苜蓿体内H2S信号与Ca2+调节气孔运动的作用机制

为探究H₂S信号在苜蓿（Medicago sativa）体内调节气孔运动的作用,及在此过程中H₂S与Ca²⁺的关系,以蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）的野生型和钙离子转运体突变体为试验材料,分别从转录水平、细胞水平和生理水平开展研究。采用qRT-PCR比较相关基因的表达量变化、荧光探针显示体内Ca²⁺含量、电极法测定H₂S含量、光学显微镜观察和测量气孔孔径等。结果表明：蒺藜苜蓿突变体NF3011和NF2734体内H₂S的含量与野生型相比极显著降低（P<0.01）;H₂S信号在一定程度上抑制钙离子转运体编码基因MTR_6g027580的表达;外源生理浓度H₂S熏蒸可诱导蒺藜苜蓿气孔关闭,与Ca²⁺通道阻断剂LaCl₃联合处理对野生型气孔运动未产生影响,而在突变体中的结果截然相反;利用荧光探针测定保卫细胞内的Ca²⁺含量,所得结果与气孔孔径的变化规律完全一致。综上所述,H₂S信号促进叶片保卫细胞内Ca²⁺的含量增加,最终表现为植物气孔孔径变小,在此过程中胞内Ca²⁺含量变化主要通过Ca²⁺转运体进行,少部分依赖Ca²⁺离子通道。该研究结果不仅在理论上丰富了H₂S信号的作用机制,更具应用于苜蓿生产实践并推广于其他作物的潜力。     

胞质Ca2+参与外源H2S促进盐碱胁迫下裸燕麦种子萌发

硫化氢（Hydrogen sulfide,H₂S）是植物新型气体信号分子,钙离子（Calcium,Ca²⁺）为重要的第二信使,两者在植物逆境响应中分别发挥着重要作用。为明确胞质Ca²⁺在外源H₂S促进盐碱胁迫下作物种子萌发中的作用,以裸燕麦（Avena nude）为材料,采用培养皿培养,以混合盐碱（NaCl、Na₂SO₄、Na₂CO₃、NaHCO₃的摩尔比为12：8：1：9）模拟甘肃裸燕麦种植地盐碱环境,蒸馏水为对照,测定了胞外Ca²⁺螯合剂乙二醇-双-（2-氨基乙醚）四乙酸（EGTA）、质膜Ca²⁺通道阻断剂氯化镧（LaCl₃）、液泡Ca²⁺释放抑制剂钌红（RR）和内质网钙泵阻断剂毒胡萝卜素（Thaps）分别与H₂S供体硫氢化钠（NaHS）共处理下种子的发芽势、发芽率、发芽指数、活力指数、平均发芽速率、胚根长和胚芽长7个发芽指标,利用隶属函数分析方法综合评价胞质Ca²⁺对H₂S缓解盐碱胁迫抑制种子萌发的影响。结果表明,随着盐碱胁迫浓度增大,裸燕麦种子的发芽势、发芽率、发芽指数、活力指数、平均发芽速率、胚根长和胚芽长显著下降。与对照相比,15~75 mmol·L^-1盐碱胁迫导致裸燕麦种子萌发的隶属函数综合评价值（D）显著降低,30 mmol·L^-1盐碱胁迫下D值下降了73.1%;100~1 000 μmol·L^-1 NaHS不同程度提高了裸燕麦种子萌发的D值,且100 μmol·L^-1 NaHS缓解30 mmol·L^-1盐碱胁迫下D值下降的作用最大;EGTA、LaCl₃和RR均显著逆转了100 μmol·L^-1 NaHS对30 mmol·L^-1盐碱胁迫下D值下降的缓解作用,而Thaps对NaHS的作用无显著影响。表明胞质Ca²⁺参与外源H₂S促进盐碱胁迫下裸燕麦种子萌发的信号传导过程,且胞质Ca²⁺主要来源于胞外Ca²⁺的内流和液泡中Ca²⁺的释放。     

外源性H2S对糖尿病小鼠肝纤维化的作用及其机制*

目的: 探讨外源性硫化氢(H₂S)对糖尿病小鼠肝纤维化作用及其相关机制。方法: 将 C57 雄性体重为(22±2)g 24只小鼠随机分为3组(n=8):①正常对照组(Control):小鼠腹腔注射生理盐水,注射时间同实验组;②糖尿病模型组(HG):按体重(150 mg/kg)一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ)诱导小鼠建立糖尿病模型;③NaHS 处理组(HG + NaHS):方法同组别②,只是糖尿病模型建立后,腹腔注射NaHS(100 μmol/L·kg·d),每天一次,连续12周。HE染色检测肝细胞损伤;Masson染色检测肝纤维化;Western blot检测相关蛋白胱硫醚-β-合成酶(CBS,内源性H₂S产生的关键酶)、胶原I (Col-I)、胶原III (Col-III)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达。结果: 与对照组比较,糖尿病模型组肝细胞损伤及肝纤维化均显著加重,CBS 蛋白表达显著减少(P＜0.01),Col-I、Col-III和MMP-9蛋白表达均显著增加(P＜0.01)。与糖尿病模型组比较,NaHS处理组肝细胞损伤及肝纤维化均显著减轻、CBS 蛋白表达显著增加、Col-I、Col-III和MMP-9蛋白表达均减少(P＜0.01)。结论: 外源性H₂S可抑制糖尿病小鼠肝纤维化,其机制与降低胶原含量和基质金属蛋白酶-9的表达相关。     

硫化氢对1型糖尿病大鼠肾脏的保护作用

目的：观察硫化氢（H₂S）对1型糖尿病大鼠肾脏的保护作用及其机制。方法：32只雄性SD大鼠随机分为4组：正常对照（NC）组、糖尿病（DM）组、糖尿病治疗（NaHS+DM）组和NaHS对照（NaHS）组（n=8）。DM组和NaHS+DM组大鼠采用链脲佐菌素（STZ）55 mg/kg腹腔注射诱导1型糖尿病模型。造模成功后,NaHS+DM组和NaHS组采用腹腔注射NaHS溶液56 μmol/kg干预治疗。8周后,测定大鼠24 h尿蛋白含量、肾重指数、空腹血糖、尿素氮、肌酐等指标;HE染色观察肾脏组织形态学变化;测定肾脏组织脂质过氧化物丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）和Caspase-3的活性;Western blot检测肾脏组织Bcl-2和Bax蛋白表达。结果：与NC组相比,NaHS组各项指标均无显著差异,DM组,24 h尿蛋白含量、肾重指数、空腹血糖、尿素氮和肌酐水平均明显升高;HE染色结果显示肾小球基底膜增厚、系膜基质增多;MDA含量、Caspase-3活性和Bax蛋白表达明显增高;SOD活性和Bcl-2蛋白表达显著降低。与DM组相比,NaHS+DM组肾功能损伤明显减轻,肾脏组织形态学变化明显改善,MDA含量、Caspase-3活性和Bax蛋白表达明显下降,SOD活性和Bcl-2蛋白表达显著增高。结论：H₂S对1型糖尿病大鼠肾脏具有保护作用,其机制可能与抑制氧化应激和细胞凋亡有关。     

运动干预下CSE/H2S调控TLR4/NF-κB信号通路对酒精性肝损伤的改善作用

胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine γ-lyase, CSE)是合成内源性H₂S的核心酶之一。CSE/H₂S体系可介导多种信号转导途径减轻机体炎性损伤。而有氧运动已被证实对机体免疫功能具促进作用,但是否通过CSE/H₂S体系介导炎性通路发挥效应,其机制有待深入研究。本研究旨在探讨有氧运动通过CSE/H₂S体系抑制TLR4/NF-κB信号通路对酒精性肝损伤的改善作用。选取3周龄健康雄性昆明(KM)种小鼠50只,随机分成酒精性脂肪肝病组(AFLD)[模型组(M)、有氧运动组(E)、有氧运动+NaHS组(EN)、有氧运动+PAG组(EP)]、空白组(K),每组10只。干预7周,解剖学观察发现,M组小鼠脂肪系数、脏器系数均高于K组(P<0.01)。ELISA酶联免疫结果显示,相比K组,M组谷草转氨酶、谷丙转氨酶水平增高,CSE活性下降,丙二醛含量上升,蛋白质羰基化程度上升及谷胱甘肽含量下降(P<0.01, P<0.05)。去蛋白质法检测发现,外周血H₂S含量升高(P<0.01)。HE染色显示,M组肝组织结构紊乱,呈现大量脂滴空泡样变,且胞核畸形位变。给予有氧运动干预及腹腔注射NaHS,可显著减轻肝质变及肝功能症状,提升血清H₂S含量和CSE活性(P<0.01)。而腹腔注射PAG可加剧酒精性肝损伤。免疫组织化学染色显示,相比M组,E、EN组TLR4、NF-κB、IL-1β阳性表达面积下降(P<0.01)。实时荧光定量PCR显示,相比M组,E组、EN组CSE、TLR4、NF-κB、IL-1β mRNA表达显著下降(P<0.01),EP组无显著差异(P>0.05)。Illumina高通量测序筛选肝组织炎症相关因子及关联分析显示,差异表达因子主要富集在NF-κB、TGF-β、TNF、TOLL样受体等信号通路,涉及肝组织细胞信号转导、凋亡抑制和免疫反应等,有氧运动及NaHS可降低炎症和免疫相关信号通路的富集。以上研究结果表明,有氧运动可促进小鼠肝组织中CSE/H₂S气体信号体系的表达,从而抑制TLR4/NF-κB通路促炎过程,拮抗小鼠酒精性肝损伤,且有氧运动结合外源性H₂S供体对TLR4/NF-κB的干预效果更佳。     

饱和氢气生理盐水对盲肠结扎穿孔大鼠肺损伤的干预作用*

目的: 观察饱和氢气生理盐水对盲肠结扎穿孔(CLP)大鼠肺组织的作用。方法: 将24只健康雄性SD大鼠(体重250~300 g)随机分成4组(每组6只):①假手术对照组(Sham组)+生理盐水组:盲肠根部穿过丝线,不行结扎和穿孔,手术前10 min腹腔注射生理盐水(10 mg/kg);②CLP组+生理盐水组:结扎盲肠根部并用18号针头穿刺2个孔,2个孔相距约1cm,手术前10 min腹腔注射生理盐水(10 mg/kg);③Sham+H₂组:手术前10 min腹腔注射饱和氢气生理盐水(10 mg/kg); ④CLP+ H₂组:手术前腹腔注射饱和氢气生理盐水(10 mg/kg)。各组于手术后8 h进行观察:采用生物化学和RT-PCR的方法分别检测大鼠肺组织中CSE/H₂S体系的变化。采用H₂S供体硫氢化钠(NaHS)诱导的肺组织损伤动物模型,另取32只健康雄性SD大鼠(体重250~300 g),随机分为4组(每组8只):①生理盐水组:腹腔注射生理盐水(10 mg/kg);②H₂S组:腹腔注射H₂S供体NaHS(56 μmol/kg);③H₂S+H₂组:腹腔注射NaHS前10 min注射饱和氢气生理盐水(10 mg/kg);④H₂组:腹腔注射生理盐水前10 min注射饱和氢气生理盐水(10 mg/kg)。于给药后8 h测定肺系数,检测肺组织中MDA含量、MPO活性及细胞因子TNF-α、IL-6和IL-10含量,观察肺组织形态学变化。结果: 饱和氢气生理盐水可抑制CLP大鼠肺组织中CSE/H₂S体系:减少CLP大鼠肺组织中H₂S的生成,抑制H₂S的合成酶CSE的活性及mRNA表达 (P均＜0.05);外源性给予H₂S(NaHS)可造成肺组织损伤,饱和氢气生理盐水可明显减轻H₂S所致的肺组织损伤:大鼠肺系数明显减小(P＜ 0.05),MDA含量下降(P＜0.05);肺组织MPO活性下降(P＜0.05);大鼠肺间质和肺泡中PMN的浸润程度明显减轻,肺组织形态及IQA接近正常(P＜0.05)。结论: 饱和氢气生理盐水可通过抑制CLP大鼠肺组织中CSE/H₂S体系,发挥其改善CLP大鼠肺组织损伤的作用。     

不同时期喷施NaHS对盐碱胁迫下裸燕麦H2S产生和活性氧代谢的影响

为了解气体信号硫化氢（H₂S）对盐碱胁迫下裸燕麦（Avena nuda）活性氧（ROS）代谢的调节效应,筛选和确定H₂S最佳的施用时期和适宜浓度。采用盆栽土培试验,研究了在裸燕麦不同时期（幼苗期、拔节期、抽穗期、开花期和灌浆期）喷施0、25、50、100、200、400 μmol·L^-1 H₂S供体硫氢化钠（NaHS）对3.0 g·kg^-1盐碱混合 （NaCl∶Na₂SO₄∶NaHCO₃∶Na₂CO₃摩尔比为12∶8∶9∶1）胁迫下裸燕麦叶片H₂S含量、H₂S生成关键酶L-半胱氨酸脱巯基酶（LCD）活性和ROS代谢相关物质含量和酶活性的影响。结果表明：喷施时期和NaHS浓度及其交互作用对盐碱胁迫下裸燕麦叶片中H₂S、超氧阴离子（）、过氧化氢（H₂O₂）、丙二醛（MDA）、抗坏血酸（AsA）和谷胱甘肽（GSH）含量及LCD、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）和谷胱甘肽还原酶（GR）活性存在显著影响。与喷施0 μmol?L^-1 NaHS相比,喷施一定浓度NaHS能够提高H₂S、AsA、GSH含量和LCD、SOD、CAT、POD、APX和GR活性,减少、H₂O₂和MDA积累,但以上各指标最佳的喷施时期和NaHS浓度存在差异。隶属函数综合分析显示,在幼苗期和拔节期喷施25~200 μmol?L^-1 NaHS的综合评价值（D）最高,表明在幼苗—拔节期喷施25~200 μmol?L^-1 NaHS能更好提高ROS清除能力,从而缓解盐碱胁迫诱导ROS对裸燕麦的氧化伤害。     

NaHS对ATP诱导大鼠小胶质细胞P2X受体表达的影响

目的：观察硫化氢（H₂S）供体硫氢化钠（NaHS）对ATP致伤的大鼠小胶质细胞细胞活力、细胞膜通透性及P2X7受体表达的影响。方法：实验取对数期形态结构及生长分化良好的大鼠小胶质细胞,随机分4组,每组设3个复孔。①正常对照组：常规培养,不进行ATP处理。②ATP组：接种细胞24 h后ATP处理。③NaHS+ATP组：NaHS预先孵育30 min后再用ATP处理,并且NaHS始终存在于反应体系中。④KN-62（P2X₇受体阻断剂）+ATP组：KN-62预先孵育30 min,其余同NaHS+ATP组。MTT检测各组细胞活力,荧光染料YO-PRO-1检测各组相对荧光单位（RFU）反映膜的通透性,Western blot检测各组P2X₇受体表达水平。结果：①与对照组相比,不同浓度的ATP （1、3、5、10 mmol/L）作用3 h均可明显降低大鼠小胶质细胞活力,NaHS （200 μmol/L）干预后大鼠小胶质细胞活力较ATP组明显增加（P<0.01）,但NaHS达400 μmol/L浓度时,其保护作用未进一步增加。②随着ATP浓度的增加,大鼠小胶质细胞内YO-PRO-1的荧光强度显著增加,NaHS预处理可明显减少细胞对YO-PRO-1的摄取（P<0.01）。③ATP （3 mmol/L）能上调P2X₇受体蛋白表达水平,而NaHS （200 μmol/L）预孵育则可明显抑制ATP引起的P2X₇受体蛋白表达的上调（P<0.01）。结论：NaHS可减少ATP致伤的大鼠小胶质细胞的P2X₇受体表达、降低通透性、增加细胞活力,提示调控P2X₇受体的表达和功能可能是H₂S神经保护作用的重要环节。     

贝母提取物对异丙肾上腺素诱导心肌H9c2细胞肥大的干预作用

目的: 研究贝母提取物(FE)对异丙肾上腺素(Iso)诱导H9c2 心肌细胞肥大(CH)的干预作用。方法: 采用体外培养心肌H9c2 细胞,MTT法测定心肌H9c2细胞存活率; 细胞分4组(n=10):对照组、2 μmol/L Iso (模型)组、2 μmol/L Iso+FE 400 μg/L 组、2 μmol/LIso+FE 1 000 μg/L 组;相差显微镜观察细胞形态及测定心肌细胞直径;二辛可酸法检测细胞总蛋白;钙-4 试剂检测细胞内钙离子浓度。结果: Iso 组心肌H9c2细胞直径、总蛋白量及[Ca²⁺]i均显著高于对照组(P＜0.01);400 μg/ml 和1 000 μg/ml FE各组心肌H9c2细胞直径、总蛋白量及细胞[Ca²⁺]i均显著低于Iso组 (P＜0.05 或P＜0.01)。结论: FE对Iso诱导H9c2 CH有干预作用,可能与抑制钙信号通路激活有关。     

硫氢化钠对脊髓小脑共济失调3型小鼠海马MBP及学习记忆的影响

目的: 探讨硫氢化钠(NaHS)对脊髓小脑共济失调3型(SCA3)小鼠海马神经元髓鞘碱性蛋白(MBP)及学习记忆的影响及其治疗意义。方法: 随机挑选12只雄性正常野生型小鼠(WT)作为正常对照组(NC Group),然后将48只SCA3小鼠随机分为SCA3模型组(M Group)、低剂量小鼠组(NL Group,10 μmol/kg)、中剂量小鼠组(NM Group,50 μmol/kg)和高剂量小鼠组(NH Group,100 μmol/kg),每组12只,用药组每日腹腔注射一次,连续4周。通过Morris水迷宫比较不同剂量NaHS干预前后SCA3小鼠学习记忆能力的变化,分光光度法测定海马内硫化氢(H₂S)含量,免疫组化技术检测髓鞘碱性蛋白(MBP)的表达差异,并借助电镜观察各组小鼠神经元髓鞘形态学变化。 结果:与对照组小鼠比较,SCA3小鼠的学习记忆能力显著下降(P＜0.05),海马内H₂S含量降低(P＜0.05),有髓神经纤维MBP表达量也降低(P＜0.05),经过不同剂量的外源性NaHS治疗后,学习记忆能力有不同程度改善(P＜0.05);且SCA3小鼠海马H₂S和MBP含量也有不同程度提高(P＜0.05)。结论: 外源性NaHS可能通过提高SCA3小鼠大脑海马的H₂S含量和MBP含量增加,对神经元细胞产生一定的保护作用,进而提高SCA3小鼠的学习记忆能力,为寻求SCA3的治疗提供新的思路,同时为临床SCA3患者的营养支持及治疗提供方向。     

Calcium sensing receptor regulates cardiomyocyte function through nuclear calcium

Nuclear Ca2+ plays a pivotal role in the regulation of gene expression. IP3 (inositol-1,4,5-trisphosphate) is an important regulator of nuclear Ca2+. We hypothesized that the CaR (calcium sensing receptor) stimulates nuclear Ca2+ release through IICR (IP3-induced calcium release) from perinuclear stores. Spontaneous Ca2+ oscillations and the spark frequency of nuclear Ca2+ were measured simultaneously in NRVMs (neonatal rat ventricular myocytes) using confocal imaging. CaR-induced nuclear Ca2+ release through IICR was abolished by inhibition of CaR and IP3Rs (IP3 receptors). However, no effect on the inhibition of RyRs (ryanodine receptors) was detected. The results suggest that CaR specifically modulates nuclear Ca2+ signalling through the IP3R pathway. Interestingly, nuclear Ca2+ was released from perinuclear stores by CaR activator-induced cardiomyocyte hypertrophy through the Ca2+-dependent phosphatase CaN (calcineurin)/NFAT (nuclear factor of activated T-cells) pathway. We have also demonstrated that the activation of the CaR increased the NRVM protein content, enlarged cell size and stimulated CaN expression and NFAT nuclear translocation in NRVMs. Thus, CaR enhances the nuclear Ca2+ transient in NRVMs by increasing fractional Ca2+ release from perinuclear stores, which is involved in cardiac hypertrophy through the CaN/NFAT pathway.     

硫化氢通过抑制镉离子内流降低拟南芥体内的镉毒性

硫化氢（H₂S）作为一种新兴的气体信号分子,在植物体内主要由半胱氨酸脱巯基酶（CDes）降解半胱氨酸产生。已有报道表明,H₂S信号与植物激素共同作用增强植物的镉（Cd）耐受。然而,H₂S信号响应重金属Cd胁迫的作用机制尚缺乏系统研究。本文以拟南芥为实验材料,从不同水平探究H₂S分子对Cd胁迫诱导氧化应激的保护作用。结果表明,CDes基因表达量和H₂S的产率随CdCl₂浓度升高而逐渐增加。重金属Cd胁迫导致幼苗干重降低约33%、体内过氧化氢显著增加、丙二醛含量升高约110%、超氧化物歧化酶活性增加约100%、谷胱甘肽还原酶活性和过氧化氢酶活性分别下降27%和21%,还原性谷胱甘肽含量随之显著降低。生理浓度NaHS（H₂S供体）预处理显著缓解以上Cd胁迫产生的影响,使恢复到对照水平。同时,H₂S处理可显著下调质膜中Cd转运蛋白（HMA4和IRT1）的表达,同时上调液泡膜中MRP3和CAX2的表达。利用非损伤微测技术测定植物根系Cd²⁺的流动速度和流动方向。结果显示,生理浓度的H2S显著抑制Cd^{2 +}内流,最终表现为植物叶片和根中的Cd含量显著降低,分别下降了15%和38.4%。总之,在Cd胁迫条件下,H₂S信号可激活植物体内的抗氧化酶促和非酶促系统,以清除细胞内H₂O₂。H₂S对Cd²⁺转运和液泡区式化的调节,降低了体内Cd²⁺的浓度,减小Cd毒性对植物生长的影响。为理解农作物应对重金属胁迫的机制提供了新的思路。     

干旱胁迫下拟南芥中H_2S与ABA信号关系研究

以野生型拟南芥(WT)、硫化氢(H_2S)合成酶缺失型突变体lcd、脱落酸(ABA)合成缺失型突变体aba1实生苗为材料,以0.3 mol·L^-1甘露醇模拟干旱胁迫,研究干旱胁迫对ABA含量、H_2S含量的影响,及其在拟南芥抵抗干旱胁迫中的作用及信号关系。结果显示:干旱胁迫显著提高LCD和ABA1基因相对表达以及H_2S含量,ABA含量;干旱胁迫显著抑制突变体lcd、aba1的种子萌发;干旱胁迫下,外施NaHS促进干旱胁迫下WT、lcd和aba1中內源H_2S的产生及上调LCD、ABA1基因相对表达,而外施ABA提高干旱胁迫下WT、aba1中H_2S含量及LCD、ABA1基因相对表达,但是对lcd中H_2S含量及LCD基因相对表达没有显著影响。研究结果表明,信号分子H_2S和ABA在拟南芥的干旱胁迫响应中发挥一定的作用,且H_2S位于ABA的下游参与调控拟南芥的信号过程。