(0.1％)存在下的烷烃发酵能合成大量长链二元酸,同时菌体内有很多微体出现,但在过量尿素(0.2％)存在下,则长链二元酸的合成和微体的形成均受抑制,说明微体的存在是长链二元酸合成的必要条件。由于微体对烷烃的利用和长链二元酸的合成有关,ω氧化酶系也可能定位于微体上。 在过量尿素(0.2％)存在下,微体的形成和长链二元酸的合成都被抑制,尿酸氧化酶也明显降低,但过氧化氢酶和D-氨基酸氧化酶都比适量尿素(0.1％)培养的菌体显著增加。这些结果指出,微体的出现和这三种所谓微体的“标志酶”的活力是不平行的。因此“标志酶”的提法值得商榷。     

正烷烃发酵生产长链混合二羧酸I．菌种的筛选、诱变及鉴定

从702株酵母菌中筛选到21株能利用混合正烷烃产生较多二羧酸的菌株,其中1230号菌株产二羧酸最较高,而产一羧酸极少,经鉴定为热带假丝酵母(Candida tropicalis)。1230号菌株以癸二酸及十二碳二羧酸作指示培养基的唯一碳源,经亚硝基胍及紫外线诱变,挑选出在指示培养基上不生长,而在完全培养基上生长的菌落,最后得到产酸量为2．43％的突变株Us-21。其发酵产物分离提纯后,经气液相色谱鉴定为与基质链长相应的长链混合二羧酸。     

肉毒碱乙酰转移酶基因敲除对长链二元酸生产代谢过程的影响

在利用热带假丝酵母发酵生产长链二元酸的过程中 ,脂肪酸将进入 β 氧化途径 ,代谢产生能量 ,从而降低产物收率。首次以负责运输的肉毒碱乙酰转移酶为改造目标 ,在肉毒碱乙酰转移酶基因中插入潮霉素B抗性基因 ,构建DNA转化质粒 ,并进行一次同源重组 ,得到肉毒碱乙酰转移酶基因单拷贝敲除的基因工程菌。根据摇瓶实验结果 ,该基因工程菌与原始菌株相比 ,十三碳二元酸的产量与摩尔转化率分别提高了 13 0 %和 11 8%。     

热带假丝酵母高效利用甘油研究

目的:热带假丝酵母以油脂为底物发酵时会产生副产物甘油,研究对热带假丝酵母gk基因进行过表达,将副产物甘油转化为能量,提高油脂转化利用效率。方法:以热带假丝酵母Candida tropicalis 1798中的甘油激酶(gk)为研究对象,利用PCR技术获得同源臂基因gkpR,通过一步法无缝克隆将同源臂和G418抗性基因(kanr)连接至pPICzαA载体,同时将解脂假丝酵母Candida lipolytica 1457中的启动子基因pGAP无缝连接至载体中的gkpR,构成质粒pPICzαA-gkp,并电转化至C.tropicalis 1798感受态细胞中,通过一次同源单交换,将启动子pGK替换为pGAP。结果:经过G418抗性筛选和PCR鉴定,成功获得pGAP基因替换菌株C.tropicalis 1798-gkPr;发酵验证结果显示,启动子基因替换C.tropicalis 1798在以甘油为底物培养时重组菌OD600值比野生型菌株高46.4%,重组菌培养基中甘油剩余量比野生菌降低56.1%,表明启动子替换能促进C.tropicalis1798对甘油的吸收利用。此外,以油脂为底物进行发酵实验时还发现重组菌产长链二元酸的量比野生菌提高32.7%。结论:通过启动子替换手段构建的重组菌C.tropicalis 1798-gkPr,提高了热带假丝酵母对油脂组分中甘油成分的利用效率。     

产长链二元酸热带假丝酵母酸分泌过程研究

热带假丝酵母（C．tropicalis）是长链二元酸发酵生产中常用菌种。其二元酸分泌过程是烧烃代谢过程中的重要步骤,pH在7．4～8．2范围内,足够高的pH对分泌和产酸是必需的。二元酸钠盐明显不利于分泌过程。二元酸的分泌相对于胞内ω一氧化过程是快速过程。建立了一种用于研究分泌过程的方法,利用静息细胞在缓冲溶液中分泌所引起的溶液pH变化来获得酸分泌量的在线数据。     

十二碳二元酸的发酵研究

热带假丝酵母(Candidatropicalis)UH248菌株在单因子实验的基础上经过正交实验后,以正十二烷发酵生成十二碳二元酸的产酸量从817g/L提高到1082g/L。而其二元酸产品的纯度(>97%)满足工业生产的需要。吐温60010%、尿素012%、维生素B2150μg/L、青霉素150μ/mL、丙氨酸050%的浓度时也对十二碳二元酸产量有促进作用。用一株以UH248为母株诱变筛选的新的优良突变株HP12菌株,在最佳条件下,20m³罐中发酵151h,十二碳二元酸的平均产量达2021g/L。     

烷烃对P450酶的诱导及二元酸发酵工艺改进

α、ω 长链二元酸 (Ｌｏｎｇ ｃｈａｉｎα ,ω ｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃａｃｉｄ ,ＤＣＡ)是一种重要的化工原料 ,是合成工程塑料、香料、耐寒性增塑剂、涂料、液晶等物质的重要原料。目前主要利用热带假丝酵母 (Ｃａｎｄｉｄａｔｒｏｐｌｉｃａｌｉｓ)转化烷烃生产[1,2 ] 。在以往发酵的过程中 ,通常在初始培养液中加入 5 %～10 %的烷烃。且有文献表明在发酵初期加入烷烃有利于产酸的提高。但我们的研究表明 ,在发酵初期加入烷烃也有其不利的一面 ,如高浓度的烷烃对于菌体的生长有一定的抑制作用。而且有实验表明 :适当提高细胞的培养液…