人β干扰素-血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达

利用重叠PCR技术在体外拼接IFN β和HSA基因,将得到的融合基因插入到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,置于启动子AOX1和α交配因子信号肽的作用下,分泌表达融合蛋白IFNβ-HSA。重组质粒pPIC9K-IFNβ-HSA经SalI线性化,电击转化毕赤酵母KM71,经G418筛选得到高拷贝转化子。PCR鉴定后,用甲醇诱导表达,SDS-PAGE和Western blot分析表达的融合蛋白IFNβ-HSA表明该蛋白分子量约为90kDa且具有HSA的抗原性;用细胞病变抑制法测定发酵液上清中融合蛋白的干扰素活性约为640IU/ml。     

人干扰素α2b和IgG Fc片段融合蛋白显著延长体内半衰期

重组人干扰素α(rHuIFNα)已被广泛用于临床治疗多种人类病毒性疾病和肿瘤。但IFNα在体内半衰期较短从而导致IFNα在用药后数小时即从血浆中被清除。目前常用化学修饰和构建融合蛋白的方法来延长IFNα的半衰期。在本研究中, 构建了IFNα2b与人IgG免疫球蛋白Fc片段的融合基因(IFNα2b-Fcγ)并在毕赤酵母中以二聚体形式分泌表达, 并有部分糖基化。不同亚型Fcγ片段的融合蛋白对IFNα2b抗病毒活性均有一定影响。其中IFNα2b-Fcγ2所受影响最小, 较单纯的IFNα2b降低了2.3倍, 抗病毒活性可达4.29x107 IU/mg, 大鼠皮下注射后循环血液中半衰期达65 h, 血液中存留时间120 h以上, 比商品重组干扰素的体内半衰期延长约8倍, 血液存留时间延长10倍, 显示了其良好的临床应用 前景。     

干扰素调节因子新剪接异构体IRF7-e的结构及功能

干扰素调节因子7是诱导玉型干扰素表达的最主要的转录因子。寻找IRF7新的剪接异构体,研究其结构及功能,为探索IRF7参与调控玉型干扰素机制的多样性提供基础。通过PCR和Sanger测序获得了IRF7一种新的剪接形式IRF7-e,并通过RACE获取了IRF7-e 基因全长。IRF7-e全长为1994 bp,含5'-UTR 410 bp,3'-UTR 120 bp,开放阅读框1464 bp,编码487个氨基酸的蛋白,预测其等电点为6.659,蛋白分子量为52.8 kD。双荧光素酶报告分析表明过表达IRF7-e能够提高玉型干扰素IFNα和IFNβ启动子的活性,其中对IFNα启动子活性提高了12.18倍,对IFNβ的启动子活性提高了2.99倍。表明IRF7-e可能参与玉型干扰素的调控。     

红鳍东方鲀干扰素γ基因的原核表达北大核心CSCD

旨在探究一种简单高效的获取重组红鳍东方鲀IFNγ蛋白的方法。提取红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)肾脏组织的总RNA,并以其为模板进行RT-PCR扩增干扰素γ(IFNγ)基因序列。将IFNγ成熟肽序列与表达载体p ET-32a(+)相连,成功构建了重组表达载体PET-32a-IFNγ。将其转化入E.coli BL21(DE3)感受态细胞后获得了重组表达IFNγ的基因工程菌。经IPTG诱导,p ET-32a-IFNγ在BL21中得到了表达。通过对表达产物的纯化和Western blotting检测,结果显示红鳍东方鲀IFNγ基因在大肠杆菌中的表达准确,且目的蛋白表达量较高。     

重组人肿瘤坏死因子(TNF)和干扰素αA(IFNαA)融合蛋白的构建及表达

本文采用定位诱导缺失突变技术,经137个单核苷酸缺失,将串联的重组人肿瘤坏死因子(rhTNF)和重组干扰素αA(rhIFNaA)基因融合成编码单一蛋白的基因。融合基因在大肠杆菌表达后,活性检测证实,存在一旣具有TNF抗肿瘤、又具有IFN抗病毒双重活性的蛋白质。融合蛋白的活性较TNF和IFNαA分别低24倍和15倍。分子筛分析证实,融合蛋白分子量大于25kD。     

齐墩果酸抑制肿瘤坏死因子-α诱导的成纤维细胞样滑膜细胞炎症因子表达及其机制研究

探讨齐墩果酸(Oleanolic acid,OA)对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导成纤维细胞样滑膜细胞的炎症因子表达的影响及其机制。首先复苏培养人成纤维细胞样滑膜细胞(FLS),通过RT-PCR检测细胞IL-6及IL-1βmRNA表达,采用Western blot方法检测p38MAPK及NF-κB蛋白表达变化,通过ELISA法检测细胞上清液中IL-6及IL-1β浓度。与对照组比较,TNF-α明显诱导FLS细胞IL-6及IL-1βmRNA的表达及上清液中IL-6及IL-1β的分泌(P0.05),同时磷酸化p38蛋白和核NF-κB明显增加(P0.05),且p38MAPK阻断剂SB203580能抑制TNF-α诱导的核NF-κB增加。OA呈浓度依赖性抑制TNF-α诱导的FLS细胞p38蛋白磷酸化和核NF-κB增加(P0.05)。且OA、p38MAPK通路抑制剂SB203580或NF-κB阻断剂BAY 11-7082均能抑制TNF-α诱导的IL-6及IL-1β分泌增加(P0.05)。综上所述,OA能抑制TNF-α诱导的FLS细胞炎症因子IL-6及IL-1β的产生,其机制可能与抑制p38MAPK/NF-κB信号通路有关。     

胸腺素α1与复合α干扰素融合蛋白的表达及其生物学活性

实验旨在获得具有双重生物学活性的重组胸腺素α1(Thymosin alphal,TM-α1)与复合α干扰素(IFNα-con)融合蛋白.选择大肠杆菌偏爱的密码子.将合成的TM-α1与IFNα-con编码序列构成的融和基因克隆至大肠杆菌表达载体pET-22b( )、在宿主茵BL21(DE3)-Codon plus-RP-X中成功表达了可溶性融合蛋白(TM-α1.IFN-con).表达量占总蛋白的20%以上.通过硫酸铵沉淀、疏水层析,阴离子交换层析、阳离子交换层析,分子筛层析后,产品纯度达到96%以上.采用细胞病变抑制法测定融合蛋白的抗病毒活性,采用细胞增殖实验检测融合蛋白对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响.结果表明.融合蛋白的抗病毒活性优于市售的IFNα1b和IFNα2a.对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响与市售的合成胸腺素α1相同.已有研究证实.该融合蛋白具有良好的体外抗HBV作用.其体外抗HBV活性比联合应用TM-α1和干扰素α强,且细胞毒性明显低于联合应用TM-α1和干扰素α,以上结果表明,通过大肠杆菌表达的可溶性融合蛋白(TM-α1.IFN-con).既具有良好的干扰素α抗病毒作用.也具有胸腺素α1促淋巴细胞增殖作用.     

双抗体夹心ELISA定量检测IFNβ-HSA融合蛋白方法的建立

为了建立β干扰素与人血清白蛋白融合蛋白(IFNβ-HSA)的酶联免疫定量分析方法,以抗IFNβ单克隆抗体为包被抗体,IFNβ-HSA融合蛋白为夹心抗原,辣根过氧化酶(HRP)标记抗HSA单克隆抗体为检测抗体,建立了一种定量测定IFNβ-HSA融合蛋白的双抗体夹心ELISA方法.并进行了检测限、精密度、准确度和稳定性等方法学考核.结果表明,包被抗体和检测抗体的最佳工作浓度均为2μg/ml,抗原浓度在51.88-3320 ng/ml范围内呈良好线性关系,相关系数R2>0.99.检测限为10ng/m1.经方法学考核,批内、批间变异系数分别为4.86%和8.08%,回收率为91.9%～110.4%,与IFN-B、IFN-α、HSA、IFNα2b-HSA基本无交叉反应.健全性分析表明发酵液稀释倍数对该方法无影响,8 d连续检测标准曲线表明稳定性良好.这种定量检测IFNβ-HSA融合蛋白的双抗体夹心ELISA方法,灵敏度高,重复性好,为当前融合蛋白发酵优化、分离纯化研究提供了定量检测的方法,并为后期药代动力学、临床研究提供了思路和备选方法.     

超级干扰素抑制A549增殖诱导其衰老

该研究利用MTT和结晶紫的方法证明sIFNα对肺癌细胞A549增殖有很强的抑制作用,而同样剂量的普通干扰素IFNα2b抑制作用要小很多。与对照组相比,sIFNα处理后,细胞形态发生改变,细胞体积变大,形态呈扁平状;Hoechst33258染色发现,细胞核形态无变化并且未检测到凋亡;SA-β-gal染色发现大多数细胞呈现阳性,同时,衰老相关蛋白p53和p21表达量明显上调。而IFNα2b处理组细胞形态基本没有变化,SA-β-gal染色也只有少部分的细胞呈现弱阳性。由此说明,sIFNα比IFNα2b能更好地抑制癌细胞增殖,其机制可能为诱导癌细胞发生衰老。     

人b干扰素与人血清白蛋白融合蛋白的表达及纯化

为开展人β干扰素-人血清白蛋白融合蛋白(IFNβ-HAS)的临床前研究,本研究采用免疫学方法对毕赤酵母转化子进行筛选,得到高产菌株8株。在5L发酵罐上对高产菌株进行诱导表达,产量达500mg/L。发酵液经超滤浓缩、染料亲和层析、镍离子螯合亲和层析和DEAE离子交换层析纯化后,融合蛋白纯度达到96%。Westernblotting杂交表明融合蛋白具有人血清白蛋白和人β干扰素的抗原性,细胞病变抑制法测定IFNβ-HSA比活性为1.96×107IU/mg。建立了融合蛋白的生产工艺,为IFNβ-HSA的临床前研究奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒nsp1蛋白对Ⅰ型干扰素应答的影响

猪流行性腹泻病毒 (PEDV) 能抑制宿主Ⅰ型干扰素及其诱导的细胞抗病毒免疫应答,但是PEDV抑制Ⅰ型干扰素应答的分子机制尚不明了,尤其是PEDV非结构蛋白 (Nonstructural proteins,nsps) 在Ⅰ型干扰素应答中的调控作用研究不多。为研究PEDV非结构蛋白1 (nsp1) 对细胞Ⅰ型干扰素应答的影响,构建了真核表达载体pCAGGS-nsp1,采用Western blotting和间接免疫荧光试验确定nsp1在细胞中的表达。通过报告基因法、ELISA以及病毒复制抑制试验评估nsp1对Ⅰ型IFN的影响。结果显示,nsp1在转染细胞和病毒感染细胞中均高效表达;双荧光报告基因试验结果表明,nsp1能显著抑制IFN-β启动子活性,且具有剂量依赖性。ELISA结果显示,nsp1能显著抑制IFN-β蛋白的表达。水泡性口炎病毒 (VSV) 复制抑制试验结果显示,nsp1明显抑制poly(I:C)介导的Ⅰ型IFN的抗病毒作用。结果提示,nsp1作为PEDV的保守蛋白,具有拮抗Ⅰ型干扰素启动子活性和应答的功能,为揭示PEDV逃逸宿主天然免疫应答的机制和研发新型高效抗PEDV疫苗奠定基础。     

干扰素在肝癌细胞Huh7.0中诱导SAMHD1抑制HBV复制

目的:研究干扰素调节宿主限制性因子SAMHD1的表达而抑制HBV复制的分子机制。方法:首先不同剂量的干扰素α、β和γ处理Huh7. 0细胞,通过荧光定量PCR和Western blot检测SAMHD1在转录和翻译后的表达水平;进一步通过siRNA干扰内源性的SAMHD1,再评价干扰素α、β对病毒的抑制效应;最后通过免疫荧光检测了干扰素α诱导内源性SAMHD1的细胞定位及Southern blot检测了SAMHD1细胞定位对病毒复制的影响。结果:在Huh7. 0细胞中,SAMHD1的RNA水平和蛋白表达明显受干扰素α和β的诱导升高;干扰SAMHD1后干扰素α和β对HBV复制的抑制作用消失; SAMHD1定位在细胞核内,干扰素α诱导SAMHD1同样定位在细胞核内,缺失核定位信号后SAMHD1丧失了其抑制病毒复制的作用。结论:在Huh7细胞中,干扰素α、β能诱导SAMHD1表达上调来抑制HBV的复制,SAMDH1的抗病毒作用依赖于其细胞定位。     

干扰素系统与病毒的相互作用

干扰素是最早发现的细胞因子之一,不同类型的IFN生物活性基本相同,具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等作用。病毒侵染细胞,诱导细胞产生IFN,IFN通过不同的作用机制启动宿主防御系统,激活酶和作用因子来拮抗病毒的侵染、复制和转录过程。正因为干扰素在抗病毒防御过程中的关键作用,因此病毒已经衍生出了有效的方式能够成功的侵染宿主。病毒通过表达一些拮抗蛋白来干扰IFN的诱导产生、IFN的信号转导或效应蛋白的作用,从而终止干扰素的产生并破坏干扰素诱导的其它因子的作用来逃避干扰素的作用。     

A型塞内卡病毒2C蛋白通过STING调控IFNβ、TNF-α和IL-6的表达

【背景】A型塞内卡病毒(Senecavirus A, SVA)是新发猪塞内卡病毒病的病原,属于小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)塞内卡病毒属(Senecavirus)的单股正链RNA病毒。可引起新生仔猪死亡和成年猪口、蹄部出现水泡。先天免疫是宿主抵御病毒入侵的第一道防线,但SVA与宿主抗病毒先天免疫的相互作用机制尚不清楚。【目的】探究SVA非结构蛋白2C在先天免疫应答中的作用机制。【方法】利用SVA感染和通过在猪PK-15细胞中过表达SVA2C蛋白,利用RT-qPCR和Western blotting分析2C蛋白对细胞因子表达及其关键信号通路的影响。【结果】RT-qPCR检测发现,SVA感染PK-15细胞导致IFNβ、TNF-α和IL-6表达的显著升高;同时,SVA感染导致TBK1和NF-κB的磷酸化。进一步的研究发现,SVA的2C蛋白能够激活TBK1和NF-κB磷酸化,并诱导IFNβ、TNF-α和IL-6的表达;2C蛋白能够激活抗DNA病毒感染关键蛋白干扰素基因刺激因子(stimulator of interferon genes, STING)磷酸化,敲除STING抑...     

长链非编码RNA——抗病毒天然免疫应答的新兴调控因子

长链非编码RNA(long non-coding RNAs, lncRNAs)是长度超过200nt的非编码RNA分子的总称。作为一类重要的基因调控因子,lncRNAs在表观遗传学、转录及转录后等多个水平调控靶基因的表达。近年来的研究表明,许多lncRNAs可被病毒或干扰素(interferon, IFN)诱导表达,并作为调控因子在IFN介导的抗病毒天然免疫应答中调节抗病毒相关基因的表达。本文重点阐述了lncRNAs在IFN介导的抗病毒天然免疫应答中的调控作用,尤其是对干扰素刺激基因(interferon-stimulated genes, ISGs)转录的调控作用,并归纳了lncRNAs、IFN和ISGs形成的调控网络,以期为从事lncRNAs调控IFN介导的抗病毒天然免疫应答机制研究的相关科研人员提供参考。     

液泡分选蛋白4B对骨关节炎软骨细胞凋亡的调控作用

目的:探讨液泡分选蛋白4B(VPS4B)对骨关节炎软骨细胞凋亡的调控作用。方法:通过内侧半月板部分切除加前交叉韧带切断的方法建立骨关节炎SD大鼠模型,通过RT-PCR和免疫组化检测VPS4B在大鼠关节软骨中的表达。番红O/固绿染色方法检测大鼠膝关节软骨组织形态变化。通过用10 ng/mL的IL-1β诱导人软骨肉瘤细胞SW1353 24 h来模拟骨关节炎样软骨细胞损伤,Western blot检测SW1353细胞中VPS4B、凋亡相关因子(cleaved caspase-3和cleaved PARP)和磷酸化p38的表达。转染si-RNA敲低SW1353细胞中VPS4B表达,并评估其对IL-1β诱导的SW1353细胞凋亡标记和p38 MAPK信号通路的影响。膜联蛋白V (Annexin V)和碘化丙啶(PI)染色用于检测软骨细胞凋亡。结果:VPS4B在模型组大鼠的关节软骨中明显上调(P0.05)。IL-1β诱导24 h后,SW1353细胞中的VPS4B、cleaved caspase-3、cleaved PARP和p-p38蛋白表达水平均明显增加。而转染VPS4B-si RNA敲低VPS4B的表达后,cleaved caspase-3、cleaved PARP和p-p38蛋白表达水平均被抑制,并且抑制了IL-1β诱导细胞的凋亡率。结论:VPS4B在骨关节炎发病过程中明显上调,VPS4B的上调通过激活p38 MAPK信号通路来促进软骨细胞凋亡。     

薄芝糖肽的抗肿瘤作用及其作用机制研究

目的研究薄芝糖肽的抗肿瘤作用,并探讨其作用机制.方法采用体内移植性肿瘤实验与体外细胞培养相结合的方法,对肿瘤细胞增值程度、细胞凋亡情况及肿瘤坏死因子(TNF)-α、干扰素(IFN)-γ及其mRNA的表达情况等进行研究.结果(1)薄芝糖肽在50、100、200μg/ml剂量下显著抑制移植性肉瘤S180的生长.(2)薄芝糖肽不能直接抑制人急性早幼粒白血病细胞(HL-60)的体外培养,不能诱导其凋亡.(3)薄芝糖肽与小鼠腹腔巨噬细胞和脾淋巴细胞共同培养显著抑制HL-60细胞生长并诱导其凋亡,TNF-α、IFN-γ及其mRNA的表达水平显著升高.结论薄芝糖肽可通过促进TNF-α和IFN-γ的mRNA的表达,增加TNF-α、IFN-γ的分泌而抑制肿瘤的生长.     

人γ干扰素突变体(rIFN-γ132-PGIL)的构建及其生物学活性的测定

利用DNA重组技术,去掉人γ干扰素(IFNγ)基因3′端含编码多肽羧基(C)端11个氨基酸的核苷酸序列,与编码P,G,I,L的DNA序列相连接,构成IFNγ突变体(rIFN-γ132-PGIL)基因,将后者插入pBV220P_RP_L串连启动子下游,转化大肠杆菌DH5α,在CIts857基因的调节下,通过升温诱导,获得了高效表达,表达量约占菌体可溶性蛋白的30％以上,抗病毒活性平均可达4.9×10~-8U/L,比母体菌株高10倍。SDS—PAGE结果表明,rIFN-γ132—PGIL分子量为17kd。     

干扰素调节因子家族和免疫调控

干扰素(IFN)是一类能够抵抗病毒感染、抑制细胞周期和行使免疫调节功能的细胞因子。干扰素调节因子家族(IRF)成员因在病毒感染时能够结合到IFN启动子上诱导、调节IFN的表达而得名。最近的研究表明:IRF是一类多功能的转录因子,在干扰素转录调控,病原体免疫反应,细胞因子信号转导,细胞增殖调控;以及造血干细胞的发育、淋巴细胞的分化,自稳平衡,先天性免疫和适应性免疫调控等方面都有着重要的作用。IRF的功能及其分子机制的揭示将对抗病毒,免疫疾病和恶性肿瘤的治疗提供新的靶向策略。     

红鳍东方鲀干扰素γ基因的原核表达

旨在探究一种简单高效的获取重组红鳍东方鲀IFNγ蛋白的方法。提取红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)肾脏组织的总RNA,并以其为模板进行RT-PCR扩增干扰素γ(IFNγ)基因序列。将IFNγ成熟肽序列与表达载体p ET-32a(+)相连,成功构建了重组表达载体PET-32a-IFNγ。将其转化入E.coli BL21(DE3)感受态细胞后获得了重组表达IFNγ的基因工程菌。经IPTG诱导,p ET-32a-IFNγ在BL21中得到了表达。通过对表达产物的纯化和Western blotting检测,结果显示红鳍东方鲀IFNγ基因在大肠杆菌中的表达准确,且目的蛋白表达量较高。