金黄色葡萄球菌核酸酶基因缺失突变株RN4220Δnuc1的构建

金黄色葡萄球菌存在两个核酸酶编码基因,一个是葡萄球菌核酸酶（Staphylococcal nuclease,SNase）,命名为nuc1,另一个是耐热核酸酶（Thermonuclease,TNase）,命名为nuc2,nuc2是一个新的候选基因,以往认为金黄色葡萄球菌中的核酸酶只源于一个编码基因nuc1,为了进一步研究nuc2基因的功能,首先要将金黄色葡萄球菌nuc1基因缺失。本研究目的就是通过构建同源重组质粒pBT2Δnuc1,将其电转入金黄色葡萄球菌菌株RN4220中,获得nuc1基因缺失突变株。经过了七轮培养和筛选,同源重组几率为2%（7/345）,筛选出的nuc1突变株用PCR方法和RT-PCR进行了验证,从而获得了nuc1基因缺失突变株RN4220Δnuc1。     

金黄色葡萄球菌一氧化氮合酶基因(nos)缺失突变株的构建

目的：构建金黄色葡萄球菌一氧化氮合酶基因（nos）缺失突变株。方法从金黄色葡萄球菌RN6390的基因组DNA中扩增了nos基因的上、下游片段;以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌穿梭质粒pMAD（含有温度敏感性的复制起点,红霉素抗性基因（erm）和B．半乳糖苷酶基因（bgaB）为筛选标记）为骨架,构建基于nos基因位点的同源重组载体pMADAnos,该载体经金黄色葡萄球菌RN4220修饰后再转入金黄色葡萄球菌RN6390。经过在30℃和42℃交替培养,通过抗生素抗性和β-半乳糖苷酶活性筛选nos基因缺失突变株。结果筛选得到的突变菌株,经基因组PCR、定量PCR及序列分析表明,金黄色葡萄球菌RN6390基因组中的nos基因被成功地敲除。结论利用同源重组的方法构建了金黄色葡萄球菌RN6390nos缺失突变株,为金黄色葡萄球菌nos基因功能的研究奠定了基础,     

金黄色葡萄球菌hmp基因缺失突变株的构建及抗一氧化氮能力分析

摘要：【目的】:构建金黄色葡萄球菌RN6390黄素血红蛋白(flavohaemoglobin, HMP)基因缺失突变株,研究其抗一氧化氮(Nitric Oxide, NO) 能力及其在细菌生物被膜形成中的作用。【方法】：根据同源重组技术的原理,利用PCR扩增RN6390的hmp基因上下游同源臂,经过抗生素和温度交替培养筛选hmp基因缺失突变株,利用基因组PCR、定量PCR对突变菌株进行鉴定。以硝普钠（SNP）为NO供体,检测了hmp基因缺失菌株的抗NO能力,并初步研究了hmp基因在生物被膜形成中的作用。【结果】：成功构建了RN6390的hmp基因缺失突变株,外源NO能够诱导菌株hmp基因的表达,hmp基因缺失菌株抗NO能力明显下降,但其生物被膜形成能力有明显提高。【结论】：获得了RN6390的hmp基因缺失突变株,该突变株的获得为进一步研究hmp基因的生物功能,以及细菌内源性NO的作用奠定了良好的技术平台。     

一株金黄色葡萄球菌小菌落突变株的分离鉴定

摘要：【目的】由于金黄色葡萄球菌（金葡菌）小菌落突变株（small colony variants,简称SCVs ）可引起持续复发性感染,且对氨基糖苷类有抗药性,在临床诊断和治疗上造成很大的困扰。我国国内尚无金葡菌SCVs的报道,本研究旨在分离鉴定出金葡菌SCVs菌株,为国内进行SCVs的相关研究提供生物学材料。【方法】通过细菌的形态鉴定、种特异性基因（nuc）的PCR扩增鉴定以及系列生化实验,从人源、动物源及环境源共104株金葡菌分离株中筛选得到金葡菌SCVs,并通过甲萘醌、硫胺素、胸腺嘧啶和血红素等补     

金黄色葡萄球菌核酸酶基因的片段缺失与定点突变

金黄色葡萄球菌核酸酶R(SNase R)是金黄色葡萄球菌核酸酶(SNase A)的一种类似物,具有与SNaseA相同的酶活性,与SNase A唯一不同之处是在N端多出6个氨基酸残基。为了得到完整的SNase基因并使其在E.Coli中表达,我们利用单链U模板—单引物突变法,将为6个额外氨基酸残基编码的18个氨基酸残基删除,其突变率可达90％。进而,完整的SNase A基因被重组入表达载体pBV221。细菌表达产物的PAGE分析结果指出,SNase A在E.coli中得到高效表达。与此同时,我们利用两个不同的引物在单链U模板上同时介导两种不同类型的突变(片段缺失、碱基取代)其突变率可达83％以上,这为进行多种类型的高效突变提供一个有用的方法。本文也对影响突变率的某些实验因素进行了讨论。     

产SEB金黄色葡萄球菌α-溶血毒素基因缺失菌株的构建

构建产肠毒素B(Staphylococcal enterotoxin B ,SEB)的金黄色葡萄球菌α-溶血毒素（α-hemolysin, α-HL)缺失菌株。首先构建用于α-HL基因敲除的同源重组质粒pMHL-α,经金黄色葡萄球菌RN4220修饰后再通过原生质体转入金黄色葡萄球菌SM-01。含重组质粒pMHL-α的金黄色葡萄球菌SM-01在42℃诱导条件下培养多代,最终筛选出α-溶血毒素基因缺失菌株。经序列分析和血平板溶血实验结果证明最终获得产SEB金黄色葡萄球菌α-HL缺失菌株。为野生型金黄色葡萄球菌的体内遗传操作及构建产超抗原药物金黄色葡萄球菌基因工程菌株提供了一定的理论基础和方法。     

金黄色葡萄球菌OatA基因敲除菌株及其回补菌株的构建

目的:构建金黄色葡萄球菌(金葡菌)Oat A基因敲除菌株及其回补菌株。方法:以p BT2为载体,构建金葡菌Oat A基因敲除质粒p BT2-△Oat A,经金葡菌RN4220修饰后电转入金葡菌USA300,利用p BT2载体对温度敏感的特点,在42℃多次传代,筛选出金葡菌Oat A基因敲除菌株。以p LI50为载体,构建p LI50-Oat A全基因回补质粒,电转入金葡菌RN4220,再次抽提后电转入敲除菌株△Oat A,获得基因回补菌株p Oat A。结果:成功构建基因敲除质粒p BT2-△Oat A,经RN4220修饰电转入USA300,经PCR及测序鉴定,获得了金葡菌Oat A敲除菌株△Oat A。经PCR及酶切鉴定,确认p LI50-Oat A回补质粒构建成功,通过金葡菌RN4220修饰后电转入敲除菌株△Oat A,获得基因敲除回补菌株p Oat A。结论:成功构建金黄色葡萄球菌Oat A基因敲除菌株及其回补菌株,为进一步研究金葡菌Oat A的功能及其作用机制奠定基础。     

炭疽芽孢杆菌A16R株eag基因缺失突变株构建

【目的】构建炭疽芽孢杆菌A16R株eag基因缺失突变株, 为研究eag基因的功能奠定了基础。【方法】本研究以我国人用炭疽杆菌活疫苗A16R株中eag基因为目的缺失基因,根据炭疽芽孢杆菌Ames株基因组序列,利用软件设计了扩增上下游同源臂以及抗性基因引物,构建了重组质粒,将该重组质粒电击转入炭疽杆菌A16R感受态细胞中,利用同源重组原理筛选到炭疽杆菌A16R株eag基因缺失突变株。在分子水平及蛋白质组学方面对基因缺失突变株进行验证。【结果】成功构建了重组质粒,经同源重组后获得eag基因缺失突变株。PCR鉴定表明目的基因已经丢失;SDS PAGE表明野生株与突变株在93 KDa处有差异蛋白条带,经质谱鉴定分析该条带为目的基因所表达的EA1蛋白;双向电泳结果显示突变株与野生株比较明显缺失3个蛋白点,经质谱分析后确定这3个点都是EA1蛋白。【结论】成功获得炭疽芽孢杆菌A16R株eag基因缺失突变株,为深入研究eag基因的功能奠定了基础,同时也为炭疽芽孢杆菌重要基因功能的研究建立了一个良好的技术平台。     

金黄色葡萄球菌核酸酶A基因在大肠杆菌中的高效表达

这篇文章报道了金黄色葡萄球菌核酸酶A的克隆和在温控启动子P_RP_L调控下在E．Coli中的高效表达。SDS—PAGE分析表明,核酸酶A的含量可占E．Coli细胞总蛋白含量的60%。经有效的增溶和复性处理后,重组酶具有与天然酶相同的活力;N-末端氨基酸分析的结果指出,fMet在转译后被加工去除;对重组SNaseA在构象上的同一性也通过Phenyl—Su—perose疏水柱层析进行了分析。     

利用T载体克隆快速构建布鲁氏菌缺失突变株

目的：建立一种基于T载体快速克隆构建布鲁氏菌突变株的方法,提高布鲁氏菌突变株构建的效率;方法：采用融合PCR的方法,将待缺失基因上下游的同源臂与卡那霉素抗性基因融合起来,构建突变盒,然后将突变盒直接与T载体连接,构建突变载体,将载体转入布鲁氏菌感受态细胞并筛选抗性克隆,进而获得布鲁氏菌的缺失突变株。结果：结合融合PCR和T载体快速克隆,能够在48h之内构建好突变载体,与传统的酶切连接相比,效率高、周期短。结论：基于T载体快速克隆是一种非常高效的构建突变株的方法,为布鲁氏菌突变株的构建提供了一种新方法。     

253株金黄色葡萄球菌耐药现状分析

目的 了解医院金黄色葡萄球菌临床分布情况及其对常用抗菌药物的耐药率,为临床合理使用抗菌药物提供依据.方法 回顾分析医院2010年5月至2011年4月检出的金黄色葡萄球菌,采用VITEK-AMS全自动微生物分析仪进行菌种鉴定和药敏分析.结果 共检出金黄色葡萄球菌253株,菌株的主要来源为痰130株(51.4％)、血液39株(15.4％)、创面24株(9.5％);菌株主要科室分布前3位是神内科35株(13.8％)、ICU30( 11.8％)、脑外科26株(10.3％);其中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌( MRSA)为165株(65.2％),MRSA对多种抗菌药物耐药率＞70.0％,MSSA为88株(34.8％),对除青霉素、红霉素外的大多数抗菌药物敏感,未发现耐万古霉素菌株.结论 MRSA检出率高,耐药现状严重,应加强对金黄色葡萄球菌耐药性的监测,并根据药敏试验结果合理使用抗菌药物.     

012 金黄色葡萄球菌的细胞毒性和与株特异毒力的相关性

金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)是人类重要的致病菌,以往将其作为胞外致病菌。近年来发现该菌能够侵袭多种宿主细胞,并导致细胞死亡。但有关金葡菌侵袭和细胞毒性是否为临床分离株的共有特性及其对该菌致病性的作用尚不清楚。     

以克隆载体为自杀载体快速构建布鲁氏菌的无痕缺失突变株

构建突变株是病原微生物致病机理研究的重要手段。以往研究中布鲁氏菌的无痕缺失突变株都采用传统的自杀载体来构建,效率低下。首先对布鲁氏菌的电击转化条件进行了优化,然后选择含有反向筛选基因sacB的pEX18Gm质粒作为自杀载体,构建了缺失Ⅳ型启动子区的布鲁氏菌无痕缺失突变株。这不仅为构建布鲁氏菌的突变株提供了一个快速有效的技术平台,也为深入研究Ⅳ型分泌系统的功能奠定了基础。     

酵母海藻糖酶缺失突变株的构建及其耐性

[目的]构建酵母海藻糖酶缺失突变株,并进行耐性分析,进一步研究海藻糖与酵母耐性之间的关系,为商业生产打下一定的基础.[方法]利用同源重组的方法,敲除了编码酸性海藻糖酶的ATH1基因和中性海藻糖酶的NTH1基因,构建了酸性海藻糖酶缺失突变株(△ath1)、中性海藻糖酶缺失突变株(△nth1)和双缺失突变株(△ath1△nth1),并进行了耐性分析.[结果]结合PCR和Southernblot的结果,验证了突变株构建的正确.所有突变株的海藻糖积累量和细胞密度均高于亲本,冷冻、高温、高糖和酒精耐性提高了.[结论]说明海藻糖含量与酵母耐性有一定的相关性.突变株耐性的改善,表明它们在酿造和烘焙产业中具有潜在的商业价值.     

单核细胞增生性李斯特菌prfA基因缺失株的构建及其生物学特性

【目的】单核细胞增生性李斯特菌(Lm)是人兽共患李斯特菌病的病原菌,其致病性与调控因子PrfA蛋白作用下毒力基因的表达有着密切关系,本文初步探讨了PrfA蛋白对细菌毒力因子的调控作用。【方法】利用同源重组技术对血清型分别为1/2a和4b的LM4、F4636进行prfA基因的敲除,并构建其回复突变株,对获得的突变株LM4ΔprfA、F4636ΔprfA进行生物学特性研究。【结果】实验结果表明:两株缺失株的溶血活性丧失、回复突变株的溶血活性得到恢复,突变株还丧失磷脂酶活性,黏附和侵袭特性显著下降(P<0.05),对BALB/c小鼠的半数致死剂量提高了105个数量级。【结论】由此表明,PrfA蛋白对hly、plcB、inl家族基因的表达及细菌毒力具有重要的调控作用。prfA基因缺失株的构建为进一步研究PrfA蛋白的调控功能提供了材料,为研究其在Lm致病性中的作用奠定了基础。     

构建胸膜肺炎放线杆菌apxIC基因插入突变株

目的：构建胸膜肺炎放线杆菌（APP）apxIC基因插入突变菌株,以鉴定ApxⅠ毒素的生物学特性。方法：根据apxⅠ核酸序列（U05042）设计1对引物,用于自APP血清10型参考菌株（D13039）基因组DNA中扩增apxIC基因及其上下游约2．8kb的基因片段,经克隆测序后在apxIC基因下游xbI酶切位点处插入约0．9kb的氯霉素（Chl）抗性基因表达盒,构建用于转化的转移载体pUIC-Chl^r,将转移载体DNA经电转化导入APP血清10型参考菌株中进行同源重组,以获得突变菌株。结果：在含有氯霉素的培养基中经筛选获得2株丧失溶血活性的突变菌株（D13039C-Chl^r）;利用PCR和Southern blot对突变菌株鉴定,显示氯霉素抗性基因已被插入细菌基因组中。结论：利用电转化和同源重组技术构建成功APP apxIC基因插入突变菌株,为分析ApxⅠ毒素的生物学特性,进而研制APP基因工程减毒活疫苗奠定了基础。     

同源重组法构建枯草芽孢杆菌224 yugS基因缺失突变株

从枯草芽孢杆菌224的基因组DNA中分别扩增出溶血样基因yugS的上、下游片段,并利用携带新霉素抗性基因(neor)的重组质粒pMD18-T-neo作为骨架,构建了基于yugS基因位点的基因阻断质粒pMD18-T-neo-yugS,线性化后电转化入枯草杆菌224,从新霉素抗性平板上挑取转化子,通过对基因组的PCR鉴定和核苷酸测序证明,确定转化子yugS156为yugS基因缺失突变株。     

金黄色葡萄球菌毒力基因的调控位点

金黄色葡萄球菌的许多致病因子受到细菌的多种遗传位点的调控,各调控位点之间存在复杂作用,各位点的突变可降低金黄色葡萄球菌的致病力。     

金黄色葡萄球菌RNaseH Ⅰ、RNaseH Ⅱ和RNaseH Ⅲ突变菌株的构建及功能研究

目的:在金黄色葡萄球菌中分别构建RNaseHⅠ、RNaseHⅡ和RNaseHⅢ的突变菌株,并研究它们在金黄色葡萄球菌中的生物学功能。方法:利用同源重组的方法在金黄色葡萄球菌中分别构建RNaseHⅠ、RNaseHⅡ和RNaseHⅢ的插入突变菌株,检测突变株生长速度、溶血活性及外分泌蛋白表达水平与野生型的差异,进一步通过流式细胞术检测突变株外分泌蛋白细胞毒性的改变,同时在体外检测突变株在全血中的存活能力。结果:构建了金黄色葡萄球菌RNaseHⅠ、RNaseHⅡ和RNaseHⅢ的插入突变菌株;表型检测结果显示,与野生型菌株相比,3种突变株的生长速度减慢,溶血素和外分泌蛋白明显减少;流式细胞术检测结果显示3种突变株毒性比野生型菌株减弱;全血杀伤实验结果显示3种突变株在全血中的存活率低于野生型菌株。结论:RNaseHⅠ、RNaseHⅡ和RNaseHⅢ在金黄色葡萄球菌生长繁殖、毒素产生和侵袭机体的过程中有重要作用,它们可能与金黄色葡萄球菌的致病性相关。