用表面等离子体共振技术筛选与禽流感病毒基质蛋白M1相互作用的蛋白

目的：筛选与禽流感病毒基质蛋白M1相互作用的蛋白。方法：表达禽流感病毒基质蛋白M1,经Ni^2＋柱亲和层析纯化,用表面等离子体共振（SPR）技术捕获BHK-21细胞裂解液中与M1相互作用的细胞蛋白,并进行质谱分析。结果：获得了纯度在85%以上的基质蛋白M1,并利用此蛋白捕获到宿主细胞肌球蛋白重链6。结论：肌球蛋白重链6与禽流感病毒基质蛋白M1可能存在体外相互作用。     

禽流感病毒M1蛋白的表达及其免疫反应性分析

根据已发表的禽流感病毒M1基因序列设计合成PCR克隆引物,自接种H5N1亚型病毒的鸡胚组织中提取RNA,反转录后采用高可信度DNA聚合酶(PyobestTMDNA Polymerase)经PCR扩增M1基因,采用Invitrogen定向表达系统(ChampionTMpET directional TOPO expression system)进行克隆表达,纯化获得N末端携带多聚组氨酸标签的重组蛋白,分子量约29.8 kDa。采用单克隆抗体和阳性血清经ELISA、阻断ELISA、免疫印迹分析重组蛋白的免疫反应性。结果发现:重组M1蛋白能与单克隆抗体和阳性血清发生特异性结合,且此结合能被天然病毒抗原阻断。研究表明:重组蛋白M1具有良好免疫反应性。     

A型流感病毒NS1蛋白羧基端PL结构域影响NS1在细胞核内的定位

A型流感病毒NS1蛋白羧基端4个氨基酸可以与PDZ结构域(the domain of PSD95,Dig and ZO-1)相结合,称为PL结构域(PDZ ligand domain)．对不同亚型或毒株的流感病毒而言,其NS1蛋白PL结构域的组成存在比较大的差异．有研究发现这种差异能够影响NS1与宿主细胞蛋白的相互作用进而影响病毒的致病力．为进一步探讨PL结构域对NS1蛋白生物学特性的影响,首先构建出4种不同亚型流感病毒(H1N1、H3N2、H5N1、H9N2)来源的NS1绿色荧光蛋白表达质粒．在此基础上,对野生型H3N2病毒NS1表达质粒进行人工改造,将其PL结构域缺失或者替换为其他亚型流感病毒的PL结构域,制备出4种重组NS1蛋白表达质粒．通过比较上述不同NS1蛋白在HeLa细胞中的定位情况发现,只有野生型H3N2病毒的NS1蛋白可以定位于核仁当中,而野生型H1N1、H5N1、H9N2病毒的NS1蛋白以及PL结构域缺失或替代的H3N2病毒NS1蛋白都不能定位于核仁．而通过比较上述NS1蛋白在流感病毒易感的MDCK细胞中的定位,进一步发现所有这些蛋白均不定位于核仁．上述结果表明：PL结构域的不同可以明显影响NS1蛋白在HeLa细胞核内的定位和分布,这有可能造成其生物学功能的差异．同时,NS1蛋白在细胞核内的定位还与宿主细胞的来源有着密切关系．     

A型流感病毒非结构蛋白NS1与宿主相互作用的研究进展

作为A型流感病毒的非结构蛋白,NS1蛋白是流感病毒的一个重要的毒力因子,决定了病毒在宿主细胞内的破坏作用。概述了NS1蛋白对宿主细胞蛋白合成、宿主细胞凋亡的影响,及其拮抗干扰素的作用。     

流行性感冒病毒M2蛋白可溶性表达及其免疫原性的研究

流行性感冒（流感）的M2蛋白是其保护性抗原之一,在几科所有甲型流感病毒中高度保守,因此可以用来研究具有交叉保护能力的流感疫苗。然而M2分子在病毒颗粒中含量非常少,用从病毒中纯化的方法很难获得足够的免疫原。在原核表达时发现,M2蛋白对宿主菌具有很强的毒性作用,导至其死亡,因此很难获得高表达。在本研究中,采用RT－PCR方法从病毒感染的MDCK细胞中克隆了A1／PR／8／34毒株的M2基因,然后通过基因工程手段缺失了M2蛋白的跨膜区26－55位氨基酸的编码序列,将其克隆以pET-32a中,与硫氧还蛋白融合,在大肠杆菌中获得了高效表达,并且表达产物以可溶形式存在,不形成包涵体。利用硫酸铵盐析结合金属离子鏊和柱亲和层析的方法纯化了表达的融合蛋白。免疫荧光实验表明,融合蛋白免疫小鼠后产生的抗血清能够与流感病毒感染的细胞发生特异性的结合,证明表达产物具有流感病毒M2蛋白的抗原性。     

Matrix proteins of enveloped viruses: a case study of Influenza A virus M1 protein

Influenza A virus, a member of the Orthomyxoviridae family of enveloped viruses, is one of the human and animal top killers, and its structure and components are therefore extensively studied during the last decades. The most abundant component, M1 matrix protein, forms a matrix layer (scaffold) under the viral lipid envelope, and the functional roles as well as structural peculiarities of the M1 protein are still under heavy debate. Despite multiple attempts of crystallization, no high resolution structure is available for the full length M1 of Influenza A virus. The likely reason for the difficulties lies in the intrinsic disorder of the M1 C-terminal part preventing diffraction quality crystals to be grown. Alternative structural methods including synchrotron small-angle X-ray scattering (SAXS), atomic force microscopy, cryo-electron microscopy/tomography are therefore widely applied to understand the structure of M1, its self-association and interactions with the lipid membrane and the viral nucleocapsid. These methods reveal striking similarities in the behavior of M1 and matrix proteins of other enveloped RNA viruses, with the differences accompanied by the specific features of the viral lifecycles, thus suggesting common interaction principles and, possibly, common evolutional ancestors. The structural information on the Influenza A virus M1 protein obtained to the date strongly suggests that the intrinsic disorder in the C-terminal domain has important functional implications.     

甲3型流感病毒M2基因在痘苗病毒天坛株中的表达

为获得表达甲3型流感病毒(H3N2)M2蛋白的重组天坛株痘苗病毒RVJ1175M2,使用PCR方法扩增流感病毒全长M2基因,将其克隆到天坛株痘苗病毒同源重组质粒pJSC1175中,获得重组质粒pJSC1175M2,通过与痘苗病毒载体同源重组,构建了含流感病毒M2基因的重组痘苗病毒株RVJ1175M2。PCR检测结果证明,流感病毒(H3N2)M2蛋白基因准确插入到天坛株痘苗病毒TK区;Western blot、免疫荧光和流式细胞计数表明重组病毒RVJ1175M2可以有效地表达M2蛋白,表达的M2蛋白有两条带,分别为15kD和13kD,与相关文献报道一致;M2蛋白可有效分布在感染细胞的细胞膜上。这些结果表明重组痘苗病毒株RVJ1175M2可以有效地表达流感病毒M2蛋白,为使用表达M2蛋白的不同类型疫苗进行广谱流感疫苗效果的比较研究奠定了基础。     

禽流感病毒H5N1亚型NS1蛋白的研究进展

NS1蛋白（non—structural protein1）是A型流感病毒重要的非结构蛋白,作为流感病毒的致病因子,NS1通过多种方式增强病毒的致病性和毒力。就H5N1禽流感病毒NS1蛋白的结构与功能进行了综述。     

Interaction of influenza A virus M1 matrix protein with caspases

In this investigation, an ability of influenza A virus M1 matrix protein to bind intracellular caspases, the key enzymes of cell apoptosis, has been examined. Protein–protein binding on polystyrene plates and polyvinyl pyrrolidone membrane was employed for this purpose. Under a comparative study of caspases-3, -6, -7, -8 influenza virus M1 protein specifically bound caspase-8 and weakly bound caspase-7. Using a computer analysis of the N-terminal region of M1 protein, a site similar to the anti-caspase site of baculovirus p35 protein, which inhibits caspases and displays antiapoptotic activity, was identified. These results are in good agreement with the supposition that influenza virus M1 protein is involved in a caspase-8-mediated apoptosis pathway in influenza virus infected cells.     

利用靶定基质蛋白基因m的小干扰RNA抑制2009甲型H1N1流感病毒的复制

目的:设计、构建并筛选针对流感病毒基质蛋白基因m的小干扰RNA(siRNA),检测其对2009甲型H1N1流感病毒复制的抑制效果。方法:设计3条针对流感病毒m基因的siRNA,并克隆到短发夹型(shRNA)siRNA表达载体pSilencer2.1-U6-hygro上;经测序证明构建成功后,将表达3种siRNA的质粒和阴性对照质粒psiRNA-control分别转染MDCK细胞,用潮霉素筛选稳定表达细胞株,用H1N1流感病毒感染细胞,通过Real-time PCR和Western印迹检测干扰效果。结果:构建了3个针对流感病毒m基因的siRNA表达质粒,3种siRNA均使m基因的mRNA水平降低,其中M1-306的抑制效率达60%;3种siRNA均使流感病毒NA蛋白的表达量降低,M2-25、M1-105的抑制效率明显,M1-306略低。结论:针对m基因的siRNA可以有效抑制流感病毒在MDCK细胞中的复制。     

H9N2禽流感病毒M2 DNA疫苗初免-蛋白加强免疫的保护效果研究

流感病毒M2(基质蛋白2)是A型流感病毒的一个高度保守的蛋白。由于其免疫原性较弱,本研究采用M2 DNA疫苗初免-蛋白加强的策略来考察M2的免疫保护效果。制备A/Chicken/Jiangsu/07/2002(H9N2)流感病毒的M2 DNA疫苗以及经大肠杆菌表达的去除M2跨膜区的M2蛋白即sM2。以SPF级BALB/c小鼠为模型,电击法免疫M2 DNA疫苗,滴鼻法免疫sM2蛋白,免疫间隔三周,并于末次免疫后三周以致死量5LD50流感病毒H9N2攻击小鼠,通过检测小鼠存活率、体重丢失率、肺部病毒滴度及IgG抗体水平等指标来评价免疫的保护效果。实验结果表明,基于M2的疫苗采用DNA疫苗初免蛋白加强免疫二次的免疫程序能诱导较高的特异性抗体,明显减轻小鼠流感病症,提供完全的保护。     

GST pull-down验证流感病毒PB1-F2蛋白与热休克蛋白40的相互作用

为体外验证流感病毒PB1-F2与热休克蛋白Hsp40相互作用,通过两个方向的GST pull-down试验验证PB1-F2与Hsp40的相互作用。构建GST-多肽融合蛋白原核表达载体pGEX-6P-1-PB1-F2和pGEX-6P-1-Hsp40,并在大肠杆菌(E.co-li)BL21中诱导表达;构建真核表达载体pLEGFP-Hsp40及pCAGGS-PB1-F2,并分别转染293T细胞使其表达Hsp40及PB1-F2融合蛋白,然后进行GST pull-down试验验证二者的相互作用。成功地构建了两种蛋白的各种表达载体,经表达、纯化获得了可溶性的GST-多肽融合蛋白,GST pull-down试验正反两方向都证实了PB1-F2与Hsp40的相互作用,初步证实了流感病毒PB1-F2在体外能与Hsp40发生相互作用。     

甲型流感病毒M2e通用疫苗的研究进展

流感严重地影响人们的身体健康和工作生活,给社会带来巨大经济损失。疫苗接种是预防流感的有效措施之一,市场上的流感疫苗包括流感灭活疫苗、减毒活疫苗和亚单位疫苗等。这些流感疫苗只能预防相同亚型流感病毒的感染,无法预防不同亚型流感病毒引起的季节性流感和流感大流行,因此迫切需要研发广谱的能预防不同亚型的甲型流感病毒感染的通用疫苗。在此简要介绍甲型流感病毒M2e通用疫苗的研究进展。     

A型流感病毒非结构蛋白的功能及临床应用

NS1蛋白作为A型流感病毒的非结构蛋白,最初的研究着重于它对宿主细胞蛋白质合成的抑制作用方面考虑.随着研究的深入,对其基因的进化、蛋白质的抗原性作了详细的研究,同时发现流感病毒的NS1蛋白与流感病毒所诱导的细胞凋亡之间存在一定的联系,其对凋亡的调节作用与流感病毒感染的细胞是否产生干扰素及其所感染的细胞系直接相关.NS1蛋白能够抑制病毒感染细胞干扰素的产生,在流感病毒拮抗干扰素的抗病毒效应中发挥了重要的作用,许多研究表明,这种干扰素拮抗作用可能与流感病毒的毒力有关.由于传统疫苗的广泛应用,NS1蛋白在临床应用中作为鉴别诊断免疫禽和自然感染禽的检测抗原具有广阔的前景.     

利用大肠杆菌表达禽流感病毒聚合酶酸性蛋白

目的：通过在大肠杆菌中分段表达禽流感病毒聚合酶酸性蛋白（PA蛋白）,探索PA基因中可能影响表达的区域。方法：构建分段缺失的PA蛋白突变体,用IPTG在大肠杆菌RosettaGamiB（DE3）中诱导表达,比较各突变体的表达效率。结果：N端缺失长度在143～408个氨基酸残基之间的9个突变体在大肠杆菌中的表达水平较高;而突变体PA/K（Δ1-40aa）、PA/M（Δ1-56aa）、PA/N（Δ41-56aa）和PA/P（Δ57-75aa）的表达水平很低;全长PA蛋白和缺失N端20个氨基酸残基的突变体PA/L则检测不到表达。结论：PA基因的61～225bp和325～426bp可能是影响PA蛋白表达的2个重要区域,为下一步表达全长PA蛋白奠定了基础。     

新的猪源性甲型H1N1流感病毒

2009年3月在美国和墨西哥流感样患者的呼吸道标本中鉴定出新的猪源性甲型H1N1流感病毒。该病毒可人一人传播,已蔓延到172个国家和地区。现就猪源性甲型H1N1流感病毒的鉴定、基因组结构特征做一综述。     

Amyloid Assemblies of Influenza A Virus PB1-F2 Protein Damage Membrane and Induce Cytotoxicity

PB1-F2 is a small accessory protein encoded by an alternative open reading frame in PB1 segments of most influenza A virus. PB1-F2 is involved in virulence by inducing mitochondria-mediated immune cells apoptosis, increasing inflammation, and enhancing predisposition to secondary bacterial infections. Using biophysical approaches we characterized membrane disruptive activity of the full-length PB1-F2 (90 amino acids), its N-terminal domain (52 amino acids), expressed by currently circulating H1N1 viruses, and its C-terminal domain (38 amino acids). Both full-length and N-terminal domain of PB1-F2 are soluble at pH values ≤6, whereas the C-terminal fragment was found soluble only at pH ≤ 3. All three peptides are intrinsically disordered. At pH ≥ 7, the C-terminal part of PB1-F2 spontaneously switches to amyloid oligomers, whereas full-length and the N-terminal domain of PB1-F2 aggregate to amorphous structures. When incubated with anionic liposomes at pH 5, full-length and the C-terminal part of PB1-F2 assemble into amyloid structures and disrupt membrane at nanomolar concentrations. PB1-F2 and its C-terminal exhibit no significant antimicrobial activity. When added in the culture medium of mammalian cells, PB1-F2 amorphous aggregates show no cytotoxicity, whereas PB1-F2 pre-assembled into amyloid oligomers or fragmented nanoscaled fibrils was highly cytotoxic. Furthermore, the formation of PB1-F2 amyloid oligomers in infected cells was directly reflected by membrane disruption and cell death as observed in U937 and A549 cells. Altogether our results demonstrate that membrane-lytic activity of PB1-F2 is closely linked to supramolecular organization of the protein.     

一株H5N1亚型禽流感病毒的分离与鉴定

2004年1月湖北宜昌某鸡场暴发疫病,从该鸡场濒死鸡肺组织中分离到了一株病毒,电镜切片观察到典型的禽流感病毒粒子;采用ELISA检测禽流感抗原为阳性;RT-PCR扩增HA、NA基因并测序,经BLAST分析,HA基因与A／Goose／Guangdong／1／96(H5N1)HA基因同源性为97％;NA基因与A／Goose／Guangdong／1／96(H5N1)NA基因同源性为96％,确定该分离株为禽流感病毒H5N1亚型(A／Chicken／Yichang／Lung-1／04(H5N1))。     

Influenza virus matrix protein M1 interacts with SLD5 to block host cell cycle

Influenza virus matrix 1 protein (M1) is highly conserved and plays essential roles at many stages of virus life cycle. Here, we used a yeast two‐hybrid system to identify the host protein SLD5, a component of the GINS complex, which is essential for the initiation of DNA replication in eukaryotic cells, as a new M1 interacting protein. M1 from several different influenza virus strains all interacted with SLD5. Overexpression of SLD5 suppressed influenza virus replication. Transient, stable, or inducible expression of M1 induced host cell cycle blockade at G0/G1 phase. Moreover, SLD5 partially rescued M1 expression‐ or influenza virus infection‐induced G0/G1 phase accumulation in cell lines and primary mouse embryonic fibroblasts. Importantly, SLD5 transgenic mice exhibited higher resistance and improved lung epithelial regeneration after virus infection compared with wild‐type mice. Therefore, influenza virus M1 blocks host cell cycle process by interacting with SLD5. Our finding reveals the multifunctional nature of M1 and provides new insight for understanding influenza virus–host interaction.     

A型流感病毒H5N1的M2离子通道稳定细胞株的建立

A型流感病毒H5N1的M2离子通道(H5M2)基因经优化后由人工合成,适合于哺乳动物细胞中表达.通过酶切克隆于pcDNA4质粒,并在HEK293细胞中建立稳定细胞株.Western blotting和免疫荧光证实H5M2在稳定细胞中只有在四环素诱导下才能表达,并经膜片钳证实在HEK293细胞中表达的H5M2具有H 通道活性,为M2离子通道功能的研究和M2离子通道阻断剂筛选方法的建立提供了参考.