小鼠层粘连蛋白α5链LG1-3组件的原核表达及多克隆抗体制备

目的:用原核表达的方法获得带有6个His标记的小鼠层粘连蛋白α5链LG1-3组件的重组蛋白,并制备其多克隆抗体。方法:利用RT-PCR技术,从小鼠心肌组织中扩增出小鼠层粘连蛋白α5链LG1-3组件cDNA片段,将该片段与原核表达载体pET-28a连接,构建重组表达质粒pETLG1-3并转化大肠杆菌BL21(DE3)获得重组表达菌株。用IPTG诱导重组大肠杆菌BL21(DE3)/pETLG1-3表达,SDS-PAGE分析表明在相对分子质量60000处有特异性重组蛋白表达条带,并经Western印迹进一步鉴定。用含融合蛋白的聚丙烯酰胺凝胶颗粒免疫家兔,制备抗小鼠层粘连蛋白α5链LG1-3组件多克隆抗体,ELISA方法检测抗体滴度。结果:从小鼠心肌组织中克隆了层粘连蛋白α5链LG3组件的基因,并在大肠杆菌得以表达和纯化;制备了重组蛋白的多克隆抗体,其滴度可达到1∶10240。结论:小鼠层粘连蛋白α5链LG1-3组件重组蛋白及其多克隆抗体的获得,为后续研究其功能打下了基础。     

人层粘连蛋白α4链LG3组件的克隆、测序及在原核细胞中的表达

用Trizol法提取胎盘组织总RNA,通过RTPCR方法获得人层粘连蛋白α4链LG3组件的特异扩增产物。将PCR产物克隆入PMD18T载体中,PCR与酶切鉴定正确后进行序列测定。用测序正确的克隆片段与原核表达载体PET28a进行体外重组,构建了LG3的原核表达载体,并在BL21(DE3)菌株中得到了表达。     

人层粘连蛋白α4链LG3组件在克隆、测序及在原核细胞中的表达

用Trizol法提取胎盘组织总RNA,通过RT-PCR方法获得人层粘连蛋白α4链LG3组件的特异扩增产物,将PCR产物克隆入PMD-18T载体中,PCR与酶切鉴定正确后进行序列测定,用测序正确的克隆片段与原核表达载体PET-28a进行体外重组,构建了LG3的原核表达载体,并在BL21（DE3）菌株中得到了表达。     

胆管癌组织中层粘连蛋白及67KDa层粘连蛋白受体的表达及其临床意义

目的 探讨层粘连蛋白及67KDa层粘连蛋白受体的表达与胆管癌临床病理学行为的关系。方法 应用S-P免疫组化法对52例人胆管癌组织中层粘连蛋白及67KDa层粘连蛋白受体的表达水平进行研究。结果 层粘连蛋白及67KDa层粘连蛋白受体的高表达与胆管癌淋巴结转移呈明显相关,层粘连蛋白及67KDa层粘连蛋白受体阳性肿瘤淋巴结转移率（83％,55％）明显高于层粘连蛋白及67KDa层粘连蛋白受体阴性肿瘤（15％,20％,P〈0．05）,且层粘连蛋白及67KDa层粘连蛋白受体的表达与胆管癌组织学类型、分化程度亦存在明显相关（P〈0．05）。结论 层粘连蛋白及67KDa层粘连蛋白受体的表达在胆管癌淋巴结转移中起协同作用。     

层粘连蛋白基因家族在猪多能干细胞中的表达谱分析

层粘连蛋白(Laminin)是细胞外基质的重要成分,对细胞生长、分化、运动、组织修复和再生等发挥重要调节作用。Laminin包括有A1-5、B1-4和C1-3共12个编码基因,以不同的表达模式发挥功能。其中Laminin A5作为可以支持多能细胞生长的重要基因,得到广泛研究。但是,在所有猪相关数据库中,均未能查到Laminin A5的信息。文中通过生物信息学分析,首次确认了猪Laminin A5的存在,并进行了克隆和测序验证。为揭示Laminin基因家族在猪诱导多能干细胞(i PSCs)中的表达特性,检测了Laminin在猪各组织、体细胞和i PS细胞中的不同表达模式。发现Laminin B1基因在猪多能干细胞中存在特异性可变剪接体(LAMB1-a),且该可变剪切体的表达量与猪多能干细胞的重编程程度呈正相关。为进一步揭示和利用Laminin作为细胞外基质,用于猪多能干细胞的获取和培养优化奠定了基础。     

人趋化因子MIP-3α的原核可溶性表达及趋化活性分析

目的:克隆人趋化因子MIP3α,进行原核表达并初步鉴定其趋化活性。方法:从人扁桃体中提取总RNA,进行RTPCR,扩增MIP3α成熟蛋白基因,重组于pET32a( )载体,转化大肠杆菌BL21TrxB(DE3),进行融合表达,Westernblot验证融合蛋白,金属离子亲和层析,肠激酶酶切,弱阳离子交换层析,得到纯化的MIP3α蛋白,趋化试验鉴定其趋化活性。结果:成功构建了MIP3α天然蛋白的硫氧还蛋白融合表达载体,表达并纯化出MIP3α蛋白,Westernblot证明融合蛋白能与羊抗人MIP3α抗体结合,纯化的MIP3α蛋白能趋化HEK293CCR6稳定转染细胞。结论:构建的天然MIP3α融合表达载体以可溶性蛋白的方式稳定表达MIP3α,初步纯化得到的MIP3α具有趋化HEK293CCR6稳定转染细胞的活性。     

小鼠cofilin2蛋白的原核表达及纯化

[目的]构建小鼠cofilin2原核表达载体并纯化表达产物。[方法]以胚胎期小鼠心脏组织的c DNA为模板PCR扩增cofilin2基因,经酶切连接表达载体PGEX-4T-1后转化入大肠杆菌E. coli BL21感受态细胞中,利用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达及优化,利用SDS-PAGE凝胶电泳,考马斯亮蓝R-250进行染色,检测GST-cofilin2的表达情况。通过谷胱甘肽树脂(Glutathione Resin)亲和层析进行纯化,最后通过Western Blot进行验证。[结果]PCR成功扩增cofilin2基因,双酶切及测序结果表明p GEX-4T-1-cofilin2原核表达载体构建成功,SDS-PAGE鉴定表明,在22℃、200μmol/L的IPTG能诱导出大量可溶性的GST-cofilin2蛋白,分子量为43 k Da。Western Blot验证得到纯化的GST-cofilin2。[结论]成功构建小鼠cofilin2原核表达载体,纯化得到的重组小鼠cofilin2蛋白可用于后续的生物学研究。     

APOBEC3G蛋白的原核表达及纯化

目的：原核表达重组APOBEC3G蛋白,为其功能及免疫原性研究奠定基础。方法：提取H9细胞全细胞基因组RNA,通过RT-PCR获得目的基因,经纯化、酶切后克隆到原核表达载体pET32a中,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株获得表达工程菌株,并对表达条件和纯化条件进行优化;利用Western Blot分析鉴定目的蛋白。结果：构建了APOBEC3G蛋白的原核表达载体Apo-His-pET32a,并在大肠杆菌中获得高表达,目的蛋白以可溶性蛋白形式存在;经Ni-NTA亲和层析柱一步纯化,获得了高纯度的重组APOBEC3G蛋白,蛋白浓度可达1．2mg／mL;Westem Blot显示获得了目的蛋白。结论：在原核表达系统中表达、纯化了可溶性APOBEC3G蛋白,为进一步对其进行免疫原性和功能研究奠定了基础。     

小鼠Lewis肺癌组织中糖肽的分离纯化及其对肿瘤细胞与层粘连蛋白基质粘着的影响

小鼠Lewis肺癌组织经氯仿甲醇去除脂类,用木瓜蛋白酶消化,再经Sephadex柱层析分离得到总糖肽。它有明显地抑制小鼠Lewis肺癌细胞,S180肉瘤细胞及人巨细胞肺癌细胞与层粘连蛋白(Laminin,LN)基质粘着的作用;对层粘连蛋白受体(LN-R)与其配体的识别及结合也具有同样明显的阻断效应。糖肽的上述作用均具有剂量依赖性。进一步经ConA-Sepharose CL-4B亲和层析将总糖肽分为三个部分。与ConA不结合的糖肽部分对Lewis肺癌细胞与LN基质的粘着也具有剂量性抑制作用。     

小鼠卵ZP3蛋白的可溶性表达、纯化及免疫活性鉴定

哺乳动物卵透明带3(Zona pellucida 3,ZP3)在诱导获能精子发生顶体反应中发挥着重要作用,其在大肠杆菌中主要以包涵体形式表达。本研究在大肠杆菌中诱导表达可溶性的mZP3融合蛋白,并鉴定该蛋白的免疫活性。将小鼠卵透明带3克隆至pMAL-p2x质粒,转化至大肠杆菌BL21表达菌中。用不同温度、不同IPTG浓度、不同诱导时间及不同浓度的添加剂诱导目的蛋白表达,以筛选出mZP3融合蛋白可溶性表达的最佳条件。大量表达纯化后以Western blotting和ELISA检测蛋白的免疫活性。酶切鉴定及DNA测序表明mZP3已克隆入pMAL-p2x质粒。经优化诱导表达条件,筛选出mZP3融合蛋白可溶性表达的最佳条件为:当A600为0.6时添加0.02 mol/L葡萄糖,以0.6 mmol/L IPTG于25oC条件下诱导表达4 h。ELISA及Western blotting检测结果表明诱导表达的蛋白具有免疫活性。在大肠杆菌中表达并纯化获得可溶性mZP3蛋白,为mZP3免疫不育疫苗研制及其免疫效果检测提供了可溶性抗原。     

胚胎期下颌髁突软骨中糖胺多糖、纤维粘连蛋白和层粘连蛋白的表达

目的　观察不同时期胎儿髁突软骨中糖胺多糖、纤维粘连蛋白和层粘连蛋白的表达。方法　应用组织化学和免疫组织化学SP法检测 32例 13周～ 33周 (A组 13～ 17周 ,B组 18～ 2 2周 ,C组 2 3～ 2 7周 ,D组 2 8～ 33周 )胎儿髁突软骨中糖胺多糖、纤维粘连蛋白和层粘连蛋白 ,并行体视学图象分析。结果　髁突软骨中AB PAS在各组的灰度及积分光密度均无显著性差异 (P >0 . 0 5 )。FN、LN阳性表达位于软骨细胞外基质 ,增殖层和成软骨细胞层呈强表达 ,尤其在两层交界处 ,而肥大软骨细胞层中明显减弱。体视学分析表明LN在A组表达最强 ,其灰度及积分光密度均值与B、D组间均有显著性差异 (P <0 . 0 5 )。〔灰度 :A组 175 . 0 18± 8. 30 1、B组 187 16 2± 13 6 44、D组 190 5 5 0± 6 46 0 ;积分光密度 :A组 2 739± 0 799,B组 2 0 11± 0 85 5 ,D组 1 5 33± 0 42 7,均存在显著性差异 (P <0 0 5 )。FN在B组表达最强 ,灰度与A、C、D三组间存在显著性差异 (P <0 0 5或P <0 0 1) ;积分光密度与A、D组间有显著性差异 (P <0 0 5 )。〔灰度 :B组 173 0 89± 8 40 7、A组 182 0 45± 10 138、C组 188 70 1± 8 0 94、D组 195 417± 4 82 7;积分光密度 :A组 1 314± 0 86 9、B组 4 332± 2 5 37、D组 2 12     

层粘连蛋白及其肽段对小鼠胚泡粘附和扩展的作用

作为细胞外基质的主要成分之一的层粘连蛋白（ＬＮ）,对小鼠胚泡的粘附、扩展有显著促进作用。ＬＮ分子上的一些活性位点对胚泡的粘附和扩展也具有一定的作用,含ＲＧＤ位点序列的合成肽段ＲＧＤＳ对胚泡的粘附有促进作用;含ＹＩＧＳＲ位点序列的合成肽段ｃＹＩＧＳＲ对胚泡的粘附和扩展均有促进作用;且ＲＧＤＳ和ｃＹＩＧＳＲ可以竞争性抑制ＬＮ对胚泡粘附和扩展的促进作用。以上结果表明ＬＮ对胚泡的作用是通过胚泡上不同的ＬＮ     

层粘连蛋白糖肽对实体型瘤细胞粘着于层粘连蛋白基质的影响

 本文报告由小鼠EHS瘤提取的层粘连蛋白(Laminin,LN)经链霉蛋白酶(Pronase)消化,再经Sephadex-G50层析分离得到LN总糖肽。它可显著抑制黑色素瘤细胞B16-MBK及S180肉瘤细胞与LN基质的识别及粘着,并具有明显剂量依赖性。与五肽(YIGSR),卵清蛋白及其糖肽,胎球蛋白及其糖肽比较,LN总糖肽的抑制效果显著高于YIGSR及胎球蛋白糖肽,而其它三者均无抑制作用。因而提示:LN分子中一定结构的糖链特异地参与了LN对肿瘤细胞表面LN受体的识别与结合。     

舌鳞癌层粘连蛋白的表达及意义

采用免疫组织化学技术,研究了正常、异常增生组织、舌癌及舌癌淋巴结转移灶中层粘连蛋白的表达、分布及意义。结果发现：正常舌粘膜、轻度异常增生组织的基底膜处层粘连蛋白呈连续线状分布,中度和重度异常增生组织基底膜层粘连蛋白的分布有局部断裂。舌癌中层粘连蛋白的分布呈多种形式,分化好的舌癌层粘连蛋白呈线状,但明显不连续,分化差的舌癌中的层粘连蛋白常呈碎片状,而舌癌的淋巴结转移灶中层粘连蛋白的分布与原发灶相似。统计分析表明,层粘连蛋白的表达与舌癌的分化程度相关,而与舌癌的转移无关。观察结果表明：舌癌分化程度愈低,层粘连蛋白的缺损愈严重,层粘连蛋白的表达、分布特点可以作为判断癌恶性程度的指标,但不能判断舌癌的转移     

SMMC-7721肝癌细胞67kD层粘连蛋白受体的分离纯化

分离纯化肝癌细胞的 6 7kD层粘连蛋白受体 (6 7LR) ,以便进一步研究 6 7LR的结构、功能及其在肝癌浸润、转移过程中的作用 .以SMMC 772 1肝癌细胞和L 0 2正常肝细胞为材料 ,采用13 1I标记的层粘连蛋白测定其与细胞的结合能力 ;亲和层析法分离纯化层粘连蛋白受体 ,用SDS PAGE、放射自显影及体外竞争结合实验进行鉴定 .在相同条件下SMMC 772 1肝癌细胞与层粘连蛋白特异结合量为 17 5 4± 0 4 9ng 10 5细胞 ,而L 0 2正常肝细胞与层粘连蛋白的特异结合量为 8 36± 0 4 8ng 10 5细胞 .经过亲和层析 ,从SMMC 772 1肝癌细胞和L 0 2正常肝细胞均可获得纯化受体 ,SDS PAGE显示为单一条带 ,分子量为 6 7kD ,放射自显影及体外竞争结合实验表明其具有较强的与层粘连蛋白结合的活性 .体外竞争结合实验表明 ,SMMC 772 1肝癌细胞层粘连蛋白受体 (772 1LnR)的抑制率可达到 96 2 7± 2 2 9% ,而L 0 2正常肝细胞层粘连蛋白受体 (L 0 2LnR)的抑制率为 4 8 71± 3 79% ,这说明 772 1LnR与层粘连蛋白的亲和力明显高于L 0 2LnR(P <0 0 0 1) .结果表明 ,与L 0 2肝细胞比较 ,SMMC 772 1肝癌细胞具有与层粘连蛋白较强结合能力的特异受体 ,并从肝癌细胞膜上分离纯化到与层粘连蛋白有较强亲和力的 6 7LR     

细叶百合LpPEX5基因克隆及蛋白表达纯化

[目的]探究Lp PEX5蛋白表达与纯化的最佳条件。[方法]从细叶百合的鳞茎中克隆出过氧化物酶体生物合成蛋白基因(Lp PEX5),在详细分析该蛋白质同源氨基酸序列比对、进化树、保守区域,二级结构与三级结构预测等生物信息学后,构建到p QE-30原核表达载体上,转化大肠杆菌M15,通过SDS-PAGE凝胶电泳对不同诱导时间、诱导温度、IPTG浓度影响蛋白的表达量进行研究。利用亲核层析树脂纯化获得融合蛋白。[结果]成功克隆出Lp PEX5基因,构建p QE-Lp PEX5原核表达载体并且诱导和纯化出Lp PEX5蛋白。[结论]Lp PEX5蛋白的最佳诱导条件为30℃,1 mmol/L IPTG诱导5h。该研究为分析Lp PEX5蛋白的活性、验证蛋白间的相互作用等后续试验研究奠定了基础。     

截短的HCV NS3蛋白的表达、纯化及应用

目的:为了发展新一代HCV检测试剂盒,使包被的NS3蛋白能提高其检测的精确度与准确度.方法:通过生物信息学方法选定目标蛋白为HCV1263a.a～1583a.a,应用PCR方法克隆出编码此部分NS3蛋白的DNA序列,连接到表达载体pQE30构建重组子pQNS3,转化工程菌株JM109后诱导表达,表达产物通过Western-blot实验证实,用Ni-NTA-Superflow亲和层析柱纯化,采用ELISA方法检测纯化的蛋白在免疫检测中的应用.结果:工程菌株在IPIG诱导下表达出N端含6个组氨酸的NS3融合蛋白,分子量约为36kDa,利用纯化的目标蛋白对40份HCV抗体阳性参考品,蛋白检测的符合率为77.5%(31/40);对40份阴性参考品,检测符合率为97.5%(39/40).结论:表达的NS3融合蛋白,具有很好的应用价值,可以应用于新一代HCV检测试剂盒以及对NS3蛋白功能的研究.     

口蹄疫病毒3D蛋白在体外的表达纯化及二级结构分析

口蹄疫(FMD)是严重影响全球农业经济的高度传染的毁灭性的疫病.3D蛋白是口蹄疫病毒(FMDV)编码的RNA聚合酶,参与病毒RNA的复制.利用PCR扩增得到了FMDV的3D基因片段,然后将其克隆到原核表达质粒pET-28a(+)上,构建重组表达质粒pETFM3D.转化宿主菌BL21(DE3)后,利用1 mmol/L的IPTG进行诱导表达.SDS-PAGE和Western boltting分析结果表明,得到了稳定、过量表达的可溶性的3D蛋白质.目的蛋白质经NI亲和层析柱一步纯化就达到95%,再经Q-sepharose柱纯化后达到97%.通过圆二(CD)色谱测定和计算3D蛋白质在不同的pH(2、4、6、8和10)和不同的温度下(25～85℃)的二级结构.上述结果表明,表达的可溶性3D蛋白质具有高表达、易纯化和稳定性好等特点.