硫辛酸合成酶在Lepr~(db/db)小鼠肝肾中的表达

目的检测瘦素受体缺陷的Lepr~(db/db)小鼠体内肝、肾中硫辛酸合成酶(LIAS)的表达。方法分别选取10周龄Lepr~(db/+)与Lepr~(db/db)雄性小鼠各8只,禁食8 h后,测量两组小鼠体重及空腹血糖(FPG);用乙醚麻醉动物,经腹主动脉采血,处死动物,取肝、肾并称重。取肝右叶和左肾经4%多聚甲醛固定,进行肝、肾组织病理学检查。分离血清,用试剂盒检测血清中CHO、TG、HDL、LDL含量。应用线粒体分离试剂盒分离肝、肾组织线粒体,提取总蛋白,采用western blot方法检测LIAS蛋白的表达。结果组织病理观察,发现Lepr~(db/+)小鼠肝肾结构完整,而Lepr~(db/db)小鼠肝细胞出现脂肪变性,肾小球肥大,基底膜增厚,系膜区增宽;与Lepr~(db/+)小鼠比较,Lepr~(db/db)小鼠体重、GLU、CHO、TG、LDL及AST明显增高,差异有显著性(P0.05);与Lepr~(db/+)小鼠比较,Lepr~(db/db)小鼠肝肾线粒体内LIAS蛋白表达量均增高,差异有显著性(P0.05)。结论瘦素受体缺陷的Lepr~(db/db)小鼠存在糖脂代谢紊乱、肝肾细胞损伤、肝肾组织线粒体LIAS蛋白的表达增高。     

人多瘤病毒7 TaqMan探针实时定量PCR检测方法的建立

目的:建立人多瘤病毒7(HPy V7)核酸快速、特异的Taq Man探针实时定量PCR检测方法。方法:分别设计HPy V7特异性的引物与Taq Man探针,建立实时荧光定量PCR方法,并对其特异性、灵敏性和重复性进行评价;用建立的方法检测200份健康成人志愿者的血清和300份急性呼吸道感染住院儿童的鼻咽抽吸物样本。结果:所建立的实时定量PCR方法对HPy V7的检测灵敏度可达10拷贝/μL,检测线性范围为101~1010拷贝/μL,且实验特异性和重复性好(CV1.0%);采用该方法,从200份血清样本中检出9份阳性标本。结论:建立了HPy V7 Taq Man探针实时定量PCR检测方法,为HPy V7的流行病学调查及其初步研究提供了技术手段。     

尼罗罗非鱼ghrelin基因的多态性及其与生长性状相关SNP位点的筛选

为了研究尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)生长激素促分泌素基因(ghrelin)的多态性及其与生长的相关性, 研究以两个尼罗罗非鱼群体(快长群体和基础群体)的DNA样本各40份为模板, 通过PCR扩增和测序获得ghrelin基因序列。通过Dnasp v5和MEGA 5.0分析序列多态性、筛选有效SNP 位点; 采用Snapshot法对两个群体子代ghrelin基因中SNP位点进行基因分型, 然后分析SNP位点基因型与生长性状的相关性。结果表明, 快长群体ghrelin基因中的单核苷酸变异位点数(S)比基础群体要少, 而核苷酸多态性(Pi)和平均核苷酸差异数(K)要略高于基础群体。共筛得3个有效SNP 位点(S1、S2和S3), 均分布于第1个内含子中。遗传结构分析表明, 3个SNP 位点在两个群体的子代中均为低度多态性位点(PIC0.25), 但处于Hardy-Weinberg平衡(P0.05);快长群体子代中3个SNP 位点的观测杂合度、期望杂合度和多态信息含量等遗传多样性参数均小于基础群体子代的相应值, 3个SNP 位点的遗传多样性参数、基因型和基因频率在同一群体中高度一致, SNP 位点之间完全连锁。两个群体子代中3个SNP 位点处的优势基因型相同, 但快长群体子代中优势基因型频率要明显大于基础群体子代中相应基因型频率。对两个群体子代的生长性状与SNP基因型进行关联性分析的结果表明,尼罗罗非鱼个体的多项生长指标(体重、体长、体高、头长和尾柄高等)在不同基因型中存在显著差异(S1:GG AG, S2:TT AT, S3:AA AT)(P0.05)。D1双倍型(S1:GG, S2:TT, S3:AA)所对应的尼罗罗非鱼个体的多项生长指标(体重、体长、体高、头长和尾柄高等)显著高于D2双倍型(S1:AG, S2:AT, S3:AT)。以上结果表明, 尼罗罗非鱼ghrelin基因3个SNP 位点完全连锁, D1双倍型与快长性状密切相关, 可作为尼罗罗非鱼分子标记辅助育种的候选标记。     

RSV毛细支气管炎的肺表面活性蛋白D多态性与TaqMan MGB探针

目的探讨TaqMan MGB探针实时PCR技术检测肺表面活性蛋白D（surfactant protein,SP）-D基冈变异是否与呼吸道合胞病毒（respiratol Tsyneytial virus,RSV）毛细支气管炎易感性有关。方法运用Taq—ManMGB探针检测150例RSV毛细支气管炎和150例健康对照组SP—D基因多态性,并进行基因型、等位基因频率分析。各组的基因型、等位基因频率比较采用χ2检验。结果病例组SP—D Met11 Thr位点TT、CT、CC三种基因型频率分别为7．3％、44．0％、48．7％,T、C等位基因频率分别为29．3％、70．7％。三种基因型及等位基因频率与对照组比较差异有统计学意义（χ2=6．751、5．823,P〈0．05）。结论杭州地区汉族儿童存在SP—D基因多态性,SP—DMet11 Thr位点与RSV毛细支气管炎疾病易感性存在关联,C等位基因可能是RSV毛细支气管炎的易感基因。TaqMan MGB探针实时PCR技术是基因诊断良好技术平台。     

实时荧光PCR技术检测肉骨粉中牛羊源性成分的方法

建立了从肉骨粉中提取DNA的稳定、简便易操作的方法。根据牛、羊线粒体DNA基因片段设计特异性引物和Taq Man探针,建立了实时荧光PCR技术检测肉骨粉中牛、羊源性成分的快速、特异、敏感的方法。     

高分辨率熔解曲线法的非标记探针基因分型技术

PCR反应中利用荧光检测技术对已知位点进行基因分型时常采用荧光标记的寡核苷酸做探针。近年来新兴起的高分辨率熔解曲线技术可以采用非标记的探针对已知位点的SNP(single nucleotide polymorphism)或突变进行基因分型研究。采用非标记探针法对已知位点的基因分型研究具有廉价、快速、简便等特点,因此被大量应用在和疾病、形状等相关的一些多肽位点的研究中。本文较详细地介绍该技术的基本原理和实验中的注意事项。     

多巴胺D2受体基因多态性位点与海洛因依赖的关系

目的:探讨多巴胺D2受体(Dopamine D2 receptors,DRD2)基因3'非翻译区Taq ⅠA、启动子区-141 Ins/Del 2个多态性位点和海洛因依赖的相关性.方法:采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态(PCR-RFLP)技术检测320例海洛因依赖患者及300例健康对照组的TaqⅠA和-141 Ins/Del2个多态性位点的基因型.采用HaploView4.0及SPSS11.5软件分析这2个多态性位点的基因型、等位基因频率及组间差异.结果:DRD2基因Taq ⅠA位点的基因型及等位基因频率分布在海洛因依赖组与正常对照组存在显著性差异(p<0.01),海洛因依赖组TaqⅠA位点的等位基因A1频率显著高于正常对照组(x2=11.156,p=0.001,OR=1.463,95%CI=1.170～1.830);DRD2基因-141 Ins/Del位点的基因型及等位基因频率分布在海洛因依赖组与正常对照组之间无统计学差异(p<0.05).结论:DRD2基因TaqⅠA位点多态性可能与海洛因依赖有关,携带有TaqⅠA多态性位点A1等位基因的个体可能更容易对海洛因产生依赖.     

双链探针实时荧光PCR核酸检测新技术研究*

目的:采用一种“双链探针”实时荧光PCR技术,提高HBV核酸检测灵敏度,并在同一反应管中实现代谢酶CYP2C19^*2基因型检测。方法:采用双链探针与TaqMan探针同时检测不同浓度HBV血清样本,使用上海宏石SLAN 96实时荧光PCR仪进行核酸Ct值检测和结果统计分析;采用双链探针检测代谢酶CYP2C19^*2不同基因型样本,使用上海宏石SLAN 96实时荧光PCR仪进行核酸Ct值检测和基因型确定。结果:不同浓度HBV血清样本检测,双链探针荧光本底低,检测灵敏度更高,与TaqMan探针检测结果相比,两者核酸检测Ct值存在显著性差异(P<0.05);双链探针检测36份样本的代谢酶CYP2C19^*2基因型,检测结果与Sanger测序结果完全一致。结论:双链探针实时荧光PCR检测技术可完成目的基因的高灵敏核酸检测,也可实现基因型分析。     

血痕Chelex 100抽提DNA用于人类TNF-α基因启动子区SNP分型

建立快速、简便的血样本采集及DNA抽提方法,可用于大规模的分子流行病学调查及群体遗传学研究。采用无菌纱布为载体取血,Chelex100快速抽提DNA,用TaqMan MGB探针对人类TNF-α基因启动子区-857（C／T）位点进行SNP分型。344份血样均得到明确的分型结果,获得的荧光信号强,本底低。深圳地区汉族群体-857位点基因型频率分别为：cc为0.78,ct为0.21,tt为0.01。血痕Chelex100抽提DNA为大规模血样本的采集,DNA的抽提提供了有效的手段。     

实时荧光定量TaqMan-MGB探针法检测杆菌样巴尔通体

【目的】应用Taq Man探针实时荧光定量PCR技术建立特异性强、敏感性高和稳定性好的快速杆菌样巴尔通体检测方法。【方法】应用生物信息学方法查找杆菌样巴尔通体特有基因,从中筛选出一段特有的基因序列为模板设计探针和引物。通过比较Ct值和荧光强度确定扩增反应的最佳退火温度、探针和引物浓度;将扩增产物连接到p EASY-T载体上制备标准品,绘制标准曲线,分析扩增效率和线性关系;评估方法的特异性、敏感性及重复性。【结果】优化后退火温度为60°C,探针和引物浓度均为200 nmol/L,反应体系20μL。特异性实验显示只有杆菌样巴尔通体扩增出荧光信号,其他种属细菌均未见荧光信号;标准曲线线性关系良好(R2=1),扩增效率E=98.18%;最低检出限为每个PCR反应3个拷贝;组内和组间的变异系数CV值分别为0.21%–0.42%和0.29%–0.59%,在允许范围内。【结论】研究建立的实时荧光定量Taq Man-MGB探针法特异性强、灵敏度高、稳定性好,可快速检测鉴定杆菌样巴尔通体,为这种巴尔通体所引起的一系列疾病的早期快速诊断、监测和流行病学调查等研究提供有效手段。     

近交系小鼠双色荧光正相杂交芯片技术体系的建立和优化

目的探讨采用单核苷酸多态性（SNP）检测方法-双色荧光正相杂交芯片技术对近交系小鼠遗传质量监测及相关影响因素。方法运用基于芯片的双色荧光正相杂交检测SNP技术,进行芯片杂交动力学研究,考察信号值（Cy3,Cy5）和ratio值（Cy5/Cy3）与PCR产物点样浓度、PCR产物长度和荧光标记探针长度之间的关系,研究PCR产物点样浓度、PCR产物长度和荧光标记探针长度对SNP分型的影响。结果采用正反标记实验后,Ratio值随着PCR产物点样浓度的增加呈稳定趋势;PCR双链产物长度对信号值影响比较大,点样时其长度不宜太长,最好不超过450 bp;随荧光标记探针长度的增加,基因分型能力明显下降,长度为15 bp最佳,长度超过20 bp时,已基本没有区分能力。结论PCR产物点样浓度、PCR产物长度和荧光标记探针长度是双色荧光正相杂交SNP分型系统的重要影响因素,采取适当的PCR产物点样浓度、PCR产物长度和荧光标记探针长度,并采用正反标记实验,可以取得稳定、准确的基因分型效果。为进一步进行近交系小鼠遗传质量监测的研究奠定基础。     

寡核苷酸芯片法、实时PCR 和测序法进行乙肝病毒 基因分型的比较

目的:比较寡核苷酸芯片法、实时荧光PCR和测序法在对慢性乙肝患者病毒基因分型的比较和方法学评价。方法:对126例不同基因型的慢性乙肝患者的血清样本分别用寡核苷酸芯片法、实时荧光PCR法和测序法进行基因分型,并评价各种方法的临床表现、所需时间和检测成本。结果:寡核苷酸芯片法、实时荧光PCR分别能检测到1%和0.1%比例的基因型。在126例慢性乙肝患者的临床样本中,寡核苷酸芯片法、实时荧光PCR和测序法分别检测出41(33%)、41(33%)和45(36%)例为B型,76(60%)、76(60%)、81(64%)例为C型。寡核苷酸芯片法、实时荧光PCR均检出9例B、C混合基因型。在三种检测方法中实时荧光PCR是最快速和廉价的。结论:寡核苷酸芯片法、实时荧光PCR能检出B、C混合基因型,而测序法只能检测出样本的主导基因型。     

2种检测人偏肺病毒感染的荧光定量PCR方法的应用比较

目的:比较基于人偏肺病毒(hMPV)N或L基因的2种检测hMPV感染的荧光定量PCR方法在207例临床呼吸道样本检测中的应用效果。方法:建立基于hMPV N或L基因片段的荧光定量PCR方法,检测2008年5月至2009年3月在北京儿童医院因急性呼吸道感染的住院患儿鼻咽拭子207份,比较2种方法检出率的敏感性和特异性。结果:在207份样本中,2种方法共检出38(18.36%)份阳性样本,基于N或L基因一种方法均检出32(15.46%)份阳性样本,总检出符合率为94.2%(195/207)。另外发现,基于L基因检测为阴性而基于N基因检测为阳性的样本在L基因与引物和探针结合的部分序列有核苷酸的突变。对19例阳性样本的F基因进行进化树分析发现,大多数hMPV属于A2和B2型,只有1例属于B1型。结论:2种荧光定量PCR方法的联合应用,对于临床样本中hMPV的检测更为敏感。     

Smad3基因剔除小鼠的繁殖与基因型鉴定

目的为进一步深入研究Smad3基因在脊椎动物发育中的重要作用,对Smad3基因剔除小鼠进行保种和繁育研究.方法采用基因剔除杂合子小鼠进行保种,通过PCR和Southern杂交对杂合子小鼠交配所产生的后代进行基因型鉴定,纯合子小鼠和野生型小鼠用于表型分析,杂合子小鼠用于留种和繁殖生产.结果采用PCR方法对278只子代小鼠进行了基因型鉴定,83只为野生型,133只为杂合子,62只为纯合子.结论Smad3基因剔除突变能稳定遗传.采用杂合子小鼠保种,子代小鼠三种基因型比例符合孟德尔遗传定律.     

DDR2基因缺失小鼠的繁育及子代基因型的鉴定

目的：探讨盘状结构域受体2（DDR2）基因缺失小鼠的优化繁殖方法与子代小鼠DDR2基因型的鉴定方法,建立DDR2基因缺失小鼠模型,为进一步研究DDR2分子在肿瘤、肺纤维化、类风湿性关节炎等复杂疾病中的功能以及作用机制奠定基础。方法：将从美国JAX实验室引进的三对杂合子小鼠进行饲养并交配繁殖,繁殖成功后其子代中将会出现野生型、杂合子以及纯合子3种基因型。用基因组提取试剂盒试剂盒提取子鼠鼠尾的基因组DNA,经紫外分光光度计定量后,采用Taqman qPCR的方法准确鉴定出小鼠的基因型,同时观察子代小鼠各基因型的比例,并通过小鼠体态观察,进一步证实Taqman qPCR鉴定方法的可靠性。结果：DDR2基因杂合子小鼠互交繁殖可得到DDR2野生型小鼠、DDR2纯合子小鼠以及DDR2杂合子小鼠三种基因型小鼠,所得子代基本符合孟德尔遗传规律,且雌性和雄性DDR2纯合子小鼠体长均较DDR2野生型小鼠和DDR2杂合子小鼠小,鼻子也较其它基因型小鼠明显变短,无繁殖能力。依据Taqman qPCR的结果所得出的纯合子小鼠体貌特征与文献报道一致,证实了Taqman qPCR结果的可靠性。结论：雌、雄性DDR2杂合子小鼠交配可有效获得DDR2基因缺失小鼠;实验所用Taqman qPCR方法能够准确鉴定子代小鼠的基因型,DDR2纯合子小鼠的获得为后续实验的提供了较理想的动物模型。     

以主要流行EV71 VP1基因高度保守区为靶点的TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

在我国,肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)C4型是引起手足口病的主要流行基因型。为建立EV71C4型TaqMan荧光定量PCR检测方法,在C4型EV71VP1基因的高保守区,设计合成引物和TaqMan探针,将包含此目的区段的基因片段克隆到pcDNA3.1载体中,通过体外转录获得标准品,并以梯度稀释的标准品为模板建立工作曲线,进而在优化反应条件的基础上建立TaqMan荧光实时定量PCR检测方法。实验中,所设计引物、探针的高度保守性保证了C4型EV71的高效扩增。经反应条件优化,引物和探针的最佳工作浓度分别为300 nmol/L和200 nmol/L,在1×10~301×10~3拷贝数检测范围内具有良好的线性关系(R~2=1),灵敏度可达到10~2 copies/μL。通过对该方法进行检验发现,批间和组间重复实验的变异系数均小于0.5%,且该方法对柯萨奇A16(coxsackievirus A16,CA16)柯萨奇B1(coxsackievirus B1,CB1)人轮状病毒(human rotavirus,HRV)单纯疱疹病毒2型(herpes Simplex virus type 2,HSV-2)均无交叉反应,对6份EV71阳性样本检出率为100%。以上数据表明,文中建立的TaqMan荧光定量PCR方法可为我国主要流行C4型EV71感染的快速诊断及疾病监控提供有效途径。     

成骨细胞特异性表达Cre重组酶转基因小鼠的建立

构建了含有骨钙素基因启动子、Cre重组酶基因和人生长激素基因polyA的转基因载体pOC-Cre, 以显微注射的方法将4.6 kb的转基因片段OC-Cre导入小鼠受精卵。16只子代小鼠中经PCR和Southern杂交鉴定, 有2只小鼠携带外源基因, 整合率为12.5%。为了检测OC-Cre在转基因小鼠中表达的组织特异性, 将转基因首建者小鼠与基因组上携带有LoxP位点的条件性Smad4基因敲除小鼠交配, PCR结果显示, 仅在子代纯合型小鼠骨组织基因组中扩增出了Cre介导重组后的片段。将OC-Cre转基因小鼠与ROSA26报告小鼠交配, 利用LacZ染色对双转基因阳性子代小鼠进行检测, 结果显示Cre重组酶在成骨细胞中特异性表达并介导ROSA基因座LoxP位点间的重组。所有这些结果说明：所建立的OC-Cre转基因小鼠在成骨细胞中特异性表达Cre重组酶, 并能在体内介导成骨细胞基因组上LoxP位点间的重组, 是一种理想的研制成骨细胞特异性基因敲除小鼠的工具小鼠。     

实时荧光定量PCR快速鉴别新型冠状病毒主要变异株北大核心CSCD

为建立一种快速鉴别严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)的5种主要变异株的Taq Man探针实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR, RT-qPCR)体系,基于SARS-CoV-2野生型及变异株alpha (N501Y、HV69-70del)、beta (E484K、K417N)、gamma (K417T、V1176F)、delta (L452R、T478K)和omicron (H655Y、N679K、P681H)序列设计特异性引物、探针,建立和优化一种鉴别新型冠状病毒(SARS-CoV-2) 5种主要变异株的Taq Man探针RT-qPCR方法,并进行该方法的特异性、敏感性、鉴别能力评价。该方法可准确区分出SARS-CoV-2野生型和突变型,与其他呼吸道病原体(n=21)无交叉,显示高特异性。该方法最低检测限为2×10;拷贝/mL,操作简单、快速、成本廉价,可用于监测SARS-CoV-2毒株的变异,精准指导疫情识别与防控。     

广西巴马小型猪MCP-1、MMP-9基因启动子区SNP位点与动脉粥样硬化相关血清指标的关联分析

本研究目的是分析广西巴马小型猪MCP-1和MMP-9基因启动子区SNP位点与血清指标的关联性,筛选可能与动脉粥样硬化相关的高风险分子标记,为后续培育广西巴马小型猪动脉粥样硬化疾病模型易感家系打下基础。采用PCR-RFLP对90头正常饲喂的广西巴马小型猪的MCP-1和MMP-9基因启动子区SNP位点进行分型,统计该位点的基因型频率和等位基因频率,比较分析基因型频率与动脉粥样硬化相关血清指标的关联性。结果显示,广西巴马小型猪MMP-9基因-1267位点、-1287位点和MCP-1基因-1782位点均存在3种基因型:AA型、AG型和GG型。MCP-1基因-1782位点和MMP-9基因-1267位点以GG型为优势基因型,MMP-9基因-1287位点以AG型为优势基因型。MMP-9基因两个突变位点的各基因型个体的血清指标及其分析值之间差异均不显著。MCP-1基因-1782位点AG型个体血清LDL平均值和LDL/HDL比值均显著高于GG型个体(p0.05),AG型个体HDL和TC浓度均值、AI值稍高于GG型个体,但差异均不显著。MCP-1基因AG型个体患动脉粥样硬化疾病的风险高,可作为培育建模易感家系的分子标记。     

广西壮族人群EBI3 基因rs6613A/T, rs4905A/G多态性分布特点

目的:分析广西壮族人群EBI3基因rs6613A/T、rs4905A/G多态性分布特点。方法:采用单碱基延伸的PCR技术对168例广西壮族人群EBI3 rs6613 A/T和EBI3 rs4905A/G进行多态性检测,对比国际人类基因组计划(Hap Map)公布的中国北京人、日本人、非洲人和意大利人的SNP分型数据,分析5个人群rs6613 A/T、rs4905A/G位点的基因型和等位基因频率差异。结果:在广西壮族人群中,EBI3基因rs6613 A/T位点AT基因型最常见,约为49.4%;T等位基因频率最高,约为52.1%;rs4905A/G多态性位点AC基因型最常见,约为48.2%;C等位基因频率最高,约为50.9%。EBI3基因型及等位基因频率分布于性别无显著相关性(P0.05)。广西壮族人群EBI3基因rs6613A/T位点基因型和等位基因频率与北京人差异无统计学意义(P0.05),但与非洲人、日本人、意大利人差异具有统计学意义(P0.05);EB-13基因rs4905A/G位点基因型和等位基因频率与北京人和日本人差异无统计学意义(P0.05),但与非洲人和意大利人比较差异具有统计学意义(P0.01)。结论:EBI3基因rs6613 A/T和EB-13 rs4905A/G多态性位点基因型和等位基因在广西壮族人群中的分布频率与其他种族和地区人群相比存在差异,这种差异可能是导致某些疾病在不同人群发病率和临床表现存在差异的原因之一。