棉花中一个类DREB1/CBF基因(GhDREB1L)的分子克隆及其功能分析

DREB1/CBF类转录因子在植物抵抗外界环境胁迫上起到非常重要的作用, 而且对于利用基因工程技术来提高植物的抗逆性也非常有用. 从棉花中分离出一个编码DREB1/CBF类蛋白(GhDREB1L)的cDNA, 并对该蛋白质的序列特性、DNA结合特性及转录本的表达特征进行了分析. GhDREB1L含有一个保守的AP2/ERF结构域, 其氨基酸序列与其他植物中DREB家族的DREB1/CBF组成员高度相似. 采用Ni-NTA亲和层析技术, 成功纯化了在BL21 (DE3)菌株中表达的GhDREB1L蛋白的DNA结合区. 凝胶滞留实验揭示, 纯化的GhDREB1L融合蛋白能够特异性地与已经得到鉴定的DRE元件(核心区, ACCGAC)以及胚胎发育晚期丰富蛋白基因LEA D113启动子区中的类DRE元件(核心区, GCCGAC)结合. 半定量RT-PCR显示GhDREB1L基因在棉花子叶中受到低温、干旱以及NaCl处理的诱导. 这些结果暗示了棉花GhDREB1L转录因子可能是通过与DRE元件的结合, 在低温、干旱及高盐的应答途径中起重要作用.     

ACA基因启动子的克隆及功能初探

根据已知的ACA基因的 5 '端序列设计三个基因特异的反向引物 (GSP-1,GSP-2 ,GSP-3)分别与 11个简并引物 (AD1-AD11)配对 ,进行热不对称嵌套PCR(ThermalasymmetricinterlacedPCR ,TAIL-PCR)扩增 ,获得了ACA基因起始密码子上游约700bp的片段。为检测其表达特性 ,构建了该片段与Gus嵌合基因的表达载体pBpAG ,在真空条件下通过农杆菌介导 ,转化了植物的叶、果实、种子三种不同组织 ,Gus瞬时表达染色结果显示 ,该DNA片段具有种子特异的启动子活性。对该启动子的一些顺式元件进行了讨论。     

棉花nodulin-like基因及其启动子的结构特征和遗传表达

用同尾酶反向PCR技术(Ⅱ-PCR)和快速分离目的基因cDNA 5'未知序列方法(RICUP)首次从陆地棉品种Y18(Gossypium arboreum L.Y18)中分离到nodulin-like基因的全长cDNA、DNA和启动子序列.结果表明,该基因全长为2 353 bp,具有5个内含子和6个外显子.cDNA全长1480 bp,含有一个1125 bp的ORF结构,编码375个氨基酸,在GenBank nr数据库中没有与之同源的基因序列,在EST数据库中仅有一条733 bp的亚洲棉纤维EST序列(GenBank登录号:BF271235)与之有92%的同源性.Nodulin-like基因的启动子全长1 969 bp,启动子区域具有Initiator、TATA box、CAAT-like box和富含AT序列等启动子特征序列.Southern blot结果表明:该基因在棉花基因组中有一个拷贝.Northern blot结果表明:该基因在棉花的蕾、花、纤维和铃壳等生殖器官中呈优势表达.本研究有望为改良棉花生殖器官的农艺性状提供靶基因,并为解决目前转基因抗虫棉"前期抗虫性强、后期抗虫性弱"这一生产实际问题提供有效的表达调控元件.     

DNA错配修复基因mutS的高效表达及表达产物活性鉴定

将DNA错配修复基因mutS（2.56kb）克隆于分泌型原核表达载体pET32a（+）上,以N端融合6个组氨酸的形式在E.coliAD494(DE3) 中进行了IPTG诱导表达。SDSPAGE分析证实有一与预期分子量相应的诱导表达条带,其表达量占全菌蛋白质的35％左右,且表达蛋白以可溶形式存在。利用固定化金属离子（Ni²⁺）配体亲和层析柱纯化目的蛋白,其纯度为90％以上。与含有错配碱基DNA双链的结合反应证明该蛋白具有特异性识别、结合含有错配碱基DNA双链的生物活性。     

控制基因盐诱导且根系优势表达的小麦启动子Tasipro3克隆及功能分析

在土壤盐胁迫下,小麦根系吸收水分和营养物质的功能受到抑制,从而影响植株的经济产量。因而,开展小麦耐盐育种,提高根系耐盐性是重要途径之一。使耐盐基因在根系中优势表达,并且在盐胁迫下增强表达,将显著提高根系耐盐性。而克隆和鉴定具有双重控制功能的启动子,是实现耐盐基因精准调控的基础。鉴于此,本研究利用Genevestigator在线生物信息学分析软件,筛选到425个盐诱导根系优势表达的探针,并从中选出2个候选探针,用于启动子验证。以1周龄小麦品种中国春的幼苗为材料,将其根系置于200 mmol/L的NaCl溶液中,分别于0 h、0.5 h、1 h、2 h、4 h和8 h进行根系取样,用于表达模式分析。结果表明,Ta.5463.1.A1_at探针的基因表达模式更符合生物信息学预测的结果,受盐胁迫诱导表达显著上调,且基因优势表达于根系。为进一步验证相应基因启动子的功能,对此探针对应的启动子区进行了克隆,并连接到启动子验证载体中,遗传转化获得转基因拟南芥植株。盐诱导后GUS染色的实验结果表明,该启动子使GUS报告基因在盐处理下表达量显著提高,且主要在根系表达。本研究成功克隆了耐盐遗传改良专用启动子,为小麦分子抗逆育种提供了优异资源。     

绵羊Myostatin基因启动子的功能分析

相比于Myostatin基因的作用机制而言, 对Myostatin基因转录和表达的调控机制了解很少. 为了更好地了解Myostatin基因5’调控区的结构和功能, 深入研究Myostatin基因的转录调控机制, 在最近的研究中克隆了绵羊Myostatin基因的启动子(Pro)序列(GenBank 登录号为AY918121). 进一步以EGFP为报告基因, 构建了各种长度的野生型MSTNPro^W-EGFP载体和E-box元件突变型MSTNPro^EM-EGFP载体, 通过转染C2C12小鼠骨骼肌成肌细胞系或绵羊成纤维细胞后, 对各种情况下EGFP的瞬时或稳定表达进行荧光定量分析而比较不同条件下绵羊Myostatin基因启动子的转录调控活性. 结果表明, 0.3~1.2 kb的绵羊Myostatin基因启动子都能不同程度地驱动EGFP在C2C12细胞中的转录和表达, 其中1.2 kb片段的转录调控活性最高. 然 而, 将绵羊1.2 kb MSTNPro^W-EGFP载体转染绵羊成纤维细胞后并未观察到EGFP的表达, 说明Myostatin基因表达的肌肉特异性源于启动子的转录特异性. 对稳定转染绵羊1.2 kb MSTNPro^W-EGFP载体的C2C12细胞进行荧光分析, 结果表明细胞生长密度的增加可以反馈性抑制Myostatin基因的转录和表达. 在C2C12分化状态下, 1.2 kb野生型绵羊Myostatin基因启动子的活性比成肌状态时显著升高, 而1.2 kb E(3+5+7)突变型Myostatin基因启动子的活性在C2C12分化前后并未表现出差别. 这一结果暗示肌肉调控因子MyoD可能是通过与E-box结合而引起Myostatin基因在C2C12分化和生长状态时转录和表达差异的一个原因.     

棉花微管蛋白基因GhTub1在纤维细胞中的特异表达

以陆地棉(Gossypium hirsutum )纤维发育前期和中期的胚珠及纤维细胞为材料构建cDNA文库, 通过ESTs分析获得了一个β-微管蛋白家族成员(GhTub1). 以该cDNA的3′-UTR为探针, 利用Northern杂交方法, 对GhTub1基因在棉花不同器官及棉纤维不同发育阶段的表达进行了分析, 发现该基因的表达具有棉纤维细胞特异性. 在纤维发育过程中, GhTub1转录产物的累积主要发生在纤维细胞延伸阶段, 在纤维延伸速度最快时达到高峰. 利用裂殖酵母系统, 对GhTub1的细胞内功能进行了初步分析, 发现该基因在酵母中过量表达能使其细胞显著伸长或分支. 这些实验结果暗示GhTub1基因可能在纤维细胞的极性延伸中具有功能.     

棉花nodulin—like基因及其启动子的结构特征和遗传表达

用同尾酶反向PCR技术(Ⅱ-PCR)和快速分离目的基因cDNA　5'未知序列方法(RICUP)首次从陆地棉品种Y18　(Gossypium　arboreum　L.　Y18)中分离到nodulin-like基因的全长cDNA、DNA和启动子序列。结果表明,该基因全长为2　353　bp,具有5个内含子和6个外显子。cDNA全长1　480　bp,含有一个1　125　bp的ORF结构,编码375个氨基酸,在GenBank　nr数据库中没有与之同源的基因序列,在EST数据库中仅有一条733　bp的亚洲棉纤维EST序列(GenBank登录号:BF271235)与之有92%的同源性。Nodulin-like基因的启动子全长1　969　bp,启动子区域具有Initiator、TATA　box、CAAT-like　box和富含AT序列等启动子特征序列。Southern　blot结果表明:该基因在棉花基因组中有一个拷贝。Northern　blot结果表明:该基因在棉花的蕾、花、纤维和铃壳等生殖器官中呈优势表达。本研究有望为改良棉花生殖器官的农艺性状提供靶基因,并为解决目前转基因抗虫棉“前期抗虫性强、后期抗虫性弱”这一生产实际问题提供有效的表达调控元件。     

启动子诱捕在棉花基因组中的功能分析

利用根癌农杆菌介导的遗传转化,将启动子诱捕（Promoter trapping）元件插入到棉花基因组,获得141个独立的转化子,其中97％的转化子经PCR扩增为阳性。不同组织中GUS基因的表达频率为：根部48％,茎的微管组织9．2％,叶5．2％,花51％;同时检测了不同植株中GUS基因的表达模式,发现GUS基因在不同株系的植株间的表达模式呈现较大的差异,有些植株中GUS基因是组织特异表达,有些则是器官特异表达,有些则在多个器官中均有表达。所建立的启动子诱捕系统中的GUS基因高频率、多模式和时空特异性表达为分离基因及其调节序列、开展功能基因组研究奠定了坚实的基础。     

拟南芥AtNHX6基因启动子的克隆及表达分析

为了探明拟南芥内膜反向转运体AtNHX6基因的组织表达模式,从基因组中克隆了AtNHX6基因开放阅读框(ORF)上游侧翼调控区1 922bp序列,并成功构建AtNHX6基因启动子与GUS融合表达载体pCAM-BIA1381-proNHX6-GUS,通过农杆菌花序浸染法转化野生型拟南芥获得T3代纯合转基因拟南芥株系,经PCR检测扩增得到2 187bp目的条带。利用组织染色法鉴定转基因拟南芥的GUS表达模式发现,在子叶、下胚轴和花中GUS活性显著。在这些广泛表达的部位中,微管系统中的表达最为显著,真叶中只有局部检测到GUS表达;在根中GUS在根毛和侧根生长部位表达;在未成熟果荚中只有在果荚顶端和基部存在GUS活性,成熟果荚中只在果柄检测到GUS表达;在花中,雄蕊的花丝和花粉粒及雌蕊的柱头中检测到GUS表达。GUS染色分析结果表明,AtNHX6基因启动子与GUS的融合表达载体成功构建并正常启动GUS基因表达,且AtNHX6基因主要在拟南芥的子叶、下胚轴、根、花、果荚中的微管系统、根毛和侧根生长部位以及花丝、花粉、柱头中表达。     

抗草甘膦抗虫植物表达载体的构建及其转基因烟草的分析

构建了含草甘膦抗性突变基因（aroAM12）和人工合成重组Bt抗虫基因（Bts1m）的植物表达载体pCM12_s1m。aroAM12基因的表达由CaMV35S启动子控制,Bts1m基因的表达由2E_CaMV35S启动子和Ω因子控制。通过农杆菌介导,将aroAM12和Bts1m基因转化到烟草中,转基因烟草通过在含草甘膦的MS培养基上筛选而获得。Southern blot分析表明所有经过草甘膦筛选出的转化植株都整合有aroAM12基因,约70%的转化植株同时整合有aroAM12和Bts1m基因。Northern blot、Immunodot blot分析进一步证明整合的两个基因在转录、翻译水平上均进行了表达,不同植株之间表达存在着差异。草甘膦抗性和虫试实验证明,获得的转基因烟草对草甘膦和烟青虫具有很强的抗性。     

p53对restin基因转录表达的调控作用

restin基因是Zhu等人从全反式维甲酸(all-trans retinoic acid, ATRA)诱导肿瘤细胞分化时克隆得到的一种黑色素瘤抗原相关基因. 前期研究表明, 该基因与细胞周期阻滞有关. 由于p53在细胞增殖调控中占据重要地位, 并且与维甲酸具有诱导关系, 因此本研究试图揭示维甲酸诱导restin基因表达是否与p53有关. 将p53转染真核细胞, 研究restin与p53的表达关系. 结果表明p53能诱导restin基因转录增加. 进一步分析发现, restin基因5¢端上游约2 kb基因组序列中存在p53蛋白结合位点. 扩增该序列构建荧光报告系统, 检测到该报告系统可以接受维甲酸的诱导调控. 在此基础上, 研究p53对缺失p53结合位点的截短体报告质粒和p53结合位点突变后的报告质粒的作用, 结果显示p53调控restin基因的表达与该基因上游序列区中的p53结合位点无关, 推测p53对restin基因的表达调控可能还存在其他分子的相互作用.     

水曲柳节律基因LHY启动子的克隆和功能分析

以水曲柳基因组DNA为模板,用Site Finding-PCR法扩增得到节律基因LHY（late elongated hypocotyl）启动子序列,长度为1 360 bp。PLACE启动子预测工具分析表明,序列中含有转录必备的TATA box、CAAT box以及一些非生物胁迫和激素响应元件等。构建植物GFP瞬时表达载体p PXGFP-P-LHY,农杆菌介导转化烟草叶片和白桦悬浮细胞,GFP检测结果表明,LHY启动子能够启动GFP基因在烟草和白桦细胞中表达,且对非生物胁迫（低温、高温、盐）产生响应;构建植物GUS报告基因整合表达载体p PCXGUS-P-LHY,农杆菌介导法瞬时转化烟草,GUS染色结果表明,LHY启动子的活性具有不同程度的时空特性。     

一个光合组织特异表达强启动子的分离及功能分析

用接头PCR技术克隆了长度为1415 bp的PNZIP基因启动子, 该启动子具有真核生物启动子的典型特征, 引物延伸实验证明转录起始位点位于翻译起始位点上游122 bp处. 根据PNZIP基因启动子的序列特征, 利用PCR技术对该启动子进行了有目的的缺失, 将5个长度不同的启动子片段分别与报告基因GUS相连接, 构建植物表达载体, 转化烟草. 荧光定量检测结果表明: 5个不同长度的PNZIP启动子均能驱动GUS基因在光合组织中专一表达, 它们的活性随着启动子5′端的逐步缺失而不断地下降; 在叶片组织中长度为1415 bp的PNZIP启动子活性比35S启动子高9倍; PNZIP启动子中存在2个可能与光合组织特异表达有关的新的顺式作用元件, 即GAAATA和GATACT, GATACT元件可能决定基因的光合组织特异性表达, 而GAAATA可能作为增强子提高基因在光合组织的表达强度.     

Paenibacillus massiliensis T7固氮基因簇nifBHDKENX的克隆、序列分析及铵和氧对nifB启动子的调控

Paenibacillus massiliensis T7是我室从北京郊区分离的一株革兰氏阳性、产芽孢的固氮菌. 根据GenBank中已发表的多种固氮生物nifH基因序列, 在其保守区域设计一对简并引物, PCR扩增获得324 bp的nifH片段. 用地高辛标记该片段为探针, 对EcoRⅠ和PstⅠ消化的P. massiliensis T7染色体DNA进行Southern杂交, 结果DNA/EcoRⅠ杂交道1.1 kb和9 kb处, DNA/PstⅠ杂交道1.3 kb和8 kb处分别有两条杂交带, 从而初步判断nifH可能有两个拷贝. 在324 bp nifH片段的基础上, 采用反向PCR扩增的方法, 获得了purD和nifBHDKENX基因. 在nifB的上游有一个类似σ⁵⁴型启动子的保守序列, 在该启动子上游有一个类似激活蛋白NifA结合位点. 分析表明, nifBHDKENX可能组成一个转录单元, 共用nifB上游的启动子. 将nifB启动子与报告基因lacZ相融合, 构建成表达载体pnifB-LacZ, 并转化到P. massiliensis T7中, 研究铵和氧对该启动子的表达调控. 结果表明, 在无氧条件下, 铵浓度为0%时, β-半乳糖苷酶的活性最高, 随着铵浓度的增加, 酶活性并没有明显的下降过程, 即使铵浓度达80 mmol/L时, 酶活也相当于无铵时的73.12%, 说明铵对nifB启动子有微弱的抑制作用, 而铵浓度一定, 氧浓度3%时, β-半乳糖苷酶活性最高, 提高氧浓度则酶活性开始下降, 当氧浓度高于20%时, β-半乳糖苷酶活性仅几个Miller单位, 说明氧对nifB启动子有明显的抑制作用.     

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)半乳糖可诱导表达系统特性的研究

把大肠杆菌β一半乳糖苷酶基因克隆到带有酵母半乳糖可诱导启动子GALl的穿梭表达质粒pYES2中,并把得到的重组质粒分别转化到两种不同遗传性状的宿主菌中,其中一株菌为蛋白酶活性缺失90％以上的pep4-3突变菌株。通过比较两株重组菌产生的β一半乳糖苷酶活性水平发现在所述实验条件下,蛋白酶缺失突变菌株中产生的β一半乳糖苷酶活水平不仅均要高于另一对照菌株,并且pep4-3突变菌株表现出受葡萄糖阻遏的严紧程度高及对诱导反应迅速等特点。此外,带有重组质粒的pep4-3突变菌株在葡萄糖阻遏培养基中最大生长量和重组对照菌株基本相同,但β一半乳糖苷酶在pep4-3突变菌株中的表达对细胞生长的影响明显小于对照菌株。     

NAC1上游调控区表达特征及其与侧根激素诱导的关系

从拟南芥(Arabidopsis thaliana）中克隆到与侧根原基发生相关的转录因子基因NAC1上游调控区序列,构建由该序列驱动β-葡聚糖苷酶基因(GUS)的植物表达载体并转化烟草(Nicotiana Tabaccum),经筛选获得了在根组织高GUS活性而地上部痕量表达的转基因烟草植株。对转基因植株进行GUS活性和染色分析,结果表明NAC1上游调控区驱动的GUS基因表达具有根部组织特异性,在侧根顶端分生组织区、侧根原基基部和幼嫩侧根基部表达。用IBA,GA₃,GA₄₊₇处理转基因植株根部,NAC1上游调控区驱动的GUS表达均增强,表明生长素、赤霉素可显著诱导NAC1上游调控区的表达,并参与侧根发生的调控。     

棉花半乳糖苷酶基因启动子的分离及其在转基因烟草中的表达

β-半乳糖苷酶(β-galactosidase, EC 3.2.1.23)由植物中广泛分布的一类糖基水解酶组成, 被认为与细胞壁多糖的代谢相关. 棉花(Gossypium hirsutum) β-半乳糖苷酶基因已被成功分离, 被命名为GhGal1. RNA杂交实验显示该基因在棉花纤维发育的伸长期优势表达. 为了分析GhGal1基因的时空表达调控, 本研究构建了GhGal1启动子区域(1770 bp)与β-葡糖醛酸糖苷酶(glucuronidase, GUS)基因融合的双元载体, 通过农杆菌转化烟草植株. 对转基因植株分析的结果表明: 此转基因果实中的GUS活性比阴性和阳性对照的活性高. GUS组织定位分析表明: β-半乳糖苷酶基因能在根组织的分生区、子叶、维管束组织、果实和表皮毛中表达. 此外, 调控区域的序列分析揭示该序列含有一些果实/种子特异表达以及与表皮毛表达相关的保守元件. 这些结果显示了GhGal1启动子在转基因烟草植株中的时空表达特征, 并提供了GhGal1基因参与棉花纤维发育的一些重要线索.     

棉花抗枯萎病相关转录因子基因的克隆与表达

以枯萎病菌诱导棉花基因表达谱中获得的差异表达bZIP作为探针,采用电子克隆结合RT-PCR方法从棉花抗枯萎病品种‘中棉所12’中克隆了1个TGA转录因子基因,命名为GhTGA2.2。序列分析表明,该基因的cDNA全长1 356bp,编码451个氨基酸,预测分子量为50.04kD,等电点为5.85,含有保守的bZIP结构域。系统进化树分析表明,GhTGA2.2属于bZIP亚家族的TGA转录因子,与拟南芥AtTGA2、烟草NtTGA2.2亲缘关系最近。qRT-PCR分析表明,经枯萎病菌诱导后,GhTGA2.2基因在抗病品种中呈上调表达,随处理后时间的推移,其相对表达量呈先升高后降低的趋势,并于处理后24h表达量达到最大;水杨酸诱导后1h,GhTGA2.2基因相对表达量迅速增加;茉莉酸和乙烯诱导后GhTGA2.2基因的相对表达量明显降低,呈下调表达。研究推测,GhTGA2.2基因可能通过水杨酸信号传导途径参与对枯萎病菌的防御反应。     

水稻Xa1基因启动子的克隆及功能分析

Xa1是一个能对日本白叶枯病优势小种(小种1号)产生专化性抗性的R基因,虽已有该基因克隆、表达和功能方面的研究,但对其表达调控分子机制还不很清楚。本研究利用Xa1启动子与GUS报告基因的转基因T1株系,研究了Xa1启动子的时空表达及对不同外源激素的应答特征。结果表明,Xa1启动子驱动的GUS基因在水稻根中的表达量明显高于茎和叶,且在根部的中柱区GUS的表达量明显高于周围组织;在外源MeJA作用下GUS的表达显著增强,在SA和ABA处理下也有一定程度的增强,这些结果暗示Xa1的抗病作用与其在根系中柱的组织特异性表达存在一定的相关性,MeJA对Xa1启动子的活性起重要的调控作用。