OsMADS34与OsMADS56蛋白互作及OsMADS56表达模式分析

MADS-box蛋白可以通过形成多聚体复合物发挥功能。Os MADS34作为一个多样功能的SEPALLATA(SEP)基因,其可以控制水稻花序及小穗的发育。为了了解Os MADS34在控制水稻花序及花发育的机理,我们利用水稻Os MADS34作诱饵蛋白,从构建的水稻枝梗分生组织的c DNA文库中筛选可以互作的未知蛋白。利用酵母双杂交分析,筛选到了互作蛋白Os MADS56,并通过自激活验证及蛋白定位分析降低了假阳性及假阴性的因素影响。利用定量PCR对Os MADS56的表达模式进行分析,Os MADS56在水稻花序和小穗发育时期表达,Os MADS56可能是在蛋白水平上与Os MADS34相互作用共同调控水稻花序的发育。本工作为今后进一步研究Os MADS34及开花基因如何调控水稻花序和花发育提供了见解。     

蟾蜍胰腺内分泌细胞的形态学和体视学研究

本实验应用免疫组织化学PAP法和免疫金银法-PAP法免疫双重标记以及常规电镜,对蟾蜍胰岛A、B、D细胞的形态结构及分布进行了观察;并利用A蛋白胶体金(PAG)免疫电镜技术,对胰岛素进行细胞内精确的定位。同时,根据体视学有关立体重建的原理,从A、B细胞不同大小的切面的频数分布,重建了其球体大小的频数分布。     

水稻Os着-c op 1基因的原核表达及多克隆抗体制备

着-COP蛋白是真核生物分泌途径中COP玉有被小泡的一个亚基。本研究利用PCR技术扩增水稻着-c op基因(Os着-c op 1)的ORF(开放阅读框),并克隆到原核表达载体pET-23d上,将表达载体pET-Os着-cop1转入大肠杆菌BL21(DE3),以1.0 mmol/L的IPTG (isopropylβ-D-thiogalactoside)诱导表达重组蛋白,然后以重组蛋白作为抗原免疫家兔,制备多克隆抗体。SDS-PAGE电泳分析结果表明,成功诱导表达了分子量约为35 kD的重组蛋白,Western blot检测表明,免疫家兔的抗血清与水稻幼穗总蛋白杂交信号较好。Os着-COP1抗体的制备有助于研究该基因及COPI小泡在水稻中的功能。     

赤桉ACT1和ACT2基因的克隆与生物信息学分析

为了解赤桉(Eucalyptus camaldulensis)肌动蛋白(Actin)在生长发育过程中的功能,根据赤桉幼苗转录组数据库中的肌动蛋白基因序列,从赤桉嫩叶中克隆了2条Actin基因片段,并利用RACE技术获得Actin基因的全长cDNA,分别命名为ECACT1和EC-ACT2基因。生物信息学分析表明,这两条基因的全长cDNA分别为1533 bp和1387 bp,均含有1个编码377个氨基酸的开放阅读框。经比对分析,赤桉Actin蛋白的氨基酸序列与其他植物Actin蛋白的具有较高的相似性,并且具有Actin蛋白特有的保守序列和相关特征。因此推测这两条基因对桉树的生长发育具有一定的调控作用。     

肌动蛋白存在于金黄地鼠联会复合体中

以金黄地鼠精母细胞为材料,以抗肌动蛋白抗体为探针,应用免疫荧光和免疫胶体金技术有ＳＣ有无肌动蛋白的问题进行了研究。免疫荧光结果表明,经抗肌动蛋白抗体标记后,减数分裂粗线期标本中ＳＣ发出特异性荧光,说明肌动蛋白存在于ＳＣ中,免疫电镜结果表明：实验组ＳＣ的胶体金颗粒密度远高于对照组的金颗粒密度,说明ＳＣ含有肌动蛋白。观察到,常染色体ＳＣ和性染色体ＳＣ以及偶线期和粗线期ＳＣ中都含有肌动蛋白,肌动蛋白分布     

水稻OsUVR8基因电子克隆及生物信息学分析

[目的]获得水稻Os UVR8基因的编码区序列,并进行生物信息学分析。[方法]以拟南芥UVR8蛋白的氨基酸序列作为查询探针,用电子克隆的方法获得Os UVR8基因的编码区序列;用生物信息学软件对Os UVR8蛋白进行预测和分析。[结果]Os UVR8基因有13个外显子,编码区序列长1 764 bp,编码587个氨基酸。Os UVR8蛋白分子量为62132.7 Da,理论等电点为5.87,含有41个芳香族氨基酸,比较稳定,为亲水性蛋白。无规则卷曲是主要的二级结构,其次是延伸链。位于细胞内叶绿体、线粒体之外的区域。具有9个RCC1重复。有35个磷酸化位点,19个O-β-葡萄糖糖基化位点,6个Yin-Yang位点。三级结构与拟南芥UVR8蛋白三级结构相似。[结论]获得了水稻Os UVR8基因的编码区序列并进行了生物信息学分析。     

甘薯块根细胞中β-淀粉酶主要定位于质体内

淀粉降解代谢与种子萌发、叶片光合作用、块茎和块根贮藏及肉质果实的发育密切相关.体外酶学实验普遍认为,β-淀粉酶是催化淀粉水解的重要酶之一,然而由于其在生活细胞中经常定位于叶绿体或质体之外,与淀粉基质在亚细胞水平上相互隔离,所以该酶在植物活体内的生理功能至今尚不清楚.我们最近首次发现,苹果果实生活细胞中的β-淀粉酶主要定位于质体内,与其淀粉基质居于同一亚细胞区域,但尚不清楚这一现象是否具有普遍性.本研究利用胶体金免疫电镜定位技术证明,甘薯块根生活细胞中的β-淀粉酶也是主要定位于质体内,围绕淀粉粒分布较多,其他亚细胞区域内β-淀粉酶分布很少,说明该酶主要分布于其功能区域.质体内胶体金分布密度随着块根发育的推进显著增加,但β-淀粉酶区隔于质体内的亚细胞分布特点在块根整个生长发育期没有变化.这些结果明确地展示出甘薯块根生活细胞中β-淀粉酶与其淀粉基质居于同一亚细胞区域内,为β-淀粉酶普遍参与植物生活细胞或贮藏器官生活细胞中的淀粉水解提供了证据.     

甘薯块根细胞中β—淀粉酶主要定位于质体内

淀粉降解代谢与种子萌发、叶片光合作用、块茎和块根贮藏及肉质果实的发育密切相关。体外酶学实验普遍认为,β—淀粉酶是催化淀粉水解的重要酶之一,然而由于其在生活细胞中经常定位于叶绿体或质体之外,与淀粉基质在亚细胞水平上相互隔离,所以该酶在植物活体内的生理功能至今尚不清楚。我们最近首次发现,苹果果实生活细胞中的β-淀粉酶主要定位于质体内,与其淀粉基质居于同一亚细胞区域,但尚不清楚这一现象是否具有普遍性。本研究利用胶体金免疫电镜定位技术证明,甘薯块根生活细胞中的β-淀粉酶也是主要定位于质体内,围绕淀粉粒分布较多,其他亚细胞区域内β-淀粉酶分布很少,说明该酶主要分布于其功能区域。质体内胶体金分布密度随着块根发育的推进显著增加,但β-淀粉酶区隔于质体内的亚细胞分布特点在块根整个生长发育期没有变化。这些结果明确地展示出甘薯块根生活细胞中β-淀粉酶与其淀粉基质居于同一亚细胞区域内,为β-淀粉酶普遍参与植物生活细胞或贮藏器官生活细胞中的淀粉水解提供了证据。     

肌动蛋白存在于金黄地鼠(Mesocricetus auratus)联会复合体中

以金黄地鼠精母细胞为材料,以抗肌动蛋白抗体为探针,应用免疫荧光和免疫胶体金技术对ＳＣ有无肌动蛋白的问题进行了研究。免疫荧光结果表明：经抗肌动蛋白抗体标记后,减数分裂粗线期标本中ＳＣ发出特异性荧光,说明肌动蛋白存在于ＳＣ中。免疫电镜结果表明：实验组ＳＣ的胶体金颗粒密度远高于对照组的金颗粒密度,说明ＳＣ含有肌动蛋白。观察到,常染色体ＳＣ和性染色体ＳＣ以及偶线期和粗线期ＳＣ中都含有肌动蛋白,肌动蛋白分布于ＳＣ的端部和侧生组分上,代表肌动蛋白的胶体金颗粒在ＳＣ上往往成簇存在。对ＳＣ含有肌动蛋白的意义进行了讨论。     

几种动物细胞内钙调素的免疫电镜定位

本实验利用钙调素特异性抗体,采用胶体金技术对这种蛋白分子在几种动物细胞内进行标记定位及电镜观察,为其细胞内分布规律提出了直观的超微形态依据。     

白芷细胞外钙调素结合蛋白(ECBP21)免疫组化及金标定位分析

ECBP21是我们从白芷悬浮培养细胞外纯化及cDNA克隆的一种钙调素结合蛋白(CaMBP),亦是植物中首次报道的细胞外CaMBP。本实验以大肠杆菌表达的重组ECBP21蛋白为抗原,制备了高效价特异性抗体;随后,利用免疫组化及金标定位技术,研究了ECBP21蛋白组织特异性分布及亚细胞定位。免疫组化结果表明:ECBP21在白芷各组织中均有分布,但在叶、花、花序轴中较多,而在根中较少,并且ECBP21在细胞中多分布于细胞壁区域;免疫胶体金电镜定位结果显示:在白芷花序轴细胞中金颗粒主要分布在细胞壁,表明ECBP21蛋白主要定位于细胞壁区域,从而首次为细胞外CaMBP(ECBP21)的胞外存在提供了直观证据,并为进一步研究其在植物生长发育中的功能提供了初步信息。     

βAmyloid蛋白在恒河猴脑组织中的形态学特点

目的观察βamyloid蛋白在不同年龄的恒河猴脑中的表达及其组织学和细胞超微结构水平的分布特点。方法分别取脑组织额叶、海马、颞叶和顶叶做免疫组化,观察βamyloid蛋白在组织学上的分布特点及与年龄的关系;选用23岁恒河猴一只,灌注后取上述部位做免疫电镜,观察βamyloid蛋白在细胞超微结构水平的分布特点。结果免疫组化染色可观察到年轻猴的神经细胞和胶质细胞中有少量的Aβ40颗粒,以额叶和海马居多。在老年猴脑中Aβ40常聚集成团状斑块。年轻猴脑细胞内未见明显的颗粒状Aβ42,而老年猴的额叶有多量的Aβ42细胞外散在斑块,神经细胞和胶质细胞内也见有Aβ42颗粒状沉积。免疫电镜可观察到Aβ40的胶体金颗粒大部分存在于老年猴神经细胞细胞质中,在细胞间质和小胶质细胞中也可见少量的胶体金颗粒,多见于额叶;标记Aβ42的胶体金颗粒也是多见于神经细胞中,在小胶质细胞中少量存在,同时在颞叶的神经纤维束中也可见Aβ42标记的胶体金颗粒。结论Aβ42是恒河猴老年斑的主要成分,并在其形成过程中起到重要作用。     

免疫胶体金法检测TGFβ2,bFGF在IgAN肾组织内位点

目的探讨TGFβ2和bFGF在IgAN肾组织内存在的位点.方法采用免疫组织化学,胶体金标记和免疫电镜技术,对28例IgAN肾活检组织进行了TGFβ2和bFGF检测.结果 TGFβ2和bFGF主要集中于肾小管上皮细胞的线粒体基质内,在其它部位有极少量的分布.结论免疫电镜技术和免疫组织化学技术联合应用,对抗原的精确定位具有重要的研究意义.TGFβ2和bFGF主要集中于肾小管上皮细胞的线粒体基质内的生物化学意义需要进一步研究.     

绵刺肌动蛋白基因的分离及特性分析

本研究采用兼并PCR(polymerase chain reaction)和RACE(rapid amplification of cDNA ends)技术分离了绵刺(Potaninia mongolica Maxim.)肌动蛋白基因(Actin,Pm Actin)c DNA序列,该序列包含有1 134 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),编码377个氨基酸,预测蛋白分子量为41.8 k D,理论等电点为5.48;基因组DNA序列长度为1 134 bp,无内含子。该序列与其他植物Actin的一致性较高,核苷酸均高于88%,氨基酸则均高于96%。系统进化分析显示:Pm Actin与同属蔷薇科的草莓、碧桃,扁桃和蔷薇及葡萄科的葡萄Actin蛋白聚为一个亚类,与草莓Actin蛋白亲缘关系最为接近。RT-PCR分析显示,该基因在根、茎、叶中的表达量无明显变化,该结果验证了Pm Actin基因可作为分子内标的可靠性,为深入开展该植物的分子生物学研究提供理论依据。     

拟南芥菜(Arabidopsis thaliana)子叶中蛋白体形成的超微结构和免疫电镜定位研究

本文对拟南芥菜(Arabidopsis thaliana)种子发育过程中贮藏蛋白的积累和蛋白体的形成进行了超微结构和免疫电镜定位的研究。常规超薄切片的电镜观察表明,在开花后第10天(10 DAF),高电子密度的蛋白质物质开始在子叶细胞的液泡中沉积。这一过程一直延续到种子接近成熟(14 DAF),这时液泡中充满了蛋白质物质,转变成为大的蛋白体。利用了该种植物主要种子贮藏蛋白之一的12 s球蛋白的单克隆抗体作为免疫探针,以蛋白质A-胶体金电镜技术对12 s种子蛋白进行了细胞内定位,证实了在液泡中积累的物质为种子贮藏蛋白。实验结果表明在拟南芥菜中,子叶细胞中的液泡是蛋白体的前体,肯定了蛋白体的发生起源于液泡的观点。本文还对应用胶体金电镜技术进行细胞内定位的某些问题作了初步探讨。     

水稻CSN5B蛋白抗血清的制备及其应用

目的:克隆水稻COP9信号复合物5B亚基(CSN5B)的基因,原核表达CSN5B蛋白并制备多克隆抗体。方法:用RT-PCR技术从日本晴水稻中扩增得到CSN5B蛋白基因Os CSN5B并将其连接至p EASYTM-T5 Zero克隆载体,然后将其亚克隆至原核表达载体p ET-32a+,并导入大肠杆菌BL21plys S宿主菌中诱导表达;重组的CSN5B融合蛋白经Ni-NTA His.Bind Resin纯化后免疫兔子制备多克隆抗体,并经Western印迹分析。结果与结论:获得了CSN5B蛋白的特异性抗体,Western印迹显示CSN5B蛋白在水稻植株中呈高水平表达,为进一步探讨该基因的功能奠定了基础。     

水稻线粒体延伸因子OsEF-Tu基因的克隆及表达

[目的]克隆水稻线粒体基因Os EF-Tu并进行表达。[方法]RT-PCR分别扩增Os EF-Tu基因c DNA的5’端和3’端序列,重叠PCR克隆Os EF-Tu的c DNA序列。生物信息学分析Os EF-Tu基因,构建水稻线粒体基因Os EF-Tu原核表达载体并转化BL21(DE3),IPTG诱导表达融合蛋白。[结果]Os EF-Tu蛋白与多个高等植物线粒体延长因子EF-Tu蛋白具有同源性,p GEX-4T1-Os EF-Tu重组子构建成功并表达出带有GST标签的Os EF-Tu融合蛋白。[结论]水稻Os EF-Tu在高等植物中较为保守,原核表达Os EF-Tu融合蛋白在28℃诱导条件下包涵体中表达量高。     

水稻硒结合蛋白基因OsSBP的克隆、表达及生物信息学分析

为了探究水稻硒结合蛋白(selenium-binding protein, SBP)基因的功能,以水稻品种日本晴(Oryza sativa Japonica)为材料,采用同源克隆法获得Os SBP,并对其进行组织特异表达及生物信息学分析。结果表明,Os SBP基因cDNA序列为1 623 bp,包括长度为1 449 bp的CDS,碱基组成为A 23.3%、T 25.1%、G 28.9%、C 22.6%,编码482个氨基酸残基组成的蛋白质。Os SBP蛋白表现为弱酸性,且稳定、亲水;二级结构中以无规则卷曲和延伸链结构为主,三级结构同源建模成功,主要是螺旋和转角;亚细胞定位Os SBP主要分布在细胞质中,推测可能在运载结合、辅助因子中发挥重要作用,无跨膜结构域,无信号肽;该蛋白序列中存在24个丝氨酸磷酸化,11个苏氨酸磷酸化位点和10个酪氨酸磷酸化位点以及6个糖基化位点。启动子元件分析表明,其含有与热胁迫、干旱胁迫、光反应、细胞防御、赤霉素(GA)和茉莉酸甲酯(MeJA)信号传导相关元件。进化分析结果表明,克隆的Os SBP氨基酸序列与短柄草、高粱的同源关系较近,具有较高的保守性,与莱茵衣藻的同源关系较远。RT-PCR分析结果表明,Os SBP基因在各组织中均有表达,水稻孕穗期中茎的表达最高,其次分别为叶和根,穗中表达量最低,且该基因的表达受Cd,盐和热的诱导,以及PEG和Cold的抑制。该基因的成功克隆及分析为进一步研究Os SBP在水稻抗逆中的作用奠定了重要的基础。     

白芷细胞外钙调素结合蛋白（ECBP21）免疫组化及金标定位分析

ECBP21是我们从白芷悬浮培养细胞外纯化及cDNA克隆的一种钙调素结合蛋白(CaMBP),亦是植物中首次报道的细胞外CaMBP。本实验以大肠杆菌表达的重组ECBP21蛋白为抗原,制备了高效价特异性抗体;随后,利用免疫组化及金标定位技术,研究了ECBP21蛋白组织特异性分布及亚细胞定位。免疫组化结果表明：ECBP21在白芷各组织中均有分布,但在叶、花、花序轴中较多,而在根中较少,并且ECBP21在细胞中多分布于细胞壁区域;免疫胶体金电镜定位结果显示：在白芷花序轴细胞中金颗粒主要分布在细胞壁,表明ECBP21蛋白主要定位于细胞壁区域,从而首次为细胞外CaMBP(ECBP21)的胞外存在提供了直观证据,并为进一步研究其在植物生长发育中的功能提供了初步信息。     

中华大蟾蜍γ-肌动蛋白基因Bbgγ-Actin的克隆与生物信息学分析

旨在获得中华大蟾蜍肌动蛋白序列全长。以中华大蟾蜍(Bufo bufo gargarizans)耳后腺为材料,提取总RNA,通过转录组高通量测序快速得到中华大蟾蜍肌动蛋白基因(Bbg Actin)cDNA全长2 055 bp,通过RT-PCR技术对其ORF序列进行验证,并对Bbg Actin基因进行分析。序列分析表明,Bbg Actin基因开放阅读框长1 131 bp,编码376个氨基酸。通过BLAST P程序分析,所得序列与Gen Bank数据库中肌动蛋白基因序列相似度均在89%以上,氨基酸序列的相似性达90%以上。系统进化分析表明,Bbg Actin与γ-Actin聚为一类,所得中华大蟾蜍肌动蛋白属于γ-Actin。首次获得了中华大蟾蜍γ-Actin cDNA全长序列。