山羊胎儿肝脏3β—羟基甾体脱氢酶／Δ^4—Δ^5异构酶（3β—HSD）cDNA的克隆

3β－羟基甾体脱氢酶／Δ^4-Δ^5异构酶（3β－HSD）是哺乳动物体内广泛存在的一类参与甾体激素代谢的氧化还原酶,且具有异构酶活性。3β－HSD催化3β－羟基甾体的脱氢及随后的Δ^5-3-甾酮产物的异构化反应,以产生α,β－非饱和酮,3β－HSD在甾体激素代谢中起着重要作用。本文以胎羊肝为材料,首次获得了山羊胎肝的3β－HSD的cDNA,并进行了3β－HSD在肝脏组织的表达分析。参照牛,啮齿类的3β－HSD CDNA的高同源区设计引物,以2－3月雌性胎羊肝脏mRNA为模板,经RT－PCR获得416 bp cDNA片段（Fig.a),然后以其为探针筛选胎羊肝λgt10cDNA文库最后获得3－端缺失的3β－HSD cDNA克隆,并推导了其氨基酸序列（Fig.s)。同源分析表明山羊胎肝3β－HSD的氨基酸序列与牛卵巢,人I型3β－HSD的同源性分别为96％,78％和73％（Fig.3),提取雌性胎羊,雄性胎羊及母体羊肝脏的总RNA,同时做RT－PCR,表明3β－HSD在不同个体肝脏中的表达存在差异,雌性胎羊和母体孕羊肝脏中都有3β－HSD的表达,而在雄性胎羊肝脏中,则未检测到表达信号（Fig.4)。     

△^5—3β，7β-二羟基甾醇及其C-7差向异构体波谱特征及胆碱酯酶的抑制活性

本文对△^5-3β,7β-二羟基甾醇（1—3）和△^5-3β,7α-二羟基甾醇（4～6）的一些核磁共振波谱特征进行了比较。活性测试表明化合物1—6对乙酰胆碱酯酶（AChE）无明显的抑制活性,对丁酰胆碱酯酶（BuChE）则有较强的抑制活性,其中24-亚甲基胆甾-5-烯-3β,7α-二醇（6）的IC50值为9．5μM。通过活性数据比较我们发现7α-羟基甾醇对丁酰胆碱酯酶的抑制活性明显比相应的7β-羟基甾醇高。我们通过计算7位羟基和四环平面之间的二面角角度来尝试解释这些活性差别。     

妊娠小鼠△ 5 3β羟甾脱氢酶活性的测定

生物体内具有激素活性的所有甾体的合成,都涉及到将△~5-3β羟基氧化为△~4-3酮基的步骤,催化这一氧化过程的酶就是△~5-3β羟甾脱氢酶(△~5-3βHSD)。维持妊娠必需的孕酮和雌二醇的合成也有赖于此酶的催化作用。早在六十年代初就已用生化和组织化学的方法证明了该酶的存在,而且只存在于甾体激素产生的组织内。在一定生理状况下,△~5-3βHSD活性的变化是调控甾体合成速度的重要机制。最近高德伟等人报告了应用利血平及LH-RH     

3β-羟基类固醇脱氢酶基因的克隆表达及其性质研究

目的:构建3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-HSD)异源表达系统,进一步探究其酶学性质。方法:通过分子生物学方法克隆来源于Mycobacterium neoaurum菌株的3β-羟基类固醇基因,构建重组质粒,运用HPLC方法检测酶反应体系的产物。结果:本实验构建了表达载体pet28a-hsd。优化诱导表达条件,发现3β-HSD异源表达的最适温度为16℃~25℃,37℃时蛋白表达为包涵体。此外,同一温度下不同IPTG浓度诱导的表达结果差异不大。利用纯化后的蛋白进行酶特性的研究,结果表明在3β-HSD酶反应体系中,30℃达到较高的酶活性;pH 7.5~9.0之间,酶活力较强,pH低于7.0时,酶活性明显下降;有机助溶剂DMSO对酶反应有抑制作用;Fe~(3+)和Cu~(2+)对酶反应有抑制作用。结论:本实验探究了分枝杆菌中3β-羟基类固醇脱氢酶的相关性质,为进一步研究该酶在类固醇代谢中的功能提供基础。     

3β-羟基类固醇脱氢酶在甾体激素生成组织中的功能

3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-hydroxysteroid dehydrogenase,3β-HSD)是一类依赖于NAD+/NADP+接受质子的氧化还原酶。在胆固醇转化为类固醇激素中起限速酶作用,在体内广泛分布。3β-HSD催化环戊烷并多氢菲结构3号位CH-OH转化为C=O,是参与肾上腺糖皮质激素合成中唯一非细胞色素P450家族中的酶;3β-HSD催化孕烯醇酮生成孕酮、17α-羟孕烯醇酮转化为17α-羟孕酮、雄烯二醇生成睾酮等多步化学反应。3β-HSD通过参与细胞内甾体激素生成,进而在生殖系统中发挥功能。此外,3β-HSD在脑、脂肪组织中也有较强表达,本文就3β-HSD在甾体激素生成组织中的功能及其临床意义进行总结。     

3β,20α-羟基甾体脱氢酶的动力学性质

3β,20α-羟基甾体脱氢酶(3β,20α-Hydroxysteroid dehydrogenase,3β,20α-HSD)是从胎羊血中分离得到的。分子量为35kD。该酶以NADPH为辅酶,有两种底物。以孕酮为底物时,Km=30.8μmol/L,Vmax=0.7nmol min~(-1)(nmol enzyme)~(-1);以5α-二氢睾酮(5α-Dihydrotestosterone,5α-DHT)为底物时,Km=74μmol/L,Vmax=1.3nmol min~(-1)(nmol enzyme)~(-1)。5α-DHT竞争性抑制20α-还原活性,Ki=102μmol/L。16α-溴代乙酰氧基(16α-Bromo acetoxyprogesterone,16α-BAP)是3β,20α-HSD不可逆竞争性抑制剂,t_(1/2)=75min。对3β和20α还原活性的抑制常数Ki分别为23μmol/L和58μmol/L。     

hFOXP3-△E251的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的:构建和表达带HIV-TAT穿膜序列(Protein transduction domain,PTD)的人FOXP3突变体PTD-hFoxP3-△E251,为研究人FOXP3的功能奠定基础.方法:采用逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcTiption-polymerase chain reaction,RT-PCR)方法,从人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)总RNA中扩增得到人FOXP3(hFOXP3)的cDNA,然后再利用重叠PCR技术扩增获得hFOxP3-△E251基因实变体片段.将该重组突变体插入表达载体pET28a-PTD中,构建表达质粒pET28a-PTD-hFOXP3-△E251,然后转化感受态细菌E.coli Rosetta(DE3),最终采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达.结果:SDS-PAGE电泳分析发现,经0.5mM IPTG诱导8h后,可高效表达重组的融合蛋白,表达产物以包涵体形式存在.结论:成功制备了带穿膜序列的人FOXP3△E251突变体融合蛋白.为更好地研究人FOXP3的功能与特性奠定了实验基础.     

Δ5-3β,7β-二羟基甾醇及其C-7差向异构体波谱特征及胆碱酯酶的抑制活性

本文对Δ5-3β,7β-二羟基甾醇(1~3)和Δ5-3β,7α-二羟基甾醇(4~6)的一些核磁共振波谱特征进行了比较。活性测试表明化合物1~6对乙酰胆碱酯酶(AChE)无明显的抑制活性,对丁酰胆碱酯酶(BuChE)则有较强的抑制活性,其中24-亚甲基胆甾-5-烯-3β,7α-二醇(6)的IC50值为9.5μM。通过活性数据比较我们发现7α-羟基甾醇对丁酰胆碱酯酶的抑制活性明显比相应的7β-羟基甾醇高。我们通过计算7位羟基和四环平面之间的二面角角度来尝试解释这些活性差别。     

L-酪氨酸对大鼠黄体细胞3β-羟-甾体脱氢酶活性的影响

目的:研究L-酪氨酸对离体培养大鼠黄体细胞3β-HSD活性的影响.方法:运用细胞培养技术和放射免疫分析法,观察不同剂量L-酪氨酸对大鼠黄体细胞3β-HSD活性的影响和L-酪氨酸及其类似物酪氨酰肼在拮抗hCG诱导孕酮生成作用中,3β-HSD活性的变化.结果:①0.2 mmol-1和2.0 mmol-1的L-酪氨酸明显抑制3β-HSD的活性,相同浓度的L-苯丙氨酸及L-多巴胺对此酶活性无影响;②在底物浓度较低时,L-酪氨酸可显著增强3β-HSD活性,随着底物浓度的增加,L-酪氨酸的作用逐渐减弱并转为抑制作用.③L-酪氨酸及酪氨酰肼对hCG诱导的3β-HSD活性有明显的抑制作用.结论:L-酪氨酸可明显影响大鼠黄体细胞3β-HSD活性,其作用性质与底物浓度密切相关.L-酪氨酸及酪氨酰肼抑制hCG诱导的3β-HSD活性.     

酪氨酸对未成年大鼠卵巢Δ~5-3β-羟类固醇脱氢酶活性的影响

利用PMSG(妊娠母马血清促性腺激素)及HCG(人羢膜促性腺激素)处理的未成年大鼠卵巢匀浆,通过测定Δ~5-3β-羟类固醇脱氢酶(HSD)活性,研究了酪氨酸影响孕酮的代谢机理。结果表明,同一浓度的酪氨酸(60微克/毫升)加到排卵后不同时间(12—72小时)的卵巢匀浆中,Δ~5-3β-HSD活性增加,并随着时间延长有逐渐增加的趋势。酪氨酸组同对照组间差异非常显著(P<0.001),不同浓度的酪氨酸(30—160微克/毫升)加到排卵后同一时间(24小时)的卵巢匀浆,也能提高Δ~5-3β-HSD活性,酪氨酸组与对照组间差异非常显著(P<0.001)。     

A环饱和甾体的微生物转化作用II.降解5a一△16一3β一羟基-孕甾烯-20-酮-3β-醋酸酯为△1,4-雄甾二烯-3，17一二酮

节杆菌9—2能彻底降解5a一△16一3β一羟基一孕甾烯一20一酮一3β一醋酸酯(I)形成二氧化碳和水。在它的培养基质中添加钴离子可抑制甾核的进一步降解,从而积累中间产物△1,4-雄甾二烯-3,17一二酮(VI),     

黄颡鱼20β-羟基类固醇脱氢酶Ⅰ和Ⅱ基因特征分析和表达模式研究

为探讨20β-羟基类固醇脱氢酶Ⅰ和Ⅱ(20β-HSDⅠ/Ⅱ)在黄颡鱼中的基因特征和表达模式, 研究从黄颡鱼中克隆了这2个基因的全长cDNA。对鱼类2个20β-HSD的系统进化分析和共线性分析结果发现, 20β-hsd基因的复制可能不是TSGD的结果。序列对比结果表明, 鱼类2个20β-HSD可能具有相似的空间结构, 结合相似的辅酶和底物, 但催化产物可能有差异。黄颡鱼2个20β-hsd基因均表达于多个组织, 其中20β-hsdⅠ主要表达于精巢、卵巢、头肾和肾脏中, 而20β-hsdⅡ则高表达于精巢、卵巢、心脏、头肾、肾脏、肠、垂体和肝脏。季节表达模式的研究发现, 在繁殖季节(5月)的黄颡鱼精巢中, 20β-hsdⅠ的表达相对较低, 而20β-hsdⅡ高表达。对黄颡鱼雄性成鱼注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)(1000 IU/kg体重)后, 20β-hsd Ⅰ的表达先显著升高, 随后迅速显著下调; 而20β-hsdⅡ的表达则持续显著上升。上述结果表明, 黄颡鱼20β-hsdⅠ和20β-hsdⅡ在hCG处理下表达模式存在较大差异。     

甾体微生物转化C11β-羟基化的研究进展

C11β-羟基化是甾体微生物转化中难以实现的一步反应。对甾体C11β-羟基化的机理及部分生理生化问题进行了讨论,对蓝色犁头霉和新月弯孢霉催化转化甾体C11β-羟基化的应用研究特点及其催化转化反应产物氢化可的松的工业生产现状及相关问题进行了评述,并对此技术开发前景进行了预测。     

黑曲霉催化雄甾-4-烯-3,17-二酮16β-羟基化

为进一步确定黑曲霉菌株TCCC41650的生物转化能力,以雄甾-4-烯-3,17-二酮(Androstenedione)为底物,利用黑曲霉菌株TCCC41650进行催化,产物经纯化、重结晶后,通过单晶衍射鉴定为16β-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮。转化条件为:培养液pH 6.0,乙醇添加量为2%,投料浓度为1‰时,72 h转化率为85.8%。目前甾体研究领域对于C16β-羟基化的微生物转化未见报道,研究结果为C16β-羟基甾体药物的研发奠定了基础。     

A环饱和甾体的微生物转化作用III．倍他美松中间体16β-甲基-5a-△9(11)-孕甾烯-3β,17a, 21-三羟基一20一酮一21一醋酸酯的△1.4 作用

节杆菌9—2在一定浓度的氯化钻存在下转化16β一甲基一5a一△9(11)一孕甾烯-3β,17a,21-三羟基一20一酮21-醋酸酯(I)为16β-甲基-A1.4,9(11)-孕甾三烯-17a,21一二羟基-3,20-二酮(n)。转化的最适条件为氯化钴浓度0．08％;乙醇2一4％;pH 7—8;温度28—30℃。在此条件下,产物(II)的收率在60％以上。     

新月弯孢霉AS 3.4381对新型甾体底物C11β-羟基化

应用本实验室保藏的新月弯孢霉Curvularia lunataAS 3.4381对新型甾体化合物(Ⅰ)(16α,17β-二甲基-17-丙酰基雄甾-1,4-二烯-3-酮)作为底物进行生物转化C11β-羟基化反应的研究。实验研究结果表明,采用Ⅱ级发酵的工艺,收获新月弯孢霉菌丝体作为生物催化剂,在磷酸缓冲液介质体系中,对化合物Ⅰ的C11位实现β羟基化,生成皮质激素药物。测试数据TLC,MS,IR及1H NMR证明了该产物的化学结构,表明生物转化产物为C11β-羟基-16α,17β-二甲基-17-丙酰基雄甾-1,4-二烯-3-酮。     

燕麦β-1,3-葡聚糖酶Ⅱ基因 3'端cDNA的克隆及分析

实验利用3'-RACE技术进行燕麦β-1,3-葡聚糖酶Ⅱ(Oglc13Ⅱ)3'末端cDNA的快速扩增并进行序列分析.将0.01%的HgCl2诱导处理24h之后的燕麦(Avena Sativa)幼叶作为材料,利用RT-PCR技术得到Oglc13Ⅱ的部分cDNA片段,根据此片段设计一条特异性上游引物,反转录引物中的部分序列即3'sites Adaptor Primer作为下游引物,按3'RACE试剂盒(Takara)操作流程进行Oglc13Ⅱ3'末端cDNA的快速扩增,成功获取837bp的3'-RACE反应产物,通过BLAST技术,发现该片段与许多植物β-1,3-葡聚糖酶基因具有较高的相似性(50.0%～72.0%).因此认为成功克隆了Oglc13ⅡcDNA的3'末端序列.     

十个甾体皂甙元的~(13)C NMR谱

本文报道心不甘(Tupistra aurantiaca Wall et Backer)的十个甾体皂甙元:△~5一系列的3-epiruscogenin(1),3-epi-ruscogenin(2),tupisgenin(3)和aurantigenin(4),5-β-系列的ranmogenin A(5)、B(6)、C(7)、D(8)、△~(25(27))—pentrogenin(9)和1β、2β、3β、4β、5β、7α-hexahydroxy-spirost-25(27)-en-6-one(10)的~(13)C NMR的归属和解析的研究结果。     

燕麦β-1,3-葡聚糖酶Ⅱ基因3′端cDNA的克隆及分析

实验利用3′-RACE技术进行燕麦β-1,3-葡聚糖酶Ⅱ(Oglc13Ⅱ)3′末端cDNA的快速扩增并进行序列分析。将0.01%的HgCl2诱导处理24h之后的燕麦(Avena Sativa)幼叶作为材料,利用RT-PCR技术得到Oglc13Ⅱ的部分cDNA片段,根据此片段设计一条特异性上游引物,反转录引物中的部分序列即3′sites Adaptor Primer作为下游引物,按3′RACE试剂盒(Takara)操作流程进行Oglc13Ⅱ3′末端cDNA的快速扩增,成功获取837bp的3′-RACE反应产物,通过BLAST技术,发现该片段与许多植物β-1,3-葡聚糖酶基因具有较高的相似性(50.0%~72.0%)。因此认为成功克隆了Oglc13ⅡcDNA的3′末端序列。     

总状毛霉对4-烯-3-酮甾体的生物转化研究

从土样中筛选到一株能转化甾体的菌株,经形态观察,鉴定为总状毛霉(Mucor racemosus)。首次利用该菌株对4-烯-3-酮类甾体衍生物进行生物转化,目的是合成具有潜在活性的羟基类4-烯-3-酮衍生物。转化条件为27℃,220r/min振荡培养4d。转化产物经乙酸乙酯萃取,用硅胶柱层析法分离,通过红外、质谱和核磁分析确定了甾体转化产物的化学结构。黄体酮生物转化得到的产物是14α-羟基-4-孕甾烯-3,20-二酮和7α,14α-二羟基-4-孕甾烯-3,20-二酮;4-雄烯二酮的转化产物是14α-羟基-雄甾-4-烯-3,17-二酮1、4α,17β-二羟基-雄甾-4-烯-3-酮和6α,17β-二羟基-雄甾-4-烯-3-酮。研究结果表明总状毛霉具有转化甾体的能力,对4-烯-3-酮类甾体进行生物转化的主要产物是14α-羟基甾体衍生物。