固液态发酵中橄榄油对Rhizopus chinensis全细胞脂肪酶的影响*

主要对华根霉全细胞脂肪酶固态和液态两种发酵过程进行比较,并着重探讨不同培养方式下橄榄油对其合成活力和水解活力的影响。结果表明:液态培养较有利于菌体生长,对脂肪酶的生产也有一定的促进作用。橄榄油的加入不仅有利于菌体生长、提高脂肪酶水解活力,更可使脂肪酶的合成活力显著增加,液态发酵下的效果更为明显。橄榄油在整个发酵过程中可能既作为碳源又是脂肪酶的诱导物。另外,全细胞脂肪酶的水解活力和合成活力在固液态发酵条件下均存在不对应性,表明华根霉可能产性质不同的脂肪酶同功酶。     

固液态发酵中橄榄油对Rhizopus chinensis全细胞脂肪酶的影响

主要对华根霉全细胞脂肪酶固态和液态两种发酵过程进行比较,并着重探讨不同培养方式下橄榄油对其合成活力和水解活力的影响。结果表明：液态培养较有利于菌体生长,对脂肪酶的生产也有一定的促进作用。橄榄油的加入不仅有利于菌体生长、提高脂肪酶水解活力,更可使脂肪酶的合成活力显著增加,液态发酵下的效果更为明显。橄榄油在整个发酵过程中可能既作为碳源又是脂肪酶的诱导物。另外,全细胞脂肪酶的水解活力和合成活力在固液态发酵条件下均存在不对应性,表明华根霉可能产性质不同的脂肪酶同功酶。     

华根霉液态培养生产脂肪酶不同形态菌体的转录组差异分析

【背景】作为发酵工业中一类重要的生产菌株,丝状真菌目的产物的形成与菌体形态有着紧密的联系。华根霉(Rhizopus chinensis)CCTCC M201021是从我国传统酿造浓香型白酒大曲中筛选到的一株丝状真菌,其生成的包括脂肪酶在内的酶蛋白具有较高的工业应用价值。【目的】华根霉(Rhizopus chinensis)CCTCC M201021在脂肪酶液态发酵中形成两种不同形态菌体,发酵表现差异明显。本研究考察华根霉不同菌体形态及其细胞代谢在转录组水平的内在差异。【方法】基于RNA-Seq高通量转录组测序,分别对液态培养获得的不同形态华根霉菌体高表达和显著差异表达的转录基因进行功能分析。【结果】两种形态菌体转录组存在明显的差异。利用RPKM值对表达量最高的前20个基因进行分析,聚集态菌体高表达基因主要为不同类别的核糖体蛋白,而分散态菌体中与细胞形态相关的几丁质酶及与信号传导相关的基因也是高表达基因。在两种形态菌体显著差异表达的20个基因中,除了涉及代谢的基因有明显不同外,分散态菌体中也有一些涉及"细胞过程与信号"的基因上调表达显著。两种形态菌体中独有表达基因总体表达量均较低,但聚集态菌体独有表达基因在基因种类和表达量上都要明显高于分散态菌体。同时,转录分析表明,华根霉脂肪酶在聚集菌体中较高的生产水平与脂肪酶基因的高水平转录有关。【结论】菌体形态的差异显著影响了华根霉的转录组,不仅不同形态菌体高表达基因和显著差异表达基因有明显不同,而且功能相同的蛋白在不同菌体形态下也多是由不同基因表达,它们可能承担着不同的作用。总体而言,华根霉聚集态菌体中存在更为复杂的生理过程,而分散菌体中受到信号的传导和调控似乎更多。菌体形态的改变可能是细胞分化的结果,伴随着菌体对细胞微环境改变的一种响应。研究结果为深入了解丝状真菌形态分化的内在机制及其影响提供了一些线索。     

华根霉前导肽和成熟肽脂肪酶基因的克隆表达及性质研究

以华根霉(Rhizopus chinensis CCTCCM201021)为出发菌株,提取总DNA,PCR扩增出前导肽脂肪酶基因(proRCL)及成熟肽脂肪酶基因(mRCL),克隆到原核载体pET-28a,转化E-coli BL21(DE3),诱导表达并纯化出活性目的蛋白.经SDS-PAGE分析,重组蛋白ProRCL和MRCL的分子量分别约43 kD和33 kD.两重组脂肪酶主要酶学性质基本相似,最适反应温度均为35℃,40℃下较为稳定;最适反应pH相近,分别为8.0和8.5;以pNP脂肪酸酯为底物,均对短链脂肪酸酯底物特异性较高.MPCL上述性质与野生型RCL基本一致.研究结果表明,通过条件控制可以利用E.coli表达系统表达具有活性的华根霉前导肽脂肪酶ProRCL和成熟肽脂肪酶MRCL.与米根霉脂肪酶(ROL)不同,前导序列对华根霉脂肪酶的主要酶学特性没有显著影响.     

毕赤酵母组成型表达脂肪酶及其高通量筛选方法

【目的】获得组成型表达脂肪酶毕赤酵母,建立利用橄榄油罗丹明B平板高通量筛选组成型表达华根霉脂肪酶基因的有效方法。【方法】运用PCR技术从pGAPZαA表达载体上扩增得到GAP启动子片段,插入到表达载体pPIC9K-proRCL中,构建组成型表达载体pGAPK-proRCL。在保留含有同源双交换重组序列的诱导型启动子AOX1序列的基础上,电转化后华根霉Rhizopus chinensis CCTCC M201021脂肪酶基因proRCL表达盒在毕赤酵母基因组上发生双交换整合事件,从而组成型表达单拷贝的华根霉脂肪酶基因。【结果】重组菌发酵144 h后,脂肪酶最高酶活为130 U/mL。利用橄榄油罗丹明B平板高通量筛选组成型表达华根霉脂肪酶基因。【结论】该方法将初筛时间从12 d缩短为3 d,排除了多拷贝突变株的干扰,为后续脂肪酶的定向进化及筛选奠定了基础。     

华根霉脂肪酶有机相合成酶活的研究

通过比较7种微生物脂肪酶的有机相合成酶活、水相水解酶活及在正庚烷中催化己酸乙酯合成的能力,证明了合成酶活与水解酶活相关性不高,合成酶活比水解酶活更能反映脂肪酶的合成能力。通过比较两株华根霉(Rhizopus chinensis)脂肪酶酶活,发现合成酶活相差较大,表明相同种属微生物的脂肪酶合成酶活存在不同。对．Rhizopus chinensis-2液态发酵产脂肪酶进程研究发现,水解酶活高峰先于合成酶活高峰大约12h。将不同培养时间的Rhizopus chinensis-2全细胞脂肪酶用于催化己酸乙酯合成,具有高合成酶活的全细胞脂肪酶催化己酸乙酯合成反应较快。因此,全细胞脂肪酶用于催化有机相酯合成反应时,具有高脂肪酶合成酶活的菌体具有较好的催化酯合成能力。     

基于全基因组数据华根霉产真菌毒素分析

【目的】在对中国传统优势浓香型白酒产业中重要功能微生物华根霉菌株CCTCCM201021全基因组测序的基础上,以生物信息学的方法和手段主要针对真菌毒素的合成代谢途径及关键基因进行分析,考察微生物在食品工业应用中的安全性。【方法】应用Illumina平台Solexa测序技术对华根霉进行基因组测序,运用SOAPdenovo组装软件进行拼接,并进行一系列生物信息分析,考察根霉素、小孢根霉素及典型丝状真菌毒素代谢的主要途径及相关基因,包括PKS、NRPS与PKS-NRPS混合代谢途径;萜类化合物代谢和其他代谢途径等,判断华根霉是否具有产真菌毒素的潜在危害性。【结果】测序结果表明华根霉全基因组大小为45.70 Mb左右,GC含量为36.99%。通过基因预测软件分析得到基因17 676个,共注释基因13 243个。通过进化树与同源基因比较分析,与目前基因组测序完成的仅有的3株接合菌基因组相比,序列相似性普遍偏低,与华根霉存在较为显著的差异,但同源基因的相似性在60%左右。代谢分析表明,华根霉中仅存在较少聚酮合成、萜类化合物合成途径代谢基因,存在大量异源物质降解途径基因。【结论】华根霉基本不具备产目前已知的真菌毒素的关键基因或合成能力,可以认为其发酵产品是相对安全的。在酿造过程中,不仅可作为糖化菌,在混菌发酵时,对部分具有抑菌能力的抗生物质具有降解功能,是发酵工业中应用的相对安全的重要生产菌。     

基因拷贝数和甲醇浓度对重组毕赤酵母产华根霉脂肪酶的影响

将华根霉脂肪酶基因克隆到甲基营养型毕赤酵母中表达,以甲醇利用快型菌株为宿主,在7 L发酵罐水平对脂肪酶基因拷贝数分别为3、5、6的3株基因重组菌——XY RCL-3、XY RCL-5、XY RCL-6进行高密度发酵调控,同时研究了甲醇浓度对表达华根霉脂肪酶的影响。结果表明,XY RCL-5在相同条件下发酵产酶能力高于XY RCL-6和XY RCL-3,最适甲醇诱导浓度控制在0.1%±0.02%时,酶活可达到12 500 U/mL,菌体干重达到204 g/L,蛋白浓度也能达到8.02 g/L。     

重组毕赤酵母表达华根霉脂肪酶发酵液的絮凝除菌条件研究

在重组毕赤酵母表达华根霉脂肪酶的研究中,目的蛋白的提取收率是关键.由于产物脂肪酶是分泌在发酵液中,常用的方法是加入絮凝剂使茵体沉淀,再通过离心获取上清液中的目的蛋白.本研究改良了传统的絮凝剂配方,确定了絮凝剂的新配方:发酵液中加入2%的氯化钙以及磷酸氢二钠按摩尔比1:1混合液,500 mg/L聚丙烯酰胺,同时调节发酵液...     

酶法合成生物柴油工业化研究进展

介绍了北京化工大学近年来酶法合成生物柴油工业化研究的结果。主要内容包括以下几个方面:高产脂肪酶菌株的选育、脂肪酶发酵工艺优化及放大、脂肪酶固定化方法、酶反应器放大、生物柴油分离精制及副产物甘油综合利用。该脂肪酶假丝酵母Candida sp.99-125在5 m3罐发酵活力不低于8 000 IU/mL,然后将该脂肪酶吸附固定在织物膜上并进行表面改性,用于搅拌罐式反应器生产每吨甲酯的需酶量仅为4.2 kg,产品经分离精制调质后,其各项指标完全符合德国生物柴油生产标准。副产物甘油可用于1,3-丙二醇发酵,30 L发酵罐中1,3-丙二醇的产量可达到76.1 g/L。     

Culture condition improvement for whole-cell lipase production in submerged fermentation by Rhizopus chinensis using statistical method

Rhizopus chinensis CCTCC M201021 was a versatile strain capable of producing whole-cell lipase with synthetic activity in submerged fermentation. In order to improve the production of whole-cell lipase and study the culture conditions systematically, the combination of taguchi method and response surface methodology was performed. Taguchi method was used for the initial optimization, and eight factors viz., maltose, olive oil, peptone, K2HPO4, agitation, inoculum size, fermentation volume and pH were selected for this study. The whole-cell lipase activity yield was two times higher than the control experiment under initial optimal conditions, and four significant factors (inoculum, olive oil, fermentation volume and peptone) were selected to test the effect on the lipase production using response surface methodology. The optimal fermentation parameters for enhanced whole-cell lipase yield were found to be: inoculum 4.25 x 10(8) spores/L, olive oil 2.367% (w/v), fermentation volume 18 mL/250 mL flask, peptone 4.06% (w/v). Subsequent experimental trails confirmed the validity of the model. These optimal culture conditions in the shake flask led to a lipase yield of 13875 U/L, which 120% increased compare with the non-optimized conditions.     

Changes in morphology of <Emphasis Type="Italic">Rhizopus chinensis</Emphasis> in submerged fermentation and their effect on production of mycelium-bound lipase

In order to control suitable mycelium morphology to obtain high lipase productivity by Rhizopus chinensis in submerged fermentation, the effects of fungal morphology on the lipase production by this strain both in shake flask and fermentor were investigated. Different inoculum level and shear stress were used to develop distinctive morphologies. Analyses and investigations both on micromorphology and macromorphology were performed. Study of micromorphology reveals that micromorphologies for dispersed mycelia and aggregated mycelia are different in cell shape, biosynthetic activity. Macromorphology and broth rheology study in fermentor indicate that pellet formation results in low broth viscosity. Under this condition, the oil can disperse sufficiently in broth which is very important for lipase production. These results indicate that morphology changes affected the lipase production significantly for R. chinensis and the aggregated mycelia were suggested to achieve high lipase production.     

粗壮假丝酵母(Candida valida 20231)产脂肪酶发酵条件的研究

对粗壮假丝酵母(Candida valida 20231)产脂肪酶所需的培养基成分和发酵条件进行了优化。结果表明,粗壮假丝酵母在接种后3 h即进入对数期,18 h后转入稳定期,66 h后进入衰退期;发酵36 h达到最大酶活,至72 h仍然无明显下降趋势。最适合的培养基成分为:4.0%大豆粉,2.0%菜籽油,0.3%葡萄糖,0.3%NH_4NO_3,1.2%K_2HPO_4,0.42%NaH_2PO_4,0.4%MgSO_4·7H_2O。使用优化的培养基,最佳产酶的条件为:装液量80 mL(250 mL摇瓶),初始pH 6,接种量为2.0%,种子菌龄为12 h。在最佳产酶条件下,脂肪酶活力达到32.6 U/mL。     

蝙蝠蛾拟青霉液体发酵工艺优化及菌丝体腺苷含量的检测

通过摇瓶液体培养的方法,以菌丝体生物量为主要考察指标,筛选蝙蝠蛾拟青霉PH-2菌株液体发酵的培养基成分和条件。进一步采用正交试验,以菌丝体生物量和腺苷含量为联合指标,确定PH-2菌株液体发酵高产菌丝体和腺苷的培养基配方。通过试验获得的最佳配方为：玉米淀粉40g/L,葡萄糖5g/L,玉米浆25g/L,硫酸镁·7H₂O 1g/L,磷酸二氢钾1g/L,硫酸锌1.5g/L,维生素B1 25mg/L;培养条件为：初始pH 6.0,装液量150mL/500mL,接种量8%（V/V）,温度26℃,转速120r/min,培养7d。在该工艺下,菌丝体生物量达到25.2g/L。应用高效液相色谱（HPLC）法,检测到菌丝体中腺苷含量为2.76mg/g。该方法简便、快速、准确,可作为蝙蝠蛾拟青霉菌丝体或其相关产品中腺苷的检测手段。本工艺的优化试验获得了较高的菌丝体收率,菌丝体质量良好。     

华根霉产纤溶酶液体发酵条件的研究

研究了华根霉TCCC 41014产纤溶酶液态发酵的工艺条件,采用单因素实验对液态发酵培养基的碳源、氮源、初始pH值、温度和装液量进行了优化.结果表明,实验范围内华根霉TCCC41014液态发酵产纤溶酶的适宜培养基组成(g桙L):糊精80,蛋白胨60,豆粕60,初始pH为4.5.适宜培养条件:培养温度为29℃,装液量为5...     

Optimization of fermentation medium and conditions for mycelial growth and water-soluble exo-polysaccharides production by Isaria farinosa B05

The optimal fermentation medium and conditions for mycelial growth and water-soluble exo-polysaccharides production by Isaria farinosa B05 were investigated. The medium components and fermentation conditions were optimized according to the one at a time method, while the concentration of medium components was determined by the orthogonal matrix method. The results showed that the optimal fermentation medium was as follows: sucrose 3.5% (w/v), peptone 0.5%, yeast extract 0.2%, K(2)HPO(4) 0.1%, and MgSO(4) 0.05%. The suitable fermentation conditions were as follows: initial pH 7.0, temperature 25 degrees C, medium volume 75 mL/250 mL, inoculum volume 5% (v/v), time 5d. In such optimal nutrition and environmental conditions, the maximal mycelial yield was 2.124 g/100 mL after 4 day's fermentation, while maximal water-soluble exo-polysaccharides production reached 2.144 g/L after 5 day's fermentation.     

多拷贝毕赤酵母重组菌表达GCL摇瓶优化和高密度发酵

目的:构建高效表达白地霉脂肪酶的毕赤酵母重组菌株,并对筛选得到的菌株进行摇瓶发酵条件优化和分批补料高密度发酵工艺研究。方法:将诱导型表达载体pPIC9K-gcl电转化至毕赤酵母GS115。通过橄榄油-罗丹明B平板和摇瓶发酵筛选高脂肪酶活力的重组菌株,运用基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR 法确定其拷贝数,并对菌株进行摇瓶发酵条件优化。在此基础上,研究重组菌在3L 发酵罐中的高密度发酵工艺。结果:筛选得到一株具有3 个白地霉脂肪酶基因拷贝的菌株GS115/pPIC9K-gcl 78#,初始酶活力为220 U/ml。当摇瓶发酵条件为甲醇诱导96 h,每24 h甲醇添加量1 %,接种量2 %,培养基初始pH 7.0,500 ml摇瓶装液量50 ml,甲醇诱导温度25℃ 时酶活力达735 U/ml。3L 发酵罐高密度发酵176.5 h,酶活力达到3360 U/ml,总蛋白含量达到4.30 g/L,且发酵过程中细胞活性一直保持在96 % 以上。结论:基因拷贝数与重组菌株的产酶水平呈正相关,摇瓶优化可显著提高重组菌株的产酶能力,为白地霉脂肪酶的工业化生产奠定了技术基础。