家蚕抗菌肽-死亡素杂合肽基因在大肠杆菌中的克隆与表达

近年来的研究发现 ,抗菌蛋白在生物体非专一性防御系统有着重要的作用 ,已有数十种具有抗菌活性的多肽被分离 ,这些多肽可大致分为 3类 ,即含分子内二硫桥的抗菌肽 ;具有双亲α 螺旋结构的抗菌肽 ;以及富含某种氨基酸残基的抗菌肽[1 ] ,一般来说 ,这些抗菌肽具有分子量小 ,稳定性好 ,无细胞毒性 ,抗菌谱广等特点。多种抗菌肽的一级结构和二级结构已经确定[2 ] ,但作用机理仍不明了。一般认为可能存在两种作用模式 ,即 1)通过肽 脂膜相关作用杀菌 ;2 )通过受体介导的识别过程起作用[1 ] 。ＣｅｃｒｏｐｉｎＢ是一种较早从家蚕中分离得到 ,由 …     

家蚕抗菌肽-死亡素杂合肽基因在大肠杆菌中的克隆与表达

近年来的研究发现,抗菌蛋白在生物体非专一性防御系统有着重要的作用,已有数十种具有抗菌活性的多肽被分离,这些多肽可大致分为3类,即含分子内二硫桥的抗菌肽;具有双亲a-螺旋结构的抗菌肽;以及富含某种氨基酸残基的抗菌肽[1],一般来说,这些抗菌肽具有分子量小,稳定性好,无细胞毒性,抗菌谱广等特点.多种抗菌肽的一级结构和二级结构已经确定[2],但作用机理仍不明了.一般认为可能存在两种作用模式,即1)通过肽-脂膜相关作用杀菌;2)通过受体介导的识别过程起作用[1].     

猪肥胖基因在大肠杆菌中的高效融合表达

采用PCR方法扩增猪肥胖基因编码原成熟蛋白cDNA序列,并在5′端加上BamHⅠ位点,3′端加上EoRⅠ位点,将5′端密码子CCC转变为大肠杆菌常见密码子CCG,扩增得到459bp的片段,克隆于融合表达载体p GEX-2TBamHⅠ和EcoRⅠ位点,酶切、测序正确,经0．1mmol/LIPTG诱导表达出一条约42kD的融合蛋白,其中26kD为pGEX-2T中带有的谷胱苷肽转移酶,16kD是猪肥胖基因表达产物瘦蛋白。利用非融合表达产品制备抗血清,检测融合表达的重组蛋白,Western-blot为阳性。     

人工会成柞蚕杀菌肽D基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

以质粒pWR450为载体,克隆了人工合成的柞蚕杀菌肽D基因(122bp),构建的重组子pWR450-Cec转化大肠杆菌JM103、用限制性内切酶酶切鉴定。产物经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,结果显示可表达杀菌肽-β-gal融合蛋白。     

蜂毒溶血肽基因的定点诱变及其在大肠杆菌中的表达

从蜜蜂毒腺中提取总ＲＮＡ,通过ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增得到了蜂毒溶血肽前体蛋白的ｃＤＮＡ,再进一步通过定点诱变在蜂毒溶血肽序列前引入了羟胺裂解位点,构建了与β－半乳糖苷酶部分序列相融合的蜂毒溶血肽诱变蛋白表达载体,序列分析结果表明,成功地引入了目的密码子且与β－半乳糖苷酶部分序列构成正确的读码框,并在大肠杆菌中表达了诱变蛋白,为基因工程生产蜂毒溶血肽提供了新途径。     

hCG嵌合肽在大肠杆菌中高表达的研究

目的：研制基因工程嵌合肽（CP）抗原的科学意义和应用价值，除取决于CP构建物能否体现强免疫原性和光或无MHC遗传限制外，它还应能在生物系统中被高表达，对于后，我们作了多方面的探索，包括在系列hCG CPs(-1,-7,-10,和－11）的N端再接一段25聚肽的研究。方法：插入片段选自可高表达的猪卵透明带（pZP)－4蛋白的N端，在上述hCGCPs的衍生物（CP12，CP15－17）构建中，先合成它的编码序列正负链4个DNA片段，然后配对退火，再连接成一个大片段，由于其5'端为EcoRI(E)粘性末端，3'端接了母体CPs 5'端ATG后至B HI(B)粘性末端的17bp序列，故此合成片段被直接经E和B双酶切构建pBV221/CP系列重组质粒，并分别经DNA测序验证，结果：在SDS－PAGE分析中，新构建的CP衍生物在宿主菌中的表达量均比母体CPs有明显提高，且的特异表达都为单抗OT3A的蛋白印迹试验所证实。另外，用兔抗pZP多抗的检测显示阴性结果，表明所选用的pZP-4肽段内无B细胞表位存在。意义：本工作不仅为今后其他CP分子设计和高表达研究结累了经验，也扩展了可供筛选的hCG CP避孕和／或肿瘤治疗性疫苗原系列。     

人颗粒裂解肽片段在大肠杆菌中的表达

目的：建立颗粒裂解肽（NKG5）的原核表达载体系统,并在大肠杆菌中获得表达。方法：采用寡核苷酸合成、PCR扩增得到NKG5编码序列,克隆到pGEM-T载体上,经测序正确后,再切下编码序列连接到重组表达载体pGEx-4T-1中,转化大肠杆菌BL21,用IPTG诱导重组工程菌表达,采用谷胱甘肽偶联的Sepharose 4B纯化重组蛋白。结果：重组菌株可以表达GST-NKG5融合蛋白,用免疫印迹反应鉴定纯化的融合蛋白,在相对分子质量34000处有一条带。结论：获得了在大肠杆菌中低表达的颗粒裂解肽融合蛋白,为后续研究奠定了基础。     

抗菌肽Pek Ⅱ基因在大肠杆菌中的融合表达及初步纯化

目的:研究抗茵肽PekⅡ基因在大肠杆菌中的融合表达并初步纯化.方法:根据大肠杆菌密码子的偏好性,人工设计并合成2段核苷酸序列,退火获得PckⅡ基因;将此基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-2中,构建成抗茵肽基因PekⅡ融合表达载体pGEX-PekⅡ,转化至大肠杆菌BL21中,用IPTG进行诱导.取超声破碎后的上清经Glutathione SepharoseTM 4亲和层析得到纯化融合蛋白.结果:PCR和测序表明已获得正确PekⅡ编码基因,SDS-PAGE显示29kD处有特异性的蛋白条带出现,纯化得到的GST-PekⅡ经MALDI-TOF MS分析得出其相对分子质量为29553.03.结论:抗菌肽PckⅡ基因在大肠杆菌中的融合表达获得成功,初步纯化得到纯品.     

抗菌肽PekⅡ基因在大肠杆菌中的融合表达及初步纯化

目的：研究抗菌肽PekⅡ基因在大肠杆菌中的融合表达并初步纯化。方法：根据大肠杆菌密码子的偏好性,人工设计并合成2段核苷酸序列,退火获得PekⅡ基因;将此基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-2中,构建成抗菌肽基因PekⅡ融合表达载体pGEX-PekⅡ,转化至大肠杆菌BL21中,用IPTG进行诱导。取超声破碎后的上清经Glutathione SepharoseTM4亲和层析得到纯化融合蛋白。结果：PCR和测序表明已获得正确PekⅡ编码基因,SDS-PAGE显示29kD处有特异性的蛋白条带出现,纯化得到的GST-PekⅡ经MALDI-TOFMS分析得出其相对分子质量为29553．03。结论：抗菌肽PekⅡ基因在大肠杆菌中的融合表达获得成功,初步纯化得到纯品。     

重组人α降钙素基因相关肽在大肠杆菌中表达条件的优化

为提高人α降钙素基因相关肽(bαCGRP)在大肠杆菌中的表达量,研究了本室构建的pET-hαCGRP重组质粒在E.coli BL21trxB(DE3)pKysS宿主菌中的表达条件.经SDS-PAGE分析和YLN2000凝胶影像分析结果表明,重组菌以LB为培养基,氨苄青霉素浓度为50 mg/L,开始诱导时的菌体密度为OD600=0.6～0.8,所加IPTG的浓度为0.75mmol/L,37℃摇床180±5r/min振荡诱导培养4 h时,可获得高效表达的hαCGRP融合蛋白.重组蛋白的最高表达量占菌体总蛋白的70%～80%;它主要以可溶性形式存在,为下一步纯化工作提供了方便.     

死亡素与泛素在大肠杆菌中的高效融合表达

死亡素是由21个氨基酸残基组成的广谱抗菌肽。为了高效表达可溶性的死亡素,本研究利用递归式PCR（recursive PCR, rPCR）扩增了死亡素基因thanatin,并将其和家蝇Musca domestica泛素基因ubiquitin构成嵌合基因,克隆到表达载体pET-32a,再与硫氧还蛋白融合后构建表达载体pET-TRX-UBI-THA。将酶切和测序鉴定正确的质粒转化表达宿主菌BL21,经0.6 mmol/L IPTG诱导,TRX-UBI-THA融合蛋白得到了高效可溶性表达。SDS-PAGE和Western blot检测结果表明融合蛋白的分子量为28.9 kD,与预期的结果一致,表达量占菌体总蛋白的46％。Western blot分析结果显示融合蛋白能与Ni-NTA鏊合物特异性的结合,表明在融合蛋白的N-端带有6×His标签。利用C-端带有6×His标签的泛素C-端水解酶对融合蛋白进行切割,切割产物经Ni²⁺-NTA亲和柱和HPLC纯化（纯化量为5.4 mg/L）,Tricince-SDS-PAGE电泳得到单一的泛素蛋白条带。电喷雾质谱(ESI-MS)分析表明,纯化的泛素分子量为2.57 kD,与通过氨基酸预测的分子量完全一致。利用琼脂孔穴扩散法对泛素活性进行检测,结果显示纯化的泛素对大肠杆菌K12D31和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus具有较强的活性抑制。本研究表明,利用泛素融合技术可以高效表达可溶性的死亡素。     

Functional expression,purification, and antimicrobial activity of a novel antimicrobial peptide MLH in Escherichia coli

In this study, a novel heterozygous antimicrobial peptide MLH was synthesized, expressed, purified, and characterized. The peptide Md-cec-LL-37_Hp (MLH) was selected through bioinformatic analysis using musca domestica antimicrobial peptide (Cec-Med), human antimicrobial peptide LL-37, and helicobacter pylori antimicrobial peptide (Hp) as parent peptides. The target gene was synthesized by overlap extension PCR (SOE-PCR) and connected to the expression vector pET-32a (+), and the recombinant plasmid pET-32a-MLH was transformed to Escherichia coli for constructing pET-32a-MLH/BL21 (DE3). Isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) was used to induce protein expression, and SDS-PAGE and western blot were adopted to test the target protein. And fermentation condition was optimized to get the mass expression of the fusion protein. The Ni²⁺ affinity chromatographic column was used to purify. Active heterozygous peptide was obtained after renaturation. Finally, the activity of the heterozygous antimicrobial peptide was identified. The fusion peptide showed significant antimicrobial effect on both E. coli and Staphylococcus aureus.     

D-乳酸高产菌菊糖芽胞乳杆菌Y2-8磷酸果糖激酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达

以D-乳酸高产菌菊糖芽胞乳杆菌Y2-8基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到960 bp的磷酸果糖激酶基因(pfk)。氨基酸序列比对分析表明,该磷酸果糖激酶(PFK)与其他乳酸菌PFK具有保守的底物结合位点,但是其变构效应物结合位点存在差异。将pfk基因克隆到表达载体pSE380上,获得重组菌E-pSE-pfk。进一步通过诱导条件的优化,重组菌的PFK比酶活达到4.89 U/mg,是优化前的4.79倍。采用低温诱导策略有助于实现菊糖芽胞乳杆菌pfk基因在大肠杆菌中可溶性表达。     

人成骨蛋白-1成熟肽基因在大肠杆菌中的克隆与表达

本实验报告了人成骨蛋白 - 1成熟肽基因在大肠杆菌中的克隆与高效表达。通过计算机软件分析 ,采用大肠杆菌偏爱密码子设计并分段合成了人成骨蛋白 - 1成熟肽编码基因片段。用 PCR技术扩增目的基因片段 ,先克隆到 p UC1 9载体上 ,测序正确后再将其克隆到 p BV2 2 0表达载体上 ,以DH5α为宿主菌 ,42℃ ,6 h诱导表达。经 SDS- PAGE鉴定分析 ,在约 1 6× 1 0 3处有一新的蛋白质条带 ,扫描分析表明 ,该条带占菌体总蛋白含量的 40 %左右。     

外源基因在大肠杆菌中的高效表达

为了提高外源蛋白在大杨杆菌中的表达量,人们对大肠杆菌表达系统进行了许多研究。作者综述了有关外源基因在大肠杆菌中高效表达的研究进展。     

磷脂酰丝氨酸合成酶基因pss的克隆与表达

磷脂酰丝氨酸合成酶能催化转酯反应,是定向合成特定磷脂类物质特别是磷脂酰丝氨酸的工具酶,但出发菌株产量低,很大程度上限制了酶法合成磷脂酰丝氨酸的工业化应用。利用表达载体pET-22b,实现了大肠杆菌磷脂酰丝氨酸合成酶基因在大肠杆菌BL21(DE3)中的同源高效表达。利用镍亲和柱对表达产物进行纯化,并用HPLC法对纯化后的重组酶的活力进行检测。结果表明,目的蛋白可在短时间内进行大量表达,蛋白含量是出发菌株的100倍,同时经6h的转酯反应转化率达到33%,重组磷脂酰丝氨酸合成酶活力达到69U/mg蛋白。     

Cloning of the ethidium efflux gene from Escherichia coli

The gene specifying the ethidium efflux system of Escherichia coli has been cloned on a 3.2 kbp HindIII fragment and located on a 1.2 kbp fragment within this. Cross-resistance studies indicate that the system has a broad specificity for monovalent cations and the gene shows no hybridisation with similar genes found in Staphylococci.     

大肠杆菌细胞周质底物结合蛋白gsiB基因的克隆及其表达条件的优化

为深入研究大肠杆菌谷胱甘肽转运系统的蛋白质结构和功能, 对该系统中的gsiB基因进行了克隆和表达条件的优化。根据大肠杆菌谷胱甘肽转运系统中底物结合蛋白gsiB基因序列, 利用PCR方法扩增到该基因的编码区序列, 利用SLIC (Sequence and ligation–independent cloning)方法直接将其插入pWaldo-GFPe中, 成功构建了重组表达质粒pWaldo-GFP-GsiB。将重组质粒转化不同的大肠杆菌表达菌株进行诱导表达, 通过改变培养温度和IPTG浓度等条件, 得到了能够大量表达目标蛋白的重组子。结果表明: 大肠杆菌BL21(DE3)是 gsiB基因表达的最佳宿主菌; 18℃低温诱导培养有利于gsiB基因的大量表达; 0.1 mmol/L IPTG足够诱导gsiB基因表达, 增加IPTG浓度(0.1 mmol/L~1.0 mmol/L)并不能明显地促进gsiB基因的表达。Western blotting结果显示目标蛋白质有表达, 其分子量大小与预期相符。     

Hirudin as a novel fusion tag for efficient production of lunasin in Escherichia coli

Fusion expression provides an effective means for the biosynthesis of longer peptides in Escherichia coli. However, the commonly used fusion tags are primarily suitable for laboratory scale applications due to the high cost of commercial affinity resins. Herein, a novel approach exploiting hirudin as a multipurpose fusion tag in combination with tobacco etch virus (TEV) protease cleavage has been developed for the efficient and cost-effective production of a 43-amino acid model peptide lunasin in E. coli at preparative scale. A fusion gene which allows for lunasin to be N-terminally fused to the C-terminus of hirudin through a flexible linker comprising a TEV protease cleavage site was designed and cloned in a secretion vector pTASH. By cultivation in a 7-L bioreactor, the fusion protein was excreted into the culture medium at a high yield of ~380?mg/L, which was conveniently recovered and purified by inexpensive HP20 hydrophobic chromatography at a recovery rate of ~80%. After polishing and cleavage with TEV protease, the finally purified lunasin was obtained with ≥95% purity and yield of ~86?mg/L culture medium. Conclusively, this hirudin tagging strategy is powerful in the production of lunasin and could be applicable for the production of other peptides at preparative scale.