水稻蜡质基因5‘上游区中31bp序列增强基因表达的作用

为研究水稻腊质基因（ＷＸ）５‘上游区中一个与胚乳核蛋白绫的３１ｂｐ在基因表达中的作用,将一系列包含或不包含此序列的长度不同的Ｗｘ启动区与β－葡萄糖苷酸酶基因（ＧＵＳ）编码区连接,成嵌合质粒。针这些质粒通过杆菌介导转化水稻幼胚愈伤组织发化产生转朱。分别测定抗性愈伤组织中与转基因株未成熟种子胚乳中的ＧＵＳ酶活性,结果表明含有３１ｂｐ序列的比不含此序列的ＷＸ启动区使ＧＵＳ报告基因的表达水平高出２～３倍。     

水稻蜡质基因及其利用研究进展

简要介绍了水稻蜡质基因的等位基因位点及其表达特性。并从蜡质基因第1内含子核苷酸和蜡质基因剪切方式以及蜡质基因相关的顺式作用元件与反式作用因子等方面阐述了水稻蜡质基因表达调控,还概述了水稻蜡质基因的分子标记辅助选育方面的研究。从近年来的报道显示,利用反义RNA技术抑制水稻内源蜡质蛋白的表达是目前蜡质基因应用研究的主要方向。关于蜡质基因的研究,在其它作物中也都有报道。     

在转基因水稻植株中蜡质基因第1内含子对基因表达影响的分析

为阐明水稻Wx基因第1内含子在整体植株的胚乳发育阶段是否确有增强基因表达的功能,以及弄清高和中、低直链淀粉含量的水稻品种Wx基因第1内含子126个碱基之间有差异的16个碱基中哪几个碱基了该内含子的正常剪接从而降低了基因的表达水平,我们分别用高直链淀粉含量品种的Wx基因翻译起始密码子ATG上游3．1和2．1kb片段与GUS基因编码区融合构建成嵌合质粒,并在此基础上（1）去除嵌合质粒中Wx基因的第1内含子;（2）将嵌合质粒Wx基因的第1内含子中（3．1kb)与中、低直链淀粉含量的水稻品种Wx基因第1内含子有差异的6个碱基以中,低直链淀粉含量的水稻品种的碱基替换。将上述改造过的几种质粒分别转化粳稻品种中花11,测定转化植株未成熟种子胚乳中的GUS活性。结果表明第1内含子的缺失或此内含子的5′端剪接点上的碱基G以T替换均造成GUS活性的急剧下降,说明第1内含子在植株体内的确有增强基因表达的功能,而且在中、低直链淀粉含量的水稻品种中Wx基因第1内含子5′端剪接点上自然存在的G→T突变是造成这些品种中该内含子剪接不正常,从而使Wx基因表达水平和直链淀粉含量下降的主要原因。     

水稻蜡质基因5'非翻译区一个与调控有关的内含子

从发育的水稻种子中分离出RNA,经RT－PCR反应并结合顺序测定,在籼稻232蜡质基因编码区5′上游非翻译区中证明确实存在一个长度为1126bp的内含于,其A＋T碱基的含量高达67．4％,它的边界符合真核基因内含子的GT-AG规则。表明该内含子与蜡质基因的表达调控有一定的关系。     

水稻蜡质基因5＇上游区缺失对基因表达的影响

为研究水稻蜡质基因（ｗａｘｙ）５＇上游调控区中存在的顺式作用元件,我们将水稻ｗａｘｙ基因翻译起始声、（ＡＴＧ）５＇上游３．４ｋｂ（－２１１８～＋１２９１ｂＰ）片段经外切核酸酶ＥｘｏⅢ部分酶解,得到一系列５＇端缺失的片段。将这些缺失片段分别与ｇｕｓ基因编码区连接,构建成融合质粒,经ＰＥＧ介导引入水稻原生质体,２６℃培养４８ｈ后,定量测定ＧＵＳ酶活力,并以同时导入的由３５Ｓ启动子指导的荧光素酶（ＬＵＣ）基因表达的酶活力作为内对照。结果表明,ＧＵＳ酶活性随５’上游调控区长度的减少而逐渐减弱。由─８６１ｂｐ缺失至─６４０ｂＰ时,ｇｕｓ基因表达水平有较明显的降低,推测在该区域中可能存在一个顺式作用元件区。     

水稻蜡质基因5‘端上游顺序中的核蛋白结合区

通过ｗｘ基因转录起始点上游２１２０ｂｐ长的ＤＮＡ序列的测定,用不同的限制性内切酶对此片段进行消化,获得１５个大小不同的ＤＮＡ片段并构建成不同的亚克隆。     

应用酵母单杂交系统分离水稻蜡质基因5'调控区结合蛋白的基因

在水稻蜡质基因５’上游区中一段３１ｂｐ 核苷酸序列能与水稻未成熟种子核蛋白特异结合。为了克隆这一核蛋白基因,以此３１ ｂｐ 序列构建成“鱼饵”质粒,从水稻ｃＤＮＡ文库中筛选到１３ 个阳性克隆。根据这些阳性克隆中插入ｃＤＮＡ 片段的相互杂交结果,对这些克隆进行了分组。     

水稻蜡质基因5’端上游顺序中的核蛋白结合区

通过ｗｘ基因转录起始点上游２１２０ｂｐ长的ＤＮＡ序列的测定,用不同的限制性内切酶对此片段进行消化,获得１５个大小不同的ＤＮＡ片段并构建成不同的亚克隆。这些片段经３２Ｐ标记后分别做探针同水稻不同组织来源的核蛋白进行凝胶滞后实验和特异的竞争实验,表明ＨｉｎｆＩａ－２、ＨｉｎｆＩｃ－１、ＨｉｎｆＩｃ－２、ＨｉｎｆＩｄ、ＲｓａＩａ和ＲｓａＩｅ（ＲｓａＩａ片段与ＨｉｎｆＩａ、ＨｉｎｆＩｃ片段重叠）片段能与从未成熟的水稻种子中抽提的核蛋白结合。     

水稻蜡质基因5‘非翻译区一个与调控有关的内含子

从发育的水稻种子中分离出ＲＮＡ,经ＲＴ－ＰＣＲ反应并结合顺序测定,在籼稻２３２蜡质基因编码区５‘上游非翻译区中证明确实存在一个长度为１１２６ｂｐ的内含子,其Ａ＋Ｔ碱基的含量高达６７．４％,它的边界符合真核基因内含子的ＧＴ－ＡＧ规则。表明该内含子与蜡质基因的表达调控有一定的关系。     

水稻淀粉分支酶基因5′上游区缺失对基因表达的影响

为研究水稻淀粉分支酶基因 (sbe1) 5′上游调控区中存在的顺式作用元件 ,我们将水稻sbe1基因翻译起始点 (ATG) 5′上游区 1.2kb(- 10 96～ 74bp)片段经过不同限制性内切酶消化及外切核酸酶ExoIII部分消化 ,得到 4个 5′端缺失的片段。将这些缺失片段分别与 gus基因编码区连接 ,构建成融合质粒 ,经土壤农杆菌 (Agrobacterium)介导引入水稻 ,定量测定转基因水稻植株未成熟种子中的 gus酶活力。结果表明 ,- 5 16～ 6 4bp的sbe1启动子片段可以驱动gus基因的高表达 ,其它 3个启动子片段 (- 10 96～ 74bp ,- 2 95～ 74bp ,- 146～ 6 4bp)驱动 gus基因表达的能力较低。推测在sbe1基因 5′上游区 - 5 16～ - 2 95bp片段中可能存在能使 gus基因高表达的增强元件     

水稻Wx基因表达调控的研究进展

水稻Wx基因编码颗粒结合淀粉合成酶(GBSS),是控制直链淀粉合成的主效基因。文中主要从转录水平和转录后水平介绍水稻Wx基因表达调控的研究进展,同时介绍转基因、遗传背景以及环境温度对Wx基因表达的影响,并提出Wx基因表达调控研究中一些期待解决的问题。     

籼稻蜡质基因5＇上游区与GUS基因编码区融合基因的构建和在水稻中的瞬间表达

为了鉴定水稻蜡质基因５＇上游区的顺式作用因子与研究它们在组织专一性表达中的作用,我们对籼稻品种２３２的蜡质基因５＇上游－１１５至－２１２０的区域进行了顺序测定,并将此基因的５＇上游区同报告基因ＧＵＳ构建成融合基因,用基因枪粒子轰击的方法将此融合基因导入水稻未成熟种子的幼胚和糊粉层细胞中,瞬间表达检测的结果表明,我们构建的融合基因中蜡质基因５＇上游区的长度已足以使ＧＵＳ基因在上述组织中表达。     

水稻谷蛋白GluA-2基因5′上游序列控制下的UidA基因在转基因水稻胚乳中的表达模式

为了研究谷蛋白胚乳特异性表达启动子在我国栽培稻品种中的表达模式,将UidA基因分别置于水稻谷蛋白GluA—2基因750bp和2．3kb上游序列下游,利用农杆菌转化法导人栽培稻品种中花8号并获得转基因植株。Southern blot检测表明,UidA基因已经整合到水稻基因组当中并以单拷贝存在。Northern blot检测表明,开花后13～15d和11～13d,UidA基因和水稻内源的GluA—2基因的表达量分别达到最高,随后逐渐降低。对转基因植株种子的GUS染色表明,UidA基因仅在胚乳中表达,在糊粉层中GUS表达量最高。测定了2．3kb和750bp转基因植株种子的GUS活性,结果表明前者的GUS活性是后者的2～3倍。序列分析表明,位于GluA—2基因转录启始位点上游2170bD的G-box可能是一个与表达量相关的顺式调控元件。     

糯性水稻中蜡质基因第1内含子的剪接活性

以前的研究结果表明 ,非糯性的稻米中直链淀粉的含量与各品种中蜡质基因 (Wx)第 1内含子被剪接的效率有关 ,即剪接效率高的品种直链淀粉含量也高。为弄清糯米中不含直链淀粉是否也与此内含子剪接效率有关系 ,构建了蜡质基因启动子 (来自籼稻品种2 32 )、蜡质基因第 1内含子 [来自籼稻品种 2 32 (高直链淀粉含量的品种 )或粳稻品种寒丰 6 36 6 (中、低直链淀粉含量的品种 ) ]与GUS报告基因组成的两种嵌合基因 ,将含有这两种嵌合基因的质粒分别转化进粳性糯稻品种奉糯 5 93中 ,同时还分别转化进非糯性的籼稻品种特青和粳稻品种中花 11中作为对照 ,测定它们的抗性愈伤组织与转基因植株未成熟种子胚乳中的GUS酶活性。结果表明与在非糯性的籼稻和粳稻中一样 ,这两种嵌合质粒在不合成直链淀粉的糯稻中也有相当水平的表达。从此结果可以推测 ,糯稻品种有从嵌合基因的转录本中剪接蜡质基因第 1内含子的正常能力 ,而在糯稻中缺乏直链淀粉可能是糯稻蜡质基因第1内含子中的其它突变所造成的     

在转基因水稻植株中蜡质基因第1内含子对-基因表达影响的分析

为阐明水稻Wx基因第1内含子在整体植株的胚乳发育阶段是否确有增强基因表达的功能,以及弄清高和中、低直链淀粉含量的水稻品种Wx基因第1内含子1 126个碱基之间有差异的16个碱基中哪几个碱基影响了该内含子的正常剪接从而降低了基因的表达水平,我们分别用高直链淀粉含量品种的Wx基因翻译起始密码子ATG上游3.1和2.1 kb片段与GUS基因编码区融合构建成嵌合质粒,并在此基础上,(1)去除嵌合质粒中Wx基因的第1内含子;(2)将嵌合质粒Wx基因的第1内含子中(3.1 kb)与中、低直链淀粉含量的水稻品种Wx基因第1内含子有差异的6个碱基以中、低直链淀粉含量的水稻品种的碱基替换.将上述改造过的几种质粒分别转化粳稻品种中花11,测定转化植株未成熟种子胚乳中的GUS活性.结果表明第1内含子的缺失或此内含子的5′端剪接点上的碱基G以T替换均造成GUS活性的急剧下降,说明第l内含子在植株体内的确有增强基因表达的功能,而且在中、低直链淀粉含量的水稻品种中Wx基因第1内含子5′端剪接点上自然存在的G→T突变是造成这些品种中该内含子剪接不正常、从而使Wx基因表达水平和直链淀粉含量下降的主要原因.     

一个能与水稻未成熟种子核蛋白特异结合的31bp的DNA片段

水稻蜡质基因5'上游序列中有5个能与水稻胚乳核蛋白结合的片段,其中HinfId和RsaIe片段有部分重叠,而重叠部分含AACGT顺序。按重叠区上下游顺序合成了其中含有3次重复的AACGT顺序的31bp寡核苷酸,并以此为探针进行凝胶滞后实验,表明它不仅能与未成熟水稻种子的胚乳核蛋白特异结合,而且也与HinfId和RsaIe片段有强烈的竞争作用。因此31bp顺序中含有与水稻胚乳核蛋白专一结合位点,从而有可能应用此31bp的寡核苷酸作探针来分离编码蜡质基因的调控蛋白基因。