基于PacBio SMRT测序技术评估妊娠期糖尿病人的肠道菌群

[目的]肠道菌群是位于人体肠道内的微生物菌群,其组成与人类多种疾病相关。例如,已有研究表明肠道菌群的变化与妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus,GDM）的发病密切相关。因此本研究基于PacBio SMRT测序技术评估及比较了不同民族（汉族和蒙古族）及是否患GDM的孕妇的肠道菌群。[方法]本研究利用PacBio SMRT测序技术对97例患有GDM及健康的汉族和蒙古族孕妇粪便样本进行了全长16S rRNA测序及分析。[结果]总体来说,处于相同孕期的4组孕妇肠道菌群的组成相似,不同核心菌群展现出不同强弱的相关性。本研究在种的水平上共鉴定到了44个种。在汉族人中,患有妊娠期糖尿病的孕妇肠道菌群中Akkermansia muciniphila菌的相对丰度要显著低于健康孕妇;而在蒙古族人中,健康孕妇与GDM孕妇间差异并不明显。在健康对照中发现汉族孕妇肠道菌群中Bacteroides uniformis菌的相对丰度显著高于蒙古族孕妇;但在患有GDM组中未找到不同民族分组间的差异。另外,功能预测结果发现四组样本菌群功能组成高度相似,大多数功能基因都与能量代谢有关。汉族GDM患者与健康对照组间没有发现显著差异,但在蒙古族GDM患者中发现无机离子运输等功能相对丰度显著高于与蒙古族正常孕妇。[结论]在相同的孕期,妊娠期孕妇的核心肠道菌群结构与功能是相对稳定的,而民族差异也不会对妊娠期菌群产生显著性影响。但在四组间可以检测到一些低丰度的差异菌群,如Akkermansia muciniphila,其丰度的变化可能导致了肠道中一些与肠道营养吸收等有关的代谢发生变化,而这些变化可能与妊娠期糖尿病的发生密切相关。本研究将有助于探究肠道菌群在GDM发病机制中的作用。     

单分子实时测序技术的原理与应用

单分子DNA测序技术是近10年发展起来的新一代测序技术,也称为第三代测序技术,包括单分子实时测序、真正单分子测序、单分子纳米孔测序等技术。文章介绍了单分子实时(Single-molecule real-time,SMRT)测序技术的基本原理、性能以及应用。与Sanger测序法和下一代测序技术相比,SMRT测序具有超长读长、测序周期短、无需模板扩增和直接检测表观修饰位点等特点,为研究人员提供了新选择。同时,SMRT测序的低准确率备受争议(约85%),其中约93%的错误是插入缺失,因此,其数据应用于基因组组装前需先对数据进行纠错处理。目前,SMRT测序在小型基因组从头测序和完整组装中已有良好应用,并且已经或将在表观遗传学、转录组学、大型基因组组装等领域发挥其优势,促进基因组学的研究。     

几种耐热DNA聚合酶的比较

耐热DNA聚合酶广泛应用在PCR技术。本文将常用的几种耐热DNA聚合酶分为三大类,对它们的性质、差异、用途做一个简单的介绍。     

DNA提取对微生物多样性测序分析的影响

运用高通量测序技术分析复杂样品中微生物种群的变化情况,已经成为目前微生物研究领域的热点问题之一。而微生物的样品准备,如DNA提取和16S可变区的扩增等,对于测序完成后的数据分析以及微生物原始群落组成的影响是至关重要的。采用国产试剂盒(天根土壤微生物基因组提取试剂盒)和进口试剂盒(MOBIO土壤微生物基因组提取试剂盒)分别对土壤样品和羊瘤胃食糜样品进行DNA提取。然后选取总DNA起始量为25ng,对16S V3可变区进行PCR扩增和文库构建,最后通过数据分析比较不同试剂盒提取的DNA对微生物多样性变化的影响,包括OTU数目、稀释曲线、微生物数量及物种种类等。研究发现,在相同DNA模板量和PCR条件下,进口试剂盒提取的DNA能够获得更多的微生物种类。     

不同DNA聚合酶对运用ARTIC工作流的新型冠状病毒纳米孔测序的影响

摘要 目的：为了验证不同高保真DNA聚合酶是否会对运用ARTIC工作流进行新型冠状病毒纳米孔测序产生影响。方法：使用英国Nanopore公司MinION测序仪对2份已获得全基因组序列的新冠肺炎确诊病例核酸样本分别采用KAPA HiFi HotStart ReadyMix,PrimeSTAR?誖GXL DNA Polymerase和NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master Mix进行ARTIC工作流的多重PCR扩增,对扩增产物进行测序,并对测序质量进行分析。结果：不同高保真DNA聚合酶在相同扩增条件下,扩增产物的质检结果和测序质量均不相同,NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master Mix在覆盖度和测序深度上明显好于另外两种酶。结论：NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master Mix在纳米孔新型冠状病毒ARTIC快速测序工作流中的应用效果较好。     

基于PacBio三代测序的香瓜茄(人参果)基因组的组装北大核心CSCD

香瓜茄又名人参果,具有抗氧化、抗肿瘤、抗糖尿病等多种生物活性。为丰富茄科作物基因组信息及进化发育历程,获取香瓜茄全基因组序列信息,同时为香瓜茄相关分子研究奠定基础。以香瓜茄植物组织为试验材料,基于Illumina HiSeq构建小片段文库进行基因组特征评估,利用PacBio三代测序技术、Hi-C技术构建及组装香瓜茄全基因组数据库。利用生物信息学方法对获得的基因组序列进行组装、功能注释以及进化分析研究。结果表明,获得54.11 Gb Illumina HiSeq数据;获得55.08 Gb PacBio数据,reads平均长度为14 179 bp;获得Hi-C数据量约143 Gb;拼接得到该基因组contig序列总长为1.16 Gb,Hi-C纠错后contig N50为22.63 Mb;Hi-C挂载染色体,共有1.12 Gb长度的序列可以挂载到12条染色体上,占比97.16%;其中,能够确定顺序和方向的序列长度为1.08 Gb,占定位染色体序列总长度的96.11%,得到基因组大小1.25 Gb;预测有64.22%的重复序列,41 571个基因,99.06%的基因可以注释到NR、GO、KEGG等数据库中;预测得到4 360个tRNA、5 677个rRNA、154个miRNA;得到449个假基因。香瓜茄与马铃薯的进化时间大约在12.82 MYA。     

粪便留取量对粪便中细菌结构和功能的影响CSCD

目的探究不同粪便留取量对肠道菌群构成研究结果的影响,为肠道菌群构成研究中粪便样本的采集方式提供参考。方法本研究分别对全便和部分粪便进行预处理,并使用PacBio SMRT测序技术对10名志愿者的20份粪便样本进行了16S rRNA全长测序,通过多元统计学等手段对粪便中细菌的构成、多样性和功能进行比较分析。结果Eubacterium rectale、Eubacterium ventriosum和Allisonella histaminiformans等低丰度物种的相对丰度在不同粪便留取量中有一定差异,其在全便中的相对丰度均显著高于部分粪便(P<0.05)。但Wilcoxon配对检验发现粪便留取量对肠道菌群结构、多样性和功能的影响均无显著性差异(P>0.05)。不同个体间肠道菌群结构存在明显差异,且粪便留取量的影响远小于个体差异。结论全便和部分粪便两种粪便留取量对检测微生物的组成、多样性和功能无显著影响,因此取部分粪便即可满足对肠道菌群研究的要求。     

DNA测序技术比较

自从1953年,J.D.Watson和F.H.C.Crick发现DNA的双螺旋模型之后,DNA测序技术随着科学的进步得到了迅猛发展.1977年Sanger[1]发明DNA双脱氧末端终止测序技术,Maxam与Gilbert[2]发明利用化学降解法进行测序的技术,2种测序技术被誉为DNA测序技术的始祖.随后,在第1代DNA测序技术的基础上,相继出现了第2代测序技术、基因芯片技术以及第3代测序技术.总结并展望了每一代测序技术及基因芯片技术的诞生、原理及应用前景,为利用测序技术研究基因表达提供理论基础和实验依据.     

单分子实时测序技术在环境微生物研究中的应用

1975年,第一个cDNA的基因组——噬菌体фX174基因组的测序完成,标志着测序时代的开始。1996年以来人类基因组计划的发起极大地推动了测序技术的应用和发展,第二代测序技术也被称为高通量测序技术。而单分子DNA测序技术是最近10年内发展起来的新一代的测序技术,称为第三代测序技术,其中包括单分子实时测序(Single molecule real time sequencing,SMRT)、真正单分子测序和单分子纳米孔测序等技术。SMRT测序技术有超长读长、测序周期短、不需要模板扩增和直接检测表观修饰位点等特点,为研究人员提供了新的选择。本文综述了SMRT测序技术的基本原理、性能以及它在微生物16S rRNA基因、微生物全基因组以及微生物宏基因组测序等方面的应用,并分析了SMRT测序技术在环境微生物应用中的优势以及存在的问题。     

六妹羊肚菌PacBio基因组测序和DNA 6mA甲基化分析

羊肚菌属于子囊门真菌,是世界范围内最受欢迎的食用菌之一。本研究通过PacBio单分子实时测序技术对我国四川省成功栽培的六妹羊肚菌Morchella sextelata SCLS菌株进行全基因组测序,获得其高质量核基因组组装,大小为53.57Mb,重复序列含量为17.03%,包含42条重叠群（contigs）,重叠群N50高达1.82Mb,其中13条重叠群两端均含有端粒重复序列,为完整的染色体。通过链特异性RNA-seq测序和转录本拼接,并结合多种基因预测策略,预测到13 182个蛋白编码基因,包括267个碳水化合物活性酶,11个次生代谢产物合成基因簇。通过与内蒙古地区栽培的六妹羊肚菌菌株NZTD180501373基因组比较发现,六妹羊肚菌进化过程中可能发生过染色体重组事件,二者具有33 055个SNP和48 726个InDel位点差异,并且各自拥有超过6Mb的特有序列。此外,相比于梯棱羊肚菌M. importuna,六妹羊肚菌SCLS菌株中与逆转录转座酶有关的orthogroup发生了扩张,并且拥有5个成员数超过100的特有逆转录转座酶基因家族。对SCLS菌株中的DNA N⁶腺嘌呤甲基化（6mA）修饰进行了鉴定,发现SCLS菌株基因组中0.42%的腺嘌呤被6mA甲基化,其含量显著高于已报道的6种双核亚界（Dikarya）真菌。6mA甲基化位点在逆转录转座子上显著富集,表明六妹羊肚菌中6mA甲基化可能调控逆转录转座子的活性,这也是首次在真菌中报道6mA甲基化与转座子相关。     

单分子测序技术在肿瘤诊断中的应用研究进展

肿瘤的发生发展通常与多个基因的遗传突变、表达异常有关,全面深入地分析肿瘤基因组、转录组及表观遗传组学对于快速剖析疾病特定基因簇及修饰位点至关重要。之前,研究者们主要采用第二代测序技术进行有效信息的挖掘,然而随着研究的不断深入,第二代测序技术表现出诸如序列拼接困难、低丰度难以检出等缺点。因此,单分子测序技术以其独特的优势应运而生,文中主要对单分子测序技术在几种常见肿瘤中的研究现状进行了综述,并展望了其在临床诊断中的应用前景。     

DNA测序技术概述

DNA测序技术作为现代生命科学研究的核心技术之一,自上世纪70年代中期DNA发明以来发展迅速。我们简要综述现有的几代DNA测序技术的原理及其发展历程,并对未来可能出现的第三代测序进行预测。     

An integrative approach for the optical sequencing of single DNA molecules

A new approach for optically sequencing ensembles of single DNA molecules using DNA polymerase to mediate the consecutive incorporation of fluorochrome-labeled nucleotides into an array of large single DNA molecules is presented. The approach utilizes cycles of labeled fluorochrome addition, detection to count incorporations, and bleaching to reset the counter. These additions are imaged and analyzed to estimate the number of labeled additions and to correlate them on a per-locus basis along DNA backbones. Initial studies used precisely labeled polymerase chain reaction products to aid the development and validation of simple models of fluorochrome point spread functions within the imaging system. In complementary studies, nucleotides labeled with the fluorochrome R110 were incorporated into surface-elongated lambda DNA, and fluorescent signals corresponding to the addition of R110-dUTP were counted and assigned precise loci along DNA backbones. The labeled DNAs were then subjected to photobleaching and to a second cycle of addition of R110-labeled nucleotides-a second round of additions was correlated with the first to establish strings of addition histories among the ensemble of largely double-stranded templates. These results confirm the basic operational validity of this approach and point the way to the development of a practical system for optical sequencing.     

The Rate-limiting Step of DNA Synthesis by DNA Polymerase Occurs in the Fingers-closed Conformation

DNA polymerases maintain genomic integrity by copying DNA with high fidelity, part of which relies on the polymerase fingers opening-closing transition, a series of conformational changes during the DNA synthesis reaction cycle. Fingers opening and closing has been challenging to study, mainly due to the need to synchronise molecular ensembles. We previously studied fingers opening-closing on single polymerase-DNA complexes using single-molecule FRET; however, our work was limited to pre-chemistry reaction steps. Here, we advance our analysis to extensible substrates, and observe DNA polymerase (Pol) conformational changes across the entire DNA polymerisation reaction in real-time, gaining direct access to an elusive post-chemistry step rate-limiting for DNA synthesis. Our results showed that Pol adopts the fingers-closed conformation during polymerisation, and that the post-chemistry rate-limiting step occurs in the fingers-closed conformation. We found that fingers-opening in the Pol-DNA binary complex in the absence of polymerisation is slow (～5.3 s^?1), and comparable to the rate of fingers-opening after polymerisation (3.4 s^?1); this indicates that the fingers-opening step itself could be largely responsible for the slow post-chemistry step, with the residual rate potentially accounted for by pyrophosphase release. We also observed that DNA chain-termination of the 3′ end of the primer increases substantially the rate of fingers-opening in the Pol-DNA binary complex (5.3 → 29 s^?1), demonstrating that the 3′-OH residue is important for the kinetics of fingers conformational changes. Our observations offer mechanistic insight and tools to offer mechanistic insight for all nucleic acid polymerases.     

SMRT sequencing only de novo assembly of the sugar beet (Beta vulgaris) chloroplast genome

Background

Third generation sequencing methods, like SMRT (Single Molecule, Real-Time) sequencing developed by Pacific Biosciences, offer much longer read length in comparison to Next Generation Sequencing (NGS) methods. Hence, they are well suited for de novo- or re-sequencing projects. Sequences generated for these purposes will not only contain reads originating from the nuclear genome, but also a significant amount of reads originating from the organelles of the target organism. These reads are usually discarded but they can also be used for an assembly of organellar replicons. The long read length supports resolution of repetitive regions and repeats within the organelles genome which might be problematic when just using short read data. Additionally, SMRT sequencing is less influenced by GC rich areas and by long stretches of the same base.

Results

We describe a workflow for a de novo assembly of the sugar beet (Beta vulgaris ssp. vulgaris) chloroplast genome sequence only based on data originating from a SMRT sequencing dataset targeted on its nuclear genome. We show that the data obtained from such an experiment are sufficient to create a high quality assembly with a higher reliability than assemblies derived from e.g. Illumina reads only. The chloroplast genome is especially challenging for de novo assembling as it contains two large inverted repeat (IR) regions. We also describe some limitations that still apply even though long reads are used for the assembly.

Conclusions

SMRT sequencing reads extracted from a dataset created for nuclear genome (re)sequencing can be used to obtain a high quality de novo assembly of the chloroplast of the sequenced organism. Even with a relatively small overall coverage for the nuclear genome it is possible to collect more than enough reads to generate a high quality assembly that outperforms short read based assemblies. However, even with long reads it is not always possible to clarify the order of elements of a chloroplast genome sequence reliantly which we could demonstrate with Fosmid End Sequences (FES) generated with Sanger technology. Nevertheless, this limitation also applies to short read sequencing data but is reached in this case at a much earlier stage during finishing.

Electronic supplementary material

The online version of this article (doi:10.1186/s12859-015-0726-6) contains supplementary material, which is available to authorized users.     

基于PacBio测序数据的蜜蜂球囊菌转录因子、融合基因及RNA编辑事件的鉴定

【目的】本研究旨在利用已获得的PacBio单分子实时(single molecule real-time, SMRT)测序数据对蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis菌丝(AaM)和孢子(AaS)中的转录因子(TF)、融合基因和RNA编辑事件进行鉴定和分析,以期丰富蜜蜂球囊菌的相关信息,并为进一步探究它们的功能提供理论依据。【方法】利用BLASTx工具将AaM和AaS的全长转录本序列比对到Nr, Swiss-Prot和KEGG数据库以获得一致性最高的蛋白序列,再利用hmmscan软件将上述蛋白序列比对到Plant TFdb数据库以获得TF的分类及注释信息。采用TOFU软件中的fusion_finder.py程序进行融合基因的预测,进而分析融合基因的序列和位置信息。使用SAMtools预测AaM和AaS中的RNA编辑事件,再利用ANNOVAR软件对RNA编辑事件进行注释,进而采用相关生物信息学软件对RNA编辑位点基因进行GO功能和KEGG通路注释。【结果】在AaS中共鉴定到17个TF家族的213个TF,其中C2H2家族包含的TF成员最多。在AaM和AaS中分别鉴定到921和510个融合基因,二者共有的融合基因为510个,特有的融合基因分别为411和0个。在AaM和AaS中分别鉴定到547和191次RNA编辑事件,其中AaM中同义单核苷酸突变的数量最多,AaS中非同义单核苷酸突变的数量最多。此外,在AaM中鉴定到12种碱基替换类型,其中发生C->T的RNA编辑事件数量最多,达到158次;在AaS中鉴定到9种碱基替换类型,其中发生C->T和G->T的RNA编辑事件数量最多,均有42次。AaM和AaS中RNA编辑位点基因分别涉及19和24个GO功能条目;此外还能注释到11和20条KEGG通路。【结论】蜜蜂球囊菌的菌丝和孢子中含有丰富的TF、融合基因和RNA编辑位点;转录因子C2H2家族与蜜蜂球囊菌菌丝和孢子的生长发育和细胞活动具有潜在关联;RNA编辑事件的碱基替换类型在蜜蜂球囊菌和其他物种中具有物种特异性;RNA编辑可能在蜜蜂球囊菌菌丝和孢子的生长和代谢中发挥作用。