在转基因水稻植株中蜡质基因第1内含子对-基因表达影响的分析

为阐明水稻Wx基因第1内含子在整体植株的胚乳发育阶段是否确有增强基因表达的功能,以及弄清高和中、低直链淀粉含量的水稻品种Wx基因第1内含子1 126个碱基之间有差异的16个碱基中哪几个碱基影响了该内含子的正常剪接从而降低了基因的表达水平,我们分别用高直链淀粉含量品种的Wx基因翻译起始密码子ATG上游3.1和2.1 kb片段与GUS基因编码区融合构建成嵌合质粒,并在此基础上,(1)去除嵌合质粒中Wx基因的第1内含子;(2)将嵌合质粒Wx基因的第1内含子中(3.1 kb)与中、低直链淀粉含量的水稻品种Wx基因第1内含子有差异的6个碱基以中、低直链淀粉含量的水稻品种的碱基替换.将上述改造过的几种质粒分别转化粳稻品种中花11,测定转化植株未成熟种子胚乳中的GUS活性.结果表明第1内含子的缺失或此内含子的5′端剪接点上的碱基G以T替换均造成GUS活性的急剧下降,说明第l内含子在植株体内的确有增强基因表达的功能,而且在中、低直链淀粉含量的水稻品种中Wx基因第1内含子5′端剪接点上自然存在的G→T突变是造成这些品种中该内含子剪接不正常、从而使Wx基因表达水平和直链淀粉含量下降的主要原因.     

水稻蜡质基因5‘非翻译区一个与调控有关的内含子

从发育的水稻种子中分离出ＲＮＡ,经ＲＴ－ＰＣＲ反应并结合顺序测定,在籼稻２３２蜡质基因编码区５‘上游非翻译区中证明确实存在一个长度为１１２６ｂｐ的内含子,其Ａ＋Ｔ碱基的含量高达６７．４％,它的边界符合真核基因内含子的ＧＴ－ＡＧ规则。表明该内含子与蜡质基因的表达调控有一定的关系。     

糯性水稻中蜡质基因第1内含子的剪接活性

以前的研究结果表明 ,非糯性的稻米中直链淀粉的含量与各品种中蜡质基因 (Wx)第 1内含子被剪接的效率有关 ,即剪接效率高的品种直链淀粉含量也高。为弄清糯米中不含直链淀粉是否也与此内含子剪接效率有关系 ,构建了蜡质基因启动子 (来自籼稻品种2 32 )、蜡质基因第 1内含子 [来自籼稻品种 2 32 (高直链淀粉含量的品种 )或粳稻品种寒丰 6 36 6 (中、低直链淀粉含量的品种 ) ]与GUS报告基因组成的两种嵌合基因 ,将含有这两种嵌合基因的质粒分别转化进粳性糯稻品种奉糯 5 93中 ,同时还分别转化进非糯性的籼稻品种特青和粳稻品种中花 11中作为对照 ,测定它们的抗性愈伤组织与转基因植株未成熟种子胚乳中的GUS酶活性。结果表明与在非糯性的籼稻和粳稻中一样 ,这两种嵌合质粒在不合成直链淀粉的糯稻中也有相当水平的表达。从此结果可以推测 ,糯稻品种有从嵌合基因的转录本中剪接蜡质基因第 1内含子的正常能力 ,而在糯稻中缺乏直链淀粉可能是糯稻蜡质基因第1内含子中的其它突变所造成的     

糯性水稻中蜡质基因第1内含子的剪接活性

以前的研究结果表明,非糯性的稻米中直链淀粉的含量与各品种中蜡质基因（Ｗｘ）第１内含子被剪接的效率有关,即剪接效率高的品种直链淀粉含量也高。为弄清糯米中不含直链淀粉是否也与此内含子剪接效率有关系,构建了蜡质基因启动子,（来自灿稻品种２３２）、蜡质基因第１内含子「来自籼稻品种２３２（高直链淀粉含量的品种）或粳稻品种寒丰６３６６（中、低直链淀粉含量的品种）或粳稻品种寒丰６３６６（中、低直链淀粉含量的品种     

水稻蜡质基因5'非翻译区一个与调控有关的内含子

从发育的水稻种子中分离出RNA,经RT－PCR反应并结合顺序测定,在籼稻232蜡质基因编码区5′上游非翻译区中证明确实存在一个长度为1126bp的内含于,其A＋T碱基的含量高达67．4％,它的边界符合真核基因内含子的GT-AG规则。表明该内含子与蜡质基因的表达调控有一定的关系。     

水稻OsBP-73基因表达需要其内含子参与

该实验室以前的研究表明,水稻OsBP-73基因含有2个外显子和1个长度为2 471 bp的内含子.该文报告用OsBP-73基因ATG翻译起始密码子(在第1外显子中)上游序列(1- 818～ 215)与GUS基因构成嵌合质粒pRSSl,将该质粒转化水稻后,在抗性愈伤组织和转基因植株中未能检测到GUS基因的表达.只有用含有完整的内含子及其上游序列(1 818～ 2 844)与GUS基因构成嵌合质粒(p13GNF)时,才能在p13GNF的转基因抗性愈伤组织和植株中检测到GUS基因的表达.实验还证明,单是内含子序列并不能驱动GUS基因在转基因水稻中表达.由此推测:OsBP-73基因的启动子序列驱动基因表达时,需要基因内含子的参与.     

内含子对提高转基因动物基因表达效率的影响

综述了内含子在转基因动物基因表达中的作用,对内源性内含子和异源内含子对转基因表达的影响进行分析,讨论了内含子提高转基因动物基因表达效率的三种可能机制,并指出在表达载体构建中应考虑到内含子的重要性．     

水稻蜡质基因第一内含子碱基突变引起其RNA二级结构的可能变化

通过体外转录得到籼稻品种２３２蜡质基因第一内含于５’端４３０ｂｐ的ｓｓＲＮＡ分子,以及在此区域发生了自然突变的粳稻品种寒丰蜡质基因经一内含子５’端同样长度的ｓｓＲＮＡ分子。部分变性胶电泳结果表明两种ｓｓＲＮＡ分子的迁移速率不同。将两种ｓｓＲＮＡ分子的核酸序列用计算机分析,表明此两种ｓｓＲＮＡ分子能形成不同的茎－环结构,自由能值也有差异。对突变引起的这些不同与两种水稻品种蜡质基因转录本剪接的差异进行     

水稻蜡质基因及其利用研究进展

简要介绍了水稻蜡质基因的等位基因位点及其表达特性。并从蜡质基因第1内含子核苷酸和蜡质基因剪切方式以及蜡质基因相关的顺式作用元件与反式作用因子等方面阐述了水稻蜡质基因表达调控,还概述了水稻蜡质基因的分子标记辅助选育方面的研究。从近年来的报道显示,利用反义RNA技术抑制水稻内源蜡质蛋白的表达是目前蜡质基因应用研究的主要方向。关于蜡质基因的研究,在其它作物中也都有报道。     

水稻蜡质基因第一内含子碱基突变引起其RNA二级结构的可能变化

通过体外转录得到籼稻品种232蜡质基因第一内含子5’端430 bp的ssRNA分子,以及在此区域发生了自然突变的粳稻品种寒丰蜡质基因第一内含子5’端同样长度的ssRNA分子。部分变性胶电泳结果表明两种ssRNA分子的迁移速率不同。将两种ssRNA分子的核酸序列用计算机分析,表明此两种ssRNA分子能形成不同的茎-环结构,自由能值也有差异。对突变引起的这些不同与两种水稻品种蜡质基因转录本剪接的差异进行了讨论。     

水稻蜡质基因5‘上游区中31bp序列增强基因表达的作用

为研究水稻腊质基因（ＷＸ）５‘上游区中一个与胚乳核蛋白绫的３１ｂｐ在基因表达中的作用,将一系列包含或不包含此序列的长度不同的Ｗｘ启动区与β－葡萄糖苷酸酶基因（ＧＵＳ）编码区连接,成嵌合质粒。针这些质粒通过杆菌介导转化水稻幼胚愈伤组织发化产生转朱。分别测定抗性愈伤组织中与转基因株未成熟种子胚乳中的ＧＵＳ酶活性,结果表明含有３１ｂｐ序列的比不含此序列的ＷＸ启动区使ＧＵＳ报告基因的表达水平高出２～３倍。     

Ⅲ类内含子及其对基因表达的影响

内含子是指断裂基因中的非编码区序列。根据内含子的核苷酸序列和RNA潜在折叠方式不同,可分成四种类型：Ⅰ类内含子、Ⅱ类内含子、Ⅲ类内含子和Ⅳ类内含子。Ⅲ类内含子为真核细胞前mRNA中的内含子。它可以启动某些基因的表达,影响基因的表达量;增加mRNA分子的稳定性;并通过选择性剪接调控基因的表达。Ⅲ类内含子可以提高转基因动物基因的表达效率。因此,基因工程中,为了提高表达效率,是选用基因组基因还是cDNA基因,应视具体基因而定。     

水稻蜡质基因5'上游区中31 bp序列增强基因表达的作用

为研究水稻蜡质基因 (Wx) 5’上游区中一个与胚乳核蛋白结合的 31bp序列在基因表达中的作用 ,将一系列包含或不包含此序列的长度不同的Wx启动区与 β 葡萄糖苷酸酶基因 (GUS)编码区连接 ,构建成嵌合质粒。将这些质粒通过农杆菌介导转化水稻幼胚愈伤组织 ,并分化产生转基因植株。分别测定抗性愈伤组织中与转基因植株未成熟种子胚乳中的GUS酶活性。结果表明含有 31bp序列的比不含此序列的Wx启动区使GUS报告基因的表达水平高出 2～ 3倍     

水稻蜡质基因5＇上游区缺失对基因表达的影响

为研究水稻蜡质基因（ｗａｘｙ）５＇上游调控区中存在的顺式作用元件,我们将水稻ｗａｘｙ基因翻译起始声、（ＡＴＧ）５＇上游３．４ｋｂ（－２１１８～＋１２９１ｂＰ）片段经外切核酸酶ＥｘｏⅢ部分酶解,得到一系列５＇端缺失的片段。将这些缺失片段分别与ｇｕｓ基因编码区连接,构建成融合质粒,经ＰＥＧ介导引入水稻原生质体,２６℃培养４８ｈ后,定量测定ＧＵＳ酶活力,并以同时导入的由３５Ｓ启动子指导的荧光素酶（ＬＵＣ）基因表达的酶活力作为内对照。结果表明,ＧＵＳ酶活性随５’上游调控区长度的减少而逐渐减弱。由─８６１ｂｐ缺失至─６４０ｂＰ时,ｇｕｓ基因表达水平有较明显的降低,推测在该区域中可能存在一个顺式作用元件区。     

水稻蜡质基因第一内含子中g片段上核蛋白因子结合位点的确定

水稻蜡质基因５’非翻译区中的第一内含子具有增强基因表达的作用,本实验室曾检测到该内含子中的一段１７１ｂｐ长的ｇ的片段与水稻未成熟种子核蛋白存在特异性结合。本文进一步用凝胶滞后实验和足印实验确定了该核蛋白在ｇ片段上的结合位点位于蜡质基因转录起始点下游７８３－８１８ｂｐ处,该结合位点富含ＡＴ碱基;Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｍ ｂｌｏｔ实验测出该蛋白的分子量约为２０ｋＤ。用硫酸铵分步沉淀和肝素－Ｓｅｐｈａｒｏ     

通过根癌农杆菌介导的共转化获得具有蜡质基因反义片段的转基因水稻

在构建剔除潮霉素抗性基因的反义蜡质基因重组质粒p13W8的基础上,用分别携带p13W8质粒和有潮霉素抗性基因的pCAMBIA1300质粒的根癌农杆菌,在不同处理条件下对粳稻3个品种进行共转化.试验结果显示,共感染混合液中pCAMBIA1300菌液比例高,抗性愈伤组织的转化频率也较高;抗性愈伤组织的PCR检测结果表明,潮霉素抗性基因的阳性检测率为98%,反义蜡质基因的阳性检测率为68%.在105株转基因植株中,反义蜡质基因阳性株为30株,占转基因植株的28.6%.乙酰丁香酮处理组的平均转化频率略高于未处理组;在乙酰丁香酮的各种处理中,直接浸泡愈伤组织的转化频率稍高于其它处理方式.     

转基因小鼠中外源基因部分内含子序列的缺失及其对转录的影响

利用PCR扩增及PCR测序在显微注射法产生的转基因小鼠中发现,整合在小鼠染色体上的肌球蛋白轻链2启动子(myosinlightchain2promoter,MLC2)-糜酶(chymase)外源融合基因存在两种形式,一种为全长的融合基因,另一种在糜酶结构基因的第一内含子中缺失了213bp的序列。RT-PCR结果表明,缺失了部分内含子序列的外源融合基因不能在转基因小鼠心脏中表达.而全长的外源融合基因则能较高水平地表达,竞争性PCR定量实验表明在200ng心脏总RNA反转录产物中约含5.05(±1.38)×106个糜酶cDNA分子。上述结果表明,糜酶结构基因的第一内含子可能对MLC2-糜酶基因的表达具有调控作用。     

水稻转基因植株后代中外源基因异常分离的研究

以用农杆菌介导法育成的日本晴等3个品种（系）的转基因水稻为材料,对外源基因的分离情况进行了研究。这几份转基因水稻都携带串联排列的抗虫基因cry1Ab和报告基因gusA等基因,在自交后代中,cry1Ab和gusA协同分离,但阳性植株与阴性植株之比都显著小于3：1,阴性植株显著偏多,以杂合转基因植株（gusA1-)作母本植株,与常规品种（-1－）杂交所得测交F1,阳性植株（＋／－）和阴性植株（－／－）的比例基本符合1：1,在反交时,阴性植株与阳性植株之比显著大于1：1的比例,比较日本晴转基因后代中gusA阳性株与阴性株的结实率发现,前者的结实率显著低于后者,综合上述结果可以看出,携带crylAb等转基因的花粉存在竞争劣势,可能是导致外源基因异常分离的主要原因。     

水稻受盐抑制基因OsZFP1的转基因分析

OsZFP1(水稻锌指蛋白1)基因编码的蛋白含有3个推测的Cys2/Cys2-型锌指结构域,它的表达受盐胁迫负调控.构建了以35S为启动子的OsZFP1基因的植物表达载体,并将其转入拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)植物和水稻(Oryza sativa L.)愈伤组织中以过量表达OsZFP1基因.转基因的拟南芥植株和水稻愈伤组织对盐处理的敏感性都比野生型要高.这一结果表明OsZFP1基因可能编码一种负调控蛋白,它可能抑制某些盐诱导基因的表达.在ABA处理下,转基因拟南芥植株比野生型植株抽苔晚,说明OsZFP1基因的作用可能受ABA调节.