来源于Pyrococcus furiosus的耐高温α-淀粉酶基因在衣藻叶绿体中的表达

来源于Pyrococcusfuriosus的耐高温α-淀粉酶是一种重要的酒精工业用酶,在植物中表达耐高温α-淀粉酶可以大大降低用植物秸秆生产酒精的成本。选择衣藻叶绿体基因组同源片段clpP-trnL-petB-chlL-rpl23-rpl2和壮观霉素抗性基因,构建了来源于Pyrococcusfuriosus的耐高温α-淀粉酶基因的衣藻叶绿体表达载体p64A。通过基因枪将其导入衣藻叶绿体中,经壮观霉素抗性(100mg/L)筛选,获得了9个抗性衣藻转化子。转化子经过抗性继代筛选后,经PCR、Southernblot检测分析及暗培养,证实耐高温α-淀粉酶基因已整合到衣藻叶绿体基因组中并得到表达。酶活性检测表明,转基因衣藻表达产物具有耐高温α-淀粉酶活性,每克鲜重衣藻最高达77.5u。实验结果证明在植物叶绿体中表达工业酶制剂是可行的。     

古菌Pyrococcus furiosus嗜热α-淀粉酶基因在酿酒酵母中的表达

用PCR方法从嗜热古菌Pyrocccus furiosus的基因组DNA中扩增出胞外α-淀粉酶成熟肽结构基因,插入pUC19中构建成质粒pUC19-amy,将pUC19-amy外源片段接入酿酒酵母表达载体pXY212多克隆位点,构建成载体pYX212-amy,电转化酿酒酵母W303-1A,转化子成功表达出有活性的高嗜热α-淀粉酶,重组酶具有P.furiosus产生的胞外α-淀粉酶相似的酶学性质,最适pH为5.0,最适温度约为90℃,在121℃下热处理30min酶活仍能保持50%以上。     

热稳定α—淀粉酶稳定性工程菌的构建

本文以质粒pE194为载体亚克隆B.licheniformis热稳定α-淀粉酶基因,构建成重组质粒pNW102,通过噬菌体PBS1将它转导进入中温α-淀粉酶生产菌B.subtilis BF7658。B.subtilis BF7658(pNW102)经过长时间非许可温度处理,筛选得到2株热稳定α-淀粉酶稳定性表达的工程菌株。酶学分析显示同源重组具有热点,2株重组菌株B.subtilis BFNW产生的热稳定α-淀粉酶符合B.licheniformis产生的淀粉酶特性。     

超高温古生菌强烈炽热球菌(Pyrococcus furiosus)的生理代谢

本文述及Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ的丙酮酸代谢、麦芽糖发酵（高温糖酵解途径）、由丙酮酸糖原异生途径、还原性末端产物－－Ｌ－丙氨酸的形成和钨对代谢类型的影响等。     

表达淀粉酶、糖化酶葡糖酸醋杆菌工程菌的构建

采用基因融合技术,将葡糖酸醋杆菌Gluconacetobacter hansenii ATCC23769分泌蛋白CMCax的信号肽序列分别与来源于枯草芽胞杆菌的淀粉酶基因、黑曲霉的糖化酶基因融合构建融合蛋白,连入能在G.hansenii ATCC23769自主复制的载体pbs-H1S中,电击转入G.hansenii ATCC23769,构建能内源表达淀粉酶、糖化酶,以及淀粉酶-糖化酶的葡糖酸醋杆菌。淀粉平板透明圈检测结果和DNS测酶活结果显示,构建的3种工程菌能成功表达并分泌淀粉酶和糖化酶。     

具有a-淀粉酶分泌活性以及低双乙酰产量的啤酒酵母工程菌的构建

扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)因具有较强的a-淀粉酶以及葡聚糖酶活性, 使其在以淀粉为唯一碳源的培养基上能够良好的生长。从其基因组中克隆了a-淀粉酶的编码区, 构建了由酵母磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)启动子、酿酒酵母a-因子信号序列以及扣囊复膜酵母a-淀粉酶基因编码序列组成的基因表达盒。将该表达盒插入到质粒pPLZ-2的ILV2基因序列内部, 使其两翼具有ILV2基因的同源区。将该表达盒通过同源重组的方式整合到啤酒酵母工业菌株YSF-5的a-乙酰乳酸合成酶(AHAS)基因ILV2内部。在以淀粉为唯一碳源的培养基上进行转化子的筛选。通过多对引物PCR、a-淀粉酶活性以及AHAS活性分析对转化子进行鉴定, 得到一株具有a-淀粉酶分泌表达活性、较低AHAS活性, 并且发酵液中双乙酰产量也相对较低的啤酒酵母工程菌。该菌株在非选择压力条件下连续培养50代后仍然保持其遗传稳定性。还对pH、温度以及金属离子对该转化菌株的a-淀粉酶活性的影响进行了研究。由于所构建的菌株不含有非酵母来源的DNA, 所以生物安全性相对较高, 对酵母育种以及啤酒生产工业都具有较为重要的意义。     

具有a-淀粉酶分泌活性以及低双乙酰产量的啤酒酵母工程菌的构建

扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)因具有较强的a-淀粉酶以及葡聚糖酶活性, 使其在以淀粉为唯一碳源的培养基上能够良好的生长。从其基因组中克隆了a-淀粉酶的编码区, 构建了由酵母磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)启动子、酿酒酵母a-因子信号序列以及扣囊复膜酵母a-淀粉酶基因编码序列组成的基因表达盒。将该表达盒插入到质粒pPLZ-2的ILV2基因序列内部, 使其两翼具有ILV2基因的同源区。将该表达盒通过同源重组的方式整合到啤酒酵母工业菌株YSF-5的a-乙酰乳酸合成酶(AHAS)基因ILV2内部。在以淀粉为唯一碳源的培养基上进行转化子的筛选。通过多对引物PCR、a-淀粉酶活性以及AHAS活性分析对转化子进行鉴定, 得到一株具有a-淀粉酶分泌表达活性、较低AHAS活性, 并且发酵液中双乙酰产量也相对较低的啤酒酵母工程菌。该菌株在非选择压力条件下连续培养50代后仍然保持其遗传稳定性。还对pH、温度以及金属离子对该转化菌株的a-淀粉酶活性的影响进行了研究。由于所构建的菌株不含有非酵母来源的DNA, 所以生物安全性相对较高, 对酵母育种以及啤酒生产工业都具有较为重要的意义。     

麦芽四糖淀粉酶的晶体培养及初步衍射研究

麦芽四糖淀粉酶是水解方式独特、其产物又具有较广泛应用价值的一种淀粉酶。应用悬滴汽相扩散法,用从产碱菌发酵培养液分离纯化得到的麦芽四糖淀粉酶成功地培养出了质量较好的单晶体。测得该种晶体属正交晶系,空间群为Ｐ２１２１２１,晶胞参数ａ＝４６．６Ａ。,ｂ＝６５．８Ａ。,ｃ＝１７０．９Ａ。,一个不对称单位含一个麦芽四糖淀粉酶分子。用ＭａｒＲｅｓｅａｒｃｈＩＰ面探测器收集了一套分辨率高于２．７Ａ。的衍射强度数据。     

产碱菌麦芽四糖淀粉酶的纯化及性质

产碱菌(Alcaligenes sp．)537．1除去菌体的培养液经硫酸铵沉淀及DEAE-纤维素离子交换柱层析,得到了凝胶电泳均一的麦芽四糖淀粉酶。纯化了141倍,酶活力回收40.1％,比活力达3308U／mg。用浓度梯度PAGE和SDS—PAGE测定酶分子量分别为68000和66000,不具亚基。用PAG-1EF测定等电点为4．45。酶反应最适pH和温度分别为7.0和60C。在pH7—10范围内稳定,该酶半衰期为37C 12小时,50 C 1小时和62 C 6分钟。 麦芽四糖淀粉酶是糖蛋白,含有4％左右的糖,含有27．10％酸性氨基酸、11.08％碱性氨基酸和1．82％色氨酸。     

SHMT基因工程菌的构建及高效表达

以质粒ｐＴ７-７和ｐＢＲ３２２为载体,构建ＧｌｙＡ基因的重组质粒,继而得到１２株基因工程菌（ＣＷＳ系列）。其中,高表达菌株ＣＷＳ-７的ＳＨＭＴ酶表达量占全菌可溶蛋白的４７％,是其宿主菌的５６倍;改善培养条件后,ＣＷＳ-７中ＳＨＭＴ酶活力可达宿主菌的１０６倍     

产碱菌麦芽四糖淀粉酶的化学修饰

不同蛋白质侧链修饰剂对麦芽四糖淀粉酶进行修饰。在一定条件下,分别用ＩＡＡ、ＮＥＭ、ＥＤＣ和ＮＡＩ处理后,酶活力不受影响,仍为１００％,说明巯基、羧基和酪氨酸残基与酶活力无关。用ＤＥＰ、ＮＢＳ和ＨＮＢＢ修饰后,酶活力大幅度下降,说明组氨酸和色氨酸基为酶活力所必需。     

重组质粒pUDKH工程菌库的制备及检定

目的:pUDKH是由本实验室构建的携带人肝细胞生长因子(HGF)基因的真核表达质粒,具有治疗肢体动脉闭塞病的应用潜能。为了生产制备重组质粒pUDKH,须建立菌种库并对其进行质量检定。方法:将质粒pUDKH转化大肠杆菌DH5α,经筛选后制备成初始菌种库和工作菌种库,对菌种进行革兰染色、电镜、抗生素抗性、遗传稳定性、质粒拷贝数、生化反应等检定。结果与结论:菌种生产pUDKH的产量较高,无支原体及其他微生物污染,40代次内菌种性状、遗传稳定性、质粒拷贝数均稳定,可作为工艺生产用菌种。     

褐藻胶寡糖制备的研究进展

褐藻胶寡糖(alginate oligosaccharides,AOS)是褐藻胶降解而形成的一种功能性寡糖,具有广泛的生物活性,如促进植物生长、提高植物抗逆性、抗氧化、抗菌、抗肿瘤等。褐藻胶寡糖的制备方法主要分为:化学法、物理法和酶解法。不同的方法制备出的褐藻胶寡糖结构亦有所不同。介绍了化学法、物理法和酶解法等各种褐藻胶寡糖制备方法的研究现状、存在的问题及发展趋势。     

褐藻寡糖的制备方法及生物活性研究进展

褐藻胶是一类多糖聚合物,由于其独特的理化性质和有益健康的作用,已被广泛应用于制药和食品工业.然而,由于褐藻胶的水溶性低、黏度大,进而限制了褐藻胶的开发和应用.褐藻寡糖(alginate oligosaccharide,AOS)是褐藻胶的降解产物,由于其分子量低、水溶性高、安全无毒等特点,近年来受到广泛关注.AOS独特的...     

壳寡糖的制备及生物学活性研究进展

壳寡糖是由壳聚糖水解得到的一类具有抗炎、抗肿瘤、可调节免疫和神经保护等多种生物学活性的化合物,被广泛应用于农业、医药、食品等领域,也是目前国内外研究的热点。本文就壳寡糖的制备方法及生物学活性进行了综述,以期对深入研究壳寡糖提供依据。     

麦芽四糖淀粉酶基因优化表达及酶学性质分析

麦芽四糖淀粉酶是一种新型外切淀粉酶,从淀粉的非还原末端特异地顺序切割第4个α-1,4糖苷键,产物为麦芽四糖,广泛应用于食品、医疗保健等领域.对来自嗜糖假单胞菌(Pseudomonas saccharophila)的麦芽四糖淀粉酶基因序列进行优化,优化前后基因序列同源性达75％.将优化合成的成熟肽基因克隆至原核表达载体pET32a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,重组蛋白主要以包涵体形式存在.包涵体经变性、复性、多步纯化,获得有活性的麦芽四糖淀粉酶.将麦芽四糖淀粉酶与不同来源的淀粉水解反应,结果表明,该酶能与7种不同来源的淀粉反应产生单一的麦芽四糖.经SDS-PAGE电泳,DNS法和硅胶板薄层色谱分析法(TLC)进行酶学性质分析,结果表明麦芽四糖淀粉酶的分子量约为57kDa,纯化后的酶液最适反应温度为45℃,最适反应pH为8.0.研究结果为麦芽四糖淀粉酶的研究和开发提供依据和参考.     

产碱菌麦芽四糖淀粉酶的底物特异性

产碱菌Ｇ４Ａ仅能水解由α－１,４－葡萄糖苷键连接的麦芽寡糖、淀粉或糖原。淀粉和糖原的水解产物为Ｇ４;麦芽寡糖Ｇ５,Ｇ６和Ｇ７的水解产物分别为Ｇ４＋Ｇ、Ｇ４＋Ｇ２和Ｇ４＋Ｇ３,水解速度为Ｇ５〈Ｇ６〈Ｇ７。直链淀粉的水解限度为１００％,其他淀粉为６０￣７４％,糖原仅３４％,表明该酶为从麦芽寡糖、淀粉或糖原非还原末端顺序切割第４个α－１,４－葡萄糖苷键的外切型淀粉酶。Ｇ４Ａ对Ｇ５、Ｇ６、Ｇ７及直链淀粉、     

麦芽四糖淀粉酶晶体的分子堆积学研究

用悬滴汽相扩散法生长了从产碱菌中分离纯化得到的麦芽四糖淀粉酶的晶体,并在Ｍａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ面探讨器收集了一套２．７埃分辨率的衍射强度数据。用分子置换法解得了该种晶体的结构。在此基础上,分析和比较了两种不同麦芽四糖淀粉酶晶体中的分子堆积和作用,对影响蛋白质体分子堆积的一些因素进行了讨论。     

牛肠激酶催化亚基工程菌的构建

目的：构建牛肠激酶催化亚基工程菌。方法：将带有牛肠激酶催化亚基（bEKL）的结构基因进行克隆,将克隆产物纯化后,构建bEKL克隆质粒,后构建bEKL表达质粒,并将表达质粒制导入备感受态细胞,进行蛋白表达。结果：琼脂糖电泳验证牛肠激酶催化亚基基因已经成功地插入表达载体,序列与预期设计一致。结论：表达质粒构建成功。