甲壳胺诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的实验研究

目的:通过体外实验探讨甲壳胺是否对人肝癌细胞HepG2具有生长抑制及诱导凋亡作用.方法:在HepG2细胞培养液中加入不同浓度的甲壳胺,培养48 h,于倒置相差显微镜下观察甲壳胺处理组及对照组细胞形态学变化;用流武细胞术(FCM)检测HepG2细胞的凋亡率,Western印迹检测甲壳胺处理组及对照组Bcl-2和p53蛋白...     

丙型肝炎病毒E2蛋白对HepG2细胞MAPK／ERK的激活

人CD81是丙型肝炎病毒（hepatitis Cvirus,HCV）的细胞表面特异性受体,HCV包膜蛋白－2（E2）可与其结合。细胞个信号调节激酶（extracellular signal-regulated protein kinase,MAPK/ERK1,2）信号途径主要介导细胞增殖及分化。为探讨HCV E2蛋白与人CD81结合对MAPK／ERK活性变化的影响,以HCV E2蛋白刺激HepG2细胞,采用免疫印迹、免疫组化及免疫荧光等方法动态观察细胞内MAPK／ERK的激活情况,并以流式细胞术检测细胞表面CD81的表达。结果表明：HepG2细胞高表达人CD81;HCV E2蛋白可激活细胞内MAPK／ERK;MAPK／ERK的磷酸化反应与HCV E2蛋白浓度、作用时间呈依赖关系;HCV E2－CD81相互作用引发的细胞异常信号转导可能与HCV致病性相关。     

3-硝基酪氨酸对HepG2细胞氧化还原状态的影响

为了确定3-硝基酪氨酸是否能促进细胞内产生氧化应激,该文研究了不同浓度3．硝基酪氨酸对HepG2细胞作用不同时间（6-48h）后,其对细胞活力、细胞内ROS（H2O2、O2-）、细胞内总抗氧化能力、细胞内抗氧化酶活力和脂质氧化的影响。结果表明,在高浓度（300μmol／L）3．硝基酪氨酸作用48h后,细胞活力下降至48．5％。同时,3-硝基酪氨酸能显著提升细胞内ROS并降低细胞内抗氧化酶活力,同时造成细胞内脂质过氧化物大量积累,最终使细胞线粒体膜电位去极化,并导致SirT3表达下调。损伤随着3-硝基酪氨酸含量的增加和反应时间的延长而加重。结果发现,3．硝基酪氨酸不仅作为蛋白质氧化产物,还能进一步通过降低机体内抗氧化能力而导致细胞内氧化应激加剧,最终导致细胞凋亡。     

共轭亚油酸对HepG2细胞脂质沉积的影响

目的:研究共轭亚油酸(conjugated linoleic acid,CLA)对HepG2细胞脂肪沉积的影响,以探讨其对肝脏脂肪沉积的可能机制.方法:体外培养HepG2细胞,不同浓度CLA(0、10、50、100 μmol.1-1)作用24小时后,100 nmol.1-1胰岛素作用1小时.以比色法测定培养液中游离脂肪酸的含量,油红O染色观察细胞脂肪沉积,Western-blot检测Akt和P-Akt蛋白表达.结果:随着CLA浓度增加,培养液中的游离脂肪酸含量显著降低,细胞中红染脂滴增多,Western-blot结果发现,Akt蛋白的磷酸化水平增高.结论:CLA可以增加细胞内脂肪合成和细胞中Akt蛋白的磷酸化水平.     

槲皮素下调hTERT表达对肝癌HepG2细胞生长影响研究

目的观察槲皮素对肝癌HepG2细胞生长及对hTERT基因表达的影响。方法以台盼蓝拒染法计数肝癌细胞的生长抑制率,透射电镜从形态变化上了解凋亡的发生,流式细胞术检测细胞周期变化,western-blot、RT-PCR检测hTERT基因表达改变,PCR-TRAP法检测端粒酶活性。结果台盼蓝拒染法计数显示槲皮素抑制肝癌HepG2细胞增殖的作用明显,且呈浓度和时间依赖性,槲皮素处理48h后的Ic50为25.5μm。形态学检测显示出细胞凋亡的特征变化,流式细胞仪检测表明经10～20μm/L的槲皮素处理,肝癌HepG2细胞周期阻滞于G0/G1期,且HepG2细胞hTERT蛋白和mRNA表达降低,端粒酶活性受抑制。结论槲皮素能抑制肝癌细胞的生长,呈时间、剂量依赖性,能诱导HepG2细胞发生凋亡,其抑制增生与诱导凋亡的机制可能与下调hTERT基因表达,抑制端粒酶活性,破坏端粒稳定性有关。     

胰岛素耐受的HepG2细胞模型建立

采用高胰岛素体外诱导培养HepG2细胞,建立胰岛素耐受的细胞模型。将HepG2细胞置于5×10-7mol/L胰岛素培养液中24h,采用3H-D-葡萄糖掺入试验及残余125I-胰岛素结合率测定等方法观察高胰岛素对HepG2细胞葡萄糖摄取率及其胰岛素受体数目和功能的影响。高胰岛素诱导培养的HepG2细胞葡萄糖掺入率及残余125I-胰岛素结合率明显低于未用高胰岛素诱导的HepG2细胞(对照细胞)。将高胰岛素诱导培养的HepG2细胞置于不含胰岛素的培养液中60h,其细胞葡萄糖摄取率仍明显低于对照细胞。将HepG2细胞置于5×10-7mol/L胰岛素环境中24h,该细胞对胰岛素的生物学效应产生抵抗,其胰岛素抵抗状态可维持60h。     

四逆散对人肝癌HepG2细胞增殖、凋亡的影响及其机制

目的:探讨含四逆散药液血清对人肝癌HepG2细胞增殖、凋亡的影响及机制。方法:将人肝癌HepG2细胞分为5组,每组3个复孔。实验组细胞用五氟尿嘧啶(5-FU)或不同浓度的含四逆散药液血清处理48 h后,用倒置显微镜观察含四逆散药液血清处理后人肝癌HepG2细胞形态的变化; MTT法检测含四逆散药液血清对HepG2细胞生长的抑制作用;荧光染色和流式细胞术分别分析含四逆散药液血清对HepG2细胞凋亡的影响。Rho123染色法检测线粒体膜电位变化,Western blot检测细胞凋亡相关蛋白的表达。结果:与对照组比较,含四逆散药液血清处理人肝癌HepG2细胞后,细胞数量显著减少(P<0.01),形态发生改变,呈现典型的凋亡细胞形态; G1期细胞数明显增加,而G2期细胞数量显著减少(P<0.05); Bax、Caspase-3、-9和Cyt-c的表达显著升高,而Bcl-2的表达显著降低(P<0.05);随着含四逆散药液血清浓度增大,HepG2细胞线粒体膜电位显著下降(P<0.05)。结论:四逆散可以抑制HepG2细胞增殖,并通过线粒体途径诱导细胞凋亡。     

细胞因子组合对肝癌细胞HepG2生长的影响

目的:探讨细胞因子组合在体外对肝癌细胞HepG2生长的抑制作用。方法:采用正交试验法,3种细胞因子(IFN-α2a、IL-2和GM-CSF)分别选择3种浓度,共分为9组组合,利用MTT比色法,检测细胞因子组合处理96 h后,对HepG2细胞生长的抑制作用,筛选3种细胞因子最佳组合,并进行形态学观察。结果:处理96 h后,不同浓度细胞因子组合对HepG2细胞的生长均有抑制作用,最佳组合为A1B1C1,其抑制率为64.61%。显微镜下可见,细胞变圆,胞浆中颗粒增多,增殖变慢,细胞间接触不紧密,细胞周围碎片增多。结论:已筛选到3种细胞因子的最佳组合,其在体外能够抑制HepG2细胞的生长。     

NF-kB 拮抗剂PDTC 对HepG2 细胞的抑制及对caspase-3 表达的影响

目的:研究NF-kB拮抗剂PDTC诱导人肝癌HepG2细胞凋亡及其对凋亡相关基因caspase-3表达的影响,初步探讨其诱导凋亡的可能机制。方法:以不同浓度的PDTC处理人肝癌HepG2细胞,利用MTT法检测对人肝癌HepG2细胞凋亡的影响;利用RT-PCR和Western-blot检测caspase-3mRNA和蛋白的表达。结果:不同浓度PDTC作用人肝癌HepG2细胞不同时间后,能够显著抑制HepG2细胞的生长增殖,存在剂量和时间依赖性(P<0.05);PDTC能够上调HepG2细胞中caspase-3mRNA和蛋白的表达。结论:NF-kB拮抗剂PDTC对人肝癌HepG2细胞产生显著抑制,并能上调HepG2细胞中caspase-3mRNA和蛋白的表达。     

NF-kB拮抗剂PDTC对HepG2细胞的抑制及对caspase-3表达的影响

目的：研究NF-kB拮抗剂PDTC诱导人肝癌HepG2细胞凋亡及其对凋亡相关基因caspase-3表达的影响,初步探讨其诱导凋亡的可能机制。方法：以不同浓度的PDTC处理人肝癌HepG2细胞,利用MTT法检测对人肝癌HepG2细胞凋亡的影响;利用RT-PCR和Western-blot检测caspase-3mRNA和蛋白的表达。结果：不同浓度PDTC作用人肝癌HepG2细胞不同时间后,能够显著抑制HepG2细胞的生长增殖,存在剂量和时间依赖性（P〈0.05）;PDTC能够上调HepG2细胞中caspase-3mRNA和蛋白的表达。结论：NF-kB拮抗剂PDTC对人肝癌HepG2细胞产生显著抑制,并能上调HepG2细胞中caspase-3mRNA和蛋白的表达。     

香蕉皮抗氧化和抑制人肝癌HepG2细胞活性研究

对香蕉皮提取物（banana peel extraction,BPE）的体外抗氧化作用和抗肿瘤活性进行了研究。使用福林酚和硝酸铝法测定BPE中总多酚和总黄酮含量;通过检测DPPH和O₂^-自由基清除能力测定BPE的体外抗氧化活性;采用Alamar Blue法检测BPE对HepG2细胞活性的影响;荧光染色及流式技术检测HepG2细胞凋亡;免疫印迹技术检测凋亡蛋白的变化;Caspase活性检测试剂盒测定Caspase-3和Caspase-9的活性;Caspase-9和Caspase-3抑制剂验证BPE抗肿瘤相关的信号转导通路。结果表明,BPE中总多酚和总黄酮含量分别为39.23 ± 2.35 mg·L^-1和26.53 ± 1.97 mg·L^-1;BPE显示出一定的DPPH和O₂^-自由基清除能力（65.31%±3.82%和51.29%±4.23%）,可明显抑制HepG2细胞的增殖（IC₅₀=54.32 mL·L^-1）;BPE通过上调Caspase-3、Bax、Bid、Apaf-1、Bak、p53、Caspase-9的表达,下调Bcl-2、Bcl-xl的表达诱导HepG2细胞凋亡;Caspase-9和Caspase-3抑制剂（Z-LEHD-FMK、Ac-DEVD-CHO）在一定程度上逆转了BPE的增殖抑制活性。BPE具有一定的自由基清除能力,对HepG2细胞具有明显增殖抑制作用,这些结果为香蕉皮的进一步开发利用提供了数据支撑。     

重组荞麦胰蛋白酶抑制剂对人肝癌细胞的凋亡及半胱氨酸天冬酶活性的影响

先前的研究表明,基因重组荞麦胰蛋白酶抑制剂 (rBTI) 具有诱导不同肿瘤细胞凋亡的作用.为了揭示其诱导肿瘤细胞凋亡的可能机理,从基因水平上探讨与凋亡有关的分子事件,本研究用不同浓度的 rBTI 体外作用于人肝癌细胞 HepG2 后,采用 MTT 比色法检测抑制剂对epG2 细胞的抑制率,用 DNA 凝胶电泳和细胞核的形态学观察检测 HepG2 细胞的凋亡.结果表明,rBTI 在体外能够明显抑制 HepG2 细胞的增长,并诱导细胞凋亡.另外,细胞凋亡与Bcl-2/Bax mRNA 水平有关.通过 RT-PCR 检测发现,细胞经过rBTI处理后,抗凋亡基因Bcl-2 mRNA 水平下调,促凋亡基因 Bax mRNA 有所上调,而对照 GAPDH 无变化.对 HepG2细胞中 Fas/Fas 配体及半胱氨酸天冬酶（caspase）的研究证明,细胞经过 rBTI 处理后,对死亡受体 Fas mRNA没有影响; rBTI 可明显激活caspase-3 和 caspase-9 酶活性, 对caspase-8 活性几乎无影响.上述结果表明,rBTI 对HepG2 细胞具有明显的诱导凋亡作用,其诱导细胞凋亡的机制与 caspase-3 依赖性凋亡调节信号通路有关,未涉及 Fas/Fas 配体途径.     

Tyrosine Hydroxylase Dephosphorylation by Protein Phosphatase 2A in Bovine Adrenal Chromaffin Cells

This study was undertaken to characterise the protein phosphatases in bovine adrenal chromaffin cells acting on tyrosine hydroxylase. Cells were pre-labelled with ³²P_i and permeabilized with digitonin. The extent of dephosphorylation of Ser-8, Ser-19, Ser-31 and Ser-40 on tyrosine hydroxylase was found to be 30%, 38%, 37% and 71% respectively over 5 min. For Ser-19, Ser-31 and Ser-40 the dephosphorylation was entirely due to protein phosphatase 2A, as the dephosphorylation could be completely blocked by microcystin, but not by the protein phosphatase 1 inhibitory peptide. Permeabilization did not change the distribution of protein phosphatase 2A or tyrosine hydroxylase, or the activity of PP2A, from that occurring in intact cells. The dephosphorylation of Ser-8 was not altered by any inhibitor, suggesting the involvement of other protein phosphatases. The method developed here can be used to determine the protein phosphatases acting on substrates in conditions closely approximating those in situ, including the endogenous state of substrate phosphorylation and phosphatase location.     

紫草素对人肝癌HepG2细胞增殖的抑制及诱导凋亡作用

目的:观察紫草素抑制人肝癌HepG2细胞增殖及凋亡诱导的作用。方法:用不同浓度的紫草素处理HepG2细胞,MTT检测紫草素对HepG2细胞生长增殖的抑制作用;比色法测定Caspase-3酶活性;Western blot法检测磷酸化Akt蛋白(pAkt)的表达。结果:紫草素能够抑制人肝癌HepG2细胞的增殖,并呈浓度、时间依赖性,紫草素与HepG2细胞作用24小时后Caspase-3酶活性显著增强,显示紫草素诱导的调亡作用随时间的延长而增加;同时,紫草素处理HepG2细胞后,随着药物浓度的增加,磷酸化Akt蛋白表达下降。结论:紫草素可抑制人肝癌细胞HepG2的增殖,诱导HepG2细胞凋亡,凋亡机制可能与紫草素抑制PI3K/Akt信号途径有关。     

锤头状核酶在HepG2细胞中抑制adr亚型的乙型肝炎病毒

针对HBV基因组设计了三种锤头状核酶－－RS3、RC2和RC1。将裸露的和用tRNA包埋的核酶（RtS3、RtC2和RtC1）基因插入RNA修剪质粒pRG523中,然后转变为真核表达载体,使用同样克隆技术,构建由不同长度（2、4、8、12个）RS3或12个RtS3连成的鸟枪型真核表达载体,将它们分别与带有HBV基因组的质粒共转染人肝癌细胞系HepG2,用G418筛选抗性细胞。分析不同种类的核酶在G418抗性细胞中的HBV抑制活性,包括子代HBV－DNA、HBV－RNA和抗原（HBsAg或HBcAg/HBeAg)表达的减少。结果表明,所有设计的核酶对HBV有＞70％的抑制活性,而tRNA包埋核酶的活性略高于裸露核酶。特别值得提出的是,由8个或12个相同核酶连接的鸟枪型质粒（8RS3、12RS3和12RsS3）具有很高的抑制HBV活性,达到＞9－％的抑制。     

HBV通过增强DNAJB4启动子活性调节其在HepG2．2．15细胞中的表达

目的初步探讨HBV与DNAJB4基因的转录调节作用机制。方法用RT-PCR及Real—timePCR检测HepG2．2．15细胞和HepG2细胞中DNAJB4在mRNA水平上的表达差异。构建DNAJB4启动子虫荧光素酶报告质粒,分别与HBV、HBs、HBp、HBc、HBx表达质粒共转染HepG2细胞,比较虫荧光素酶活性。结果在mRNA水平上,DNAJB4在HepG2．2．15细胞中的表达量是其在HepG2细胞中表达量的2．59倍,且二者有显著性差异（P〈0．01）。DNAJB4启动子虫荧光素酶报告质粒与HBV表达质粒共转染组的相对荧光素酶活性是其对照组的2．28倍。转染HBs和HBc表达质粒组的相对荧光素酶活性分别是其对照组的2．11倍和1．77倍,而HBx、HBp表达质粒对荧光素酶活性没有影响。结论在HepG2．2．15细胞中,HBV能通过增强DNAJB4启动子活性增加DNAJB4转录水平的表达,其中HBs和HBc蛋白起主要作用。     

Protein Tyrosine Phosphatase 1B Regulates Pyruvate Kinase M2 Tyrosine Phosphorylation

Protein-tyrosine phosphatase 1B (PTP1B) is a physiological regulator of glucose homeostasis and adiposity and is a drug target for the treatment of obesity and diabetes. Here we identify pyruvate kinase M2 (PKM2) as a novel PTP1B substrate in adipocytes. PTP1B deficiency leads to increased PKM2 total tyrosine and Tyr¹⁰⁵ phosphorylation in cultured adipocytes and in vivo. Substrate trapping and mutagenesis studies identify PKM2 Tyr-105 and Tyr-148 as key sites that mediate PTP1B-PKM2 interaction. In addition, in vitro analyses illustrate a direct effect of Tyr-105 phosphorylation on PKM2 activity in adipocytes. Importantly, PTP1B pharmacological inhibition increased PKM2 Tyr-105 phosphorylation and decreased PKM2 activity. Moreover, PKM2 Tyr-105 phosphorylation is regulated nutritionally, decreasing in adipose tissue depots after high-fat feeding. Further, decreased PKM2 Tyr-105 phosphorylation correlates with the development of glucose intolerance and insulin resistance in rodents, non-human primates, and humans. Together, these findings identify PKM2 as a novel substrate of PTP1B and provide new insights into the regulation of adipose PKM2 activity.     

tRNA-包埋核酶在HepG2细胞中的抗HBV活性

已知 ｔ Ｒ Ｎ Ａ 包埋核酶比裸露核酶在胎牛血清和 Ｈｅｐ Ｇ２ 细胞抽提液中有较高的稳定性 构建了 ｈ Ｃ Ｍ Ｖ 启动子驱动下的抗 Ｈ Ｂ Ｖ（ａｄｒ 亚型）的 ｔ Ｒ Ｎ Ａ 包埋核酶基因质粒,与携带 Ｈ Ｂ Ｖ 基因的ｐ１２Ⅱ质粒共转染 Ｈｅｐ Ｇ２ 细胞,用 Ｇ４１８ 筛选抗性细胞 分析稳定表达细胞中的 Ｈ Ｂ Ｖ Ｒ Ｎ Ａ, Ｈ Ｂ Ｖ 抗原合成和新生 Ｄ Ｎ Ａ 合成,表明ｔ Ｒ Ｎ Ａ 包埋核酶比裸露核酶有较高的抑制 Ｈ Ｂ Ｖ 活性．ｔ Ｒ Ｎ Ａ 包埋核酶和裸露核酶分别使靶 Ｒ Ｎ Ａ 减少 ８２％ ～８７％ 和 ７５％ ～８１％ ,抗原减少 ７３％ ～８０％ 和７０％ ～７４％ 以及新生 Ｄ Ｎ Ａ 减少 ７４％ ～７６％ 和 ６７％ ～７１％ 结果指出,核酶,特别是 ｔ Ｒ Ｎ Ａ 包埋核酶,对 Ｈｅｐ Ｇ２ 细胞中 Ｈ Ｂ Ｖ 表达和复制有明显抑制作用,可能作为 Ｈ Ｂ Ｖ 基因治疗的手段之一 