鼠伤寒沙门菌微孔蛋白的免疫学研究进展

本文对鼠伤寒沙门菌（ＳＴＭ）微孔蛋白的免疫学研究作了阐述,分析了ＳＴＭ－微孔蛋白的结构、功能及遗传学,展示了研究ＳＴＭ－微孔蛋白所面临的问题及实际应用价值。     

鼠伤寒沙门菌spvBC基因编辑株的构建

利用λRed重组系统和pBAD原核表达载体构建鼠伤寒沙门菌spvBC质粒毒力基因修饰菌株,为深入探究沙门菌毒力基因spv的功能和致病机制及宿主抗感染免疫提供工具菌。以pKD4为模板,PCR扩增含spvBC同源臂的卡那霉素抗性基因以构建同源打靶片段,再将其电转入含有质粒pKD46的鼠伤寒沙门菌中进行同源重组,随后将质粒pCP20电转导入阳性转化子,消除卡那霉素抗性基因,PCR鉴定敲除株的构建。PCR扩增含酶切位点的spvBC基因片段,扩增产物与原核表达载体pBAD/gⅢ分别双酶切后连接构建pBAD-spvBC重组质粒,PCR筛选阳性菌落并测序鉴定。将构建成功的pBAD-spvBC重组质粒电转导入spvBC敲除株中,Western blot测定不同浓度L-阿拉伯糖诱导SpvB和SpvC蛋白表达情况。PCR结果表明鼠伤寒沙门菌spvBC基因敲除成功;PCR及测序结果表明pBAD-spvBC重组质粒构建成功,Western blot结果表明13 mmol/L L-阿拉伯糖可诱导SpvB和SpvC蛋白正常表达。λRed重组系统可用于沙门菌质粒上大片段基因的敲除,pBAD原核表达载体可用于沙门菌质粒上大片段基因的回补,丰富了细菌质粒的基因修饰和编辑策略。     

鼠伤寒沙门菌rtsB基因缺失株的构建及其生物学特性

【背景】鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)是一种重要的人畜共患病原菌,严重危害养殖业及人类健康。调控蛋白在病原菌的生存及感染过程中发挥重要作用。【目的】构建鼠伤寒沙门菌调控基因rtsB缺失株和互补株,分析调控蛋白RstB对鼠伤寒沙门菌生物学特性和致病性的影响。【方法】利用Red同源重组的方法构建鼠伤寒沙门菌SAT52的rtsB基因缺失株,并利用互补质粒构建互补株。然后比较分析野生株SAT52、缺失株?rtsB和互补株C?rtsB的生长特性、运动性、生物被膜形成能力、黏附入侵能力、胞内存活能力及致病性的差异。【结果】缺失rtsB基因不影响SAT52的生长速度,但导致运动能力增强,生物被膜形成能力减弱。细胞感染试验结果表明,rtsB基因有助于鼠伤寒沙门菌对Hela细胞的黏附入侵及RAW264.7细胞内的存活。动物试验结果表明rtsB基因缺失显著降低鼠伤寒沙门菌的致病力。【结论】rtsB基因在鼠伤寒沙门菌感染过程中发挥重要作用,可为阐释鼠伤寒沙门菌的致病机制提供参考。     

双歧杆菌防治鼠伤寒沙门菌感染的实验研究

目的　以小鼠为模型,研究双歧杆菌在体内对鼠伤寒沙门菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ,ＳＴＭ） 感染的防治作用。方法　分别用大剂量悉复欢、Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ 、生理盐水（ＮＳ） 给三组小鼠灌胃,再用ＳＴＭ 攻击,观察小鼠经上述不同处理前后肠道双歧杆菌数量和ＳＴＭ 攻击后粪便ＳＴＭ 培养阳性率,阳性标本ＳＴＭ 分离值及小鼠ＳＴＭ 感染率;同时用双歧杆菌、悉复欢、双歧杆菌加悉复欢分别治疗ＳＴＭ 感染的小鼠,观察并比较疗效。结果　１． 大剂量悉复欢使用可使小鼠肠道内双歧杆菌明显降低,而双歧杆菌灌胃则肠道双歧杆菌明显增多。双歧杆菌灌胃的小鼠粪便ＳＴＭ培养阳性率、阳性粪便ＳＴＭ 值明显低于用大剂量悉复欢和ＮＳ 的小鼠,小鼠ＳＴＭ 感染发病率也明显较低。２． 对于ＳＴＭ 感染鼠,双歧杆菌与悉复欢联合治疗效果最好。结论　１． 双歧杆菌在体内对ＳＴＭ 有拮抗作用;能预防和减少ＳＴＭ 感染发生;２． 在ＳＴＭ 感染时,先用悉复欢,再用双歧杆菌可以达到预期疗效,双歧杆菌对鼠伤寒沙门菌感染有辅助治疗作用。     

鼠伤寒沙门菌动物模型活体成像技术的研究进展

鼠伤寒沙门菌的体内实验有利于开展食物中毒、胃肠炎、伤寒热等肠道传染病的防治。由于在活体内检测鼠伤寒沙门菌的动态变化存在瓶颈,使细菌致病机制的研究、疫苗及药物研发滞后。近年来应用小动物成像技术在活体中追踪转化了荧光素酶基因的鼠伤寒沙门菌越来越受到人们关注,综述该技术的应用现状及缺憾之处。     

鼠伤寒沙门菌spvB基因缺陷突变株的构建

高度保守的spvB基因,其编码产物具有ADP核糖基转移酶活性,是导致受染后细胞发生凋亡的重要毒力因子.为进一步研究该基因致病机制,构建了鼠伤寒沙门菌spvB基因缺陷突变株.根据GenBank鼠伤寒沙门菌spvB基因序列,用Primer Premier 5.0设计PCR特异性引物,获得spvB基因缺陷性核苷酸片段后连接至自杀质粒PGMB151.将构建的自杀载体导入含有spvB基因的鼠伤寒沙门菌标准株SR-11中进行同源重组,PCR筛选缺陷突变株.经PCR和DNA序列测定,成功获得了spvB基因缺陷的鼠伤寒沙门菌突变株.     

鼠伤寒沙门菌pStSR100质粒对生物膜形成的影响

目的:鼠伤寒沙门菌在多种表面形成的生物膜对其致病性和引起食物中毒等方面起着重要作用,本研究探讨鼠伤寒沙门菌pStSR100质粒对细菌在不同材质表面生物膜形成的影响。方法:用LB(Luria-Bertani,LB)培养基和TSB(Tryptose Soya Broth,TSB)培养基分别将携带pStSR100质粒的野生株在96孔板与放置无菌小圆玻片的24孔板中静态培养48 h,用结晶紫半定量法确定生物膜形成的适宜培养基。将野生株与消除质粒的突变株,用结晶紫半定量法和激光共聚焦显微镜(Confocal Laser scanning microscopy,CLSM)观察其在聚苯乙烯培养板和小圆玻片表面形成生物膜的差异。结果:用LB培养时细菌生物膜的形成能力高于用TSB培养,LB培养基更适宜生物膜形成;结晶紫半定量法结果表明野生株比突变株在小圆玻片表面形成生物膜的能力明显增强,而在聚苯乙烯培养板表面两者则无明显差异;CLSM观察发现,野生株在小圆玻片表面形成融合成片的大克隆,突变株仅形成较小克隆。结论:鼠伤寒沙门菌pStSR100质粒能促进该菌在亲水性材质表面生物膜的形成,但其对该菌在疏水性材质表面生物膜的形成未见明显影响,这一新发现为进一步研究鼠伤寒沙门菌生物膜形成的调控机制,研制抗感染材料提供了理论和实验依据。     

鼠伤寒沙门菌pStSR100质粒对生物膜形成的影响

目的：鼠伤寒沙门菌在多种表面形成的生物膜对其致病性和引起食物中毒等方面起着重要作用,本研究探讨鼠伤寒沙门菌pStSR100质粒对细菌在不同材质表面生物膜形成的影响。方法：用LB（Lufia—Bertani,LB）培养基和TSB（TryptoseSoyaBroth,TSB）培养基分别将携带pStSR100质粒的野生株在96孔板与放置无菌小圆玻片的24孔板中静态培养48h,用结晶紫半定量法确定生物膜形成的适宜培养基。将野生株与消除质粒的突变株,用结晶紫半定量法和激光共聚焦显微镜（ConfocalLaserscanningmicroscopy,CLSM）观察其在聚苯乙烯培养板和小圆玻片表面形成生物膜的差异。结果：用LB培养时细菌生物膜的形成能力高于用TSB培养,LB培养基更适宜生物膜形成;结晶紫半定量法结果表明野生株比突变株在小圆玻片表面形成生物膜的能力明显增强,而在聚苯乙烯培养板表面两者则无明显差异;CLSM观察发现,野生株在小圆玻片表面形成融合成片的大克隆,突变株仅形成较小克隆。结论：鼠伤寒沙门菌pStSR100质粒能促进该茵在亲水性材质表面生物膜的形成,但其对该菌在疏水性材质表面生物膜的形成未见明显影响,这一新发现为进一步研究鼠伤寒沙门菌生物膜形成的调控机制,研制抗感染材料提供了理论和实验依据。     

鼠伤寒沙门菌baeSR基因缺失株的构建及其对抗生素敏感性分析

【背景】沙门菌的多重耐药现象日渐严重,对其耐药机理的研究尤为迫切,双组分系统与细菌耐药性密切相关。【目的】构建鼠伤寒沙门菌baeSR基因缺失株及回补株,探究双组分系统BaeSR对鼠伤寒沙门菌耐药性的影响。【方法】以鼠伤寒沙门菌体外诱导耐药株CR为研究对象,通过自杀质粒p LP12介导的同源重组方法,以氯霉素抗性标记和阿拉伯糖诱导的致死基因vmt进行正、反向双重筛选,获得基因缺失株CRΔbaeSR,并将重组表达质粒pBAD-baeSR转化于CRΔbaeSR构建回补株CR CΔbaeSR。采用微量肉汤稀释法测定11种常见代表药物对野生株、缺失株及回补株的最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC),并测定3株菌的生长曲线、运动性及生物膜形成能力。【结果】与野生株相比,环丙沙星(CIP)、恩诺沙星(ENR)、沙拉沙星(SAR)、头孢噻呋(CEF)、庆大霉素(GEN)、阿米卡星(AMK)、安普霉素(APR)对缺失株的MIC值有所下降;缺失株的生长速率稍显缓慢,且最终浓度也相对较低,但并无统计学上的显著差异(P0.05);缺失株的运动性(P0.05)及生物膜形成能力(P0.01)均显著下降。【结论】鼠伤寒沙门菌baeSR基因缺失后,可通过影响其运动性及生物膜形成能力而对抗生素的敏感性产生影响。     

鼠伤寒沙门菌外膜蛋白与耐药性关系的分析

目的分析鼠伤寒沙门菌外膜蛋白(OMP)与耐药性的关系。方法用消除剂丫啶橙消除耐药性,盲传测其遗传稳定性,采用超声波物理裂解法制备鼠伤寒沙门菌外膜蛋白标本,用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDA-PAGE)检测外膜蛋白,用紫外分光光度计测其吸光值,计算浓度。结果抗性消除表型能稳定遗传,耐药鼠伤寒沙门菌与敏感鼠伤寒沙门菌都含有6条主要的外膜蛋白条带,两者相比,发现耐药菌的外膜蛋白在约57、53、30 kDa处减弱或缺失,总的蛋白浓度也低于后者。结论鼠伤寒沙门菌耐药性与外膜蛋白的减弱或缺失有关。     

自噬对鼠伤寒沙门菌所致的巨噬细胞凋亡的影响

为探讨鼠伤寒沙门菌与巨噬细胞共作用时细胞自噬对凋亡的影响,用加入自噬诱导剂雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)和未加RAPA的RPMI1640过夜培养小鼠腹腔巨噬细胞J774A.1,以携带一分子量为100kb毒力质粒的鼠伤寒沙门菌标准毒株SR-11为受试菌。首先测定RAPA对菌量及细胞活性的影响,然后建立细胞感染模型,在细菌与细胞共作用后动态观察24h,不同时间点检测细胞超微结构变化、自噬泡的形成、Beclin-1和Bcl-2的表达、细胞存活率和胞内活菌计数以及细胞凋亡情况。结果显示,RAPA单独作用于细菌或细胞时菌量及细胞活性均无变化;而对细胞感染模型而言,RAPA作用与否细胞内的细菌数及细胞存活率均有显著改变,RAPA可明显降低细胞内活菌数及其所致的巨噬细胞凋亡率(P0.05);RAPA干预组在细菌与细胞共作用早期,部分细菌可被双层膜包裹形成自噬泡,细胞超微结构正常;Beclin-1的表达量增加,而Bcl-2的表达量降低;后期细胞破坏程度明显轻于未用RAPA组。以上结果提示,通过调控细胞自噬水平以减轻宿主细胞凋亡,可作为防治某些感染性疾病的新途径。     

鼠伤寒沙门菌7个未知功能岛在致病性中的作用

【目的】探索沙门菌在进化过程中通过水平转移获得的未知功能岛在其致病过程中的作用,发现新的与致病性相关的岛。【方法】以鼠伤寒沙门菌ATCC 14028为亲本株,利用λRed重组酶系统分别构建了7个未知功能岛(STM14_0667-0673、2682-2687、2885-2891、3721-3728、4247-4253、4823-4828、5331-5341)的突变株,通过细胞侵袭实验、巨噬细胞内复制力检测及小鼠实验比较了野生型和突变株的毒力差异。【结果】Δ2682-2687和Δ5331-5341对上皮细胞的侵袭力显著低于野生型(P0.01);Δ2682-2687、Δ2885-2891和Δ5331-5341在巨噬细胞内的复制力、对小鼠的致死率以及在小鼠肠道和肝、脾的定殖能力均显著低于野生型(P0.05);其余4个突变株(Δ0667-0673、Δ3721-3728、Δ4247-4253、Δ4823-4828)的侵袭力、胞内复制力以及对小鼠的致病力与野生型相比无显著差异。【结论】发现3个未知功能岛显著影响鼠伤寒沙门菌的致病力,为深入研究这些岛的功能及调控机制奠定了基础。     

不同种株利什曼原虫前鞭毛体体外向无鞭毛体转化的研究

目的 观察不同种株利什曼原虫前鞭毛体在不同体外培养条件下向无鞭毛体的转化.方法 将6个对数生长期的不同种株利什曼原虫前鞭毛体接种于含M199和RPMI 1640复合培养液的24孔板内,在不同温度、pH值、血清、CO2下培养,第3天和第6天分类计数不同形态的原虫.结果 当培养温度为26℃,而其他培养条件发生变化时,利什曼原虫的增殖速度发生变化,大多数原虫保持前鞭毛体典型性形态,运动活跃.当培养温度上升至37℃,不论其他培养条件如何变化,原虫均沉积于培养孔底,停止增殖,运动减缓,显著地向中间体和无鞭毛体转化,酸性pH值和5%CO2可促进前鞭毛体转化为无鞭毛体,新生小牛血清可延长无鞭毛体的成活.但相同的培养条件下,杜氏利什曼原虫转化效率低于其他种株利什曼原虫.结论 温度是影响利什曼原虫前鞭毛体转化为无鞭毛体的基本因素,酸性pH值与CO2可协同温度促进转化,不同种株利什曼原虫的遗传异质性可影响转化效率.     

伤寒─鼠伤寒重组株Vi4072的效力试验研究

伤寒─鼠伤寒重组株Ｖｉ４０７２所产生Ｖｉ抗原以伤寒Ｔｙ２株所产Ｖｉ抗原作对照,通过ＥＤ５０测定和小白鼠被动保护试验作了比较,结果表明Ｖｉ４０７２株Ｖｉ抗原的半数有效剂量为０．０１３６μｇ,Ｔｙ２株的半数有效剂量为０．０１８３μｇ,说明Ｖｉ４０７２─Ｖｉ对小白鼠的保护作用不低于Ｔｙ２─Ｖｉ。被动保护试验证明,在同等条件下,两种Ｖｉ抗原的免疫血清对小白鼠提供的保护作用相同。     

伤寒─鼠伤寒重组株Vi4072的效力试验研究

伤寒─鼠伤寒重组株Ｖｉ４０７２所产生Ｖｉ抗原以伤寒Ｔｙ２株所产Ｖｉ抗原作对照,通过ＥＤ５０测定和小白鼠被动保护试验作了比较,结果表明Ｖｉ４０７２株Ｖｉ抗原的半数有效剂量为０．０１３６μｇ,Ｔｙ２株的半数有效剂量为０．０１８３μｇ,说明Ｖｉ４０７２─Ｖｉ对小白鼠的保护作用不低于Ｔｙ２─Ｖｉ。被动保护试验证明,在同等条件下,两种Ｖｉ抗原的免疫血清对小白鼠提供的保护作用相同。     

肠道菌群代谢产物在鼠伤寒沙门菌感染中的作用研究进展

人和动物肠道内生存着多种多样的微生物群体,它们与宿主共同进化,对宿主的健康至关重要。肠道菌群可以发酵宿主难以消化的复杂碳水化合物,为宿主肠道细胞提供能量,同时其代谢产物对肠道病原菌沙门菌的感染产生着重要影响。正常情况下,肠道菌群代谢产物如丁酸与丙酸可以抑制沙门菌在肠道中的定植或者毒力基因的表达,而在肠道菌群受到扰乱时,其代谢的琥珀酸盐和1,2 丙二醇等物质却能促进沙门菌增殖。近年来,越来越多的研究揭示了肠道菌群代谢产物对沙门菌感染的影响。本综述通过总结近年来关于鼠伤寒沙门菌入侵时肠道菌群代谢产物改变的研究,综合阐述了肠道菌群代谢产物影响沙门菌感染的机制。     

肿瘤生物治疗的新方法——减毒鼠伤寒沙门菌的应用

减毒鼠伤寒沙门菌由于具有肿瘤靶向性,能在肿瘤组织中复制并产生抗肿瘤效果的能力,使肿瘤治疗获得了新契机。减毒鼠伤寒沙门菌作为细菌载体使目的基因在肿瘤组织内特异表达,表现出良好治疗效果。近期研究发现,单独使用突变后的菌株A1-R在裸鼠模型上治疗乳腺癌和前列腺癌分别可达到40％和50％的治愈率;在小鼠肿瘤转移模型中也展现出良好的治疗效果。鼠伤寒沙门菌作为肿瘤治疗制剂有诱人的前景。本文就这些研究的最新进展做一综述。     

鼠伤寒沙门菌SL1344株环化腺苷酸合成酶缺失株平衡致死系统的构建及其雏鸡免疫保护试验

摘要:【目的】为构建鼠伤寒沙门菌环化腺苷酸合成酶缺失株平衡致死系统,并对其生物学特性进行检测。【方法】以鼠伤寒沙门菌SL1344Δcya株为亲本株,利用重组自杀性质粒(pREΔasd)介导的同源重组技术,经两步法缺失并筛选asd基因缺失株(SL1344Δcya Δasd)。将含asd基因且无抗性的pYA3493质粒电转化至缺失株SL1344ΔcyaΔasd,构建重组菌株SL1344ΔcyaΔasd (pYA3493)。【结果】试验结果表明,重组菌株SL1344ΔcyaΔasd(pYA3493)生化特性和生长速度与参考株SL1344相比差异较大,与亲本株SL1344Δcya基本一致,SL1344ΔcyaΔasd(pYA3493)失去了利用麦芽糖、乳糖、山梨醇等碳源的能力,也不能分解H2 S、半乳糖和鼠李糖,但仍保留了利用葡萄糖的能力。对1日龄雏鸡攻毒试验表明,SL1344ΔcyaΔasd(pYA3493)毒力较参考株SL1344降低了约104倍。免疫保护试验显示,1日龄雏鸡免疫SL1344ΔcyaΔasd(pYA3493)后第17天,利用鼠伤寒沙门菌参考株攻毒,保护率为62.5%。【结论】鼠伤寒沙门菌SL1344株环化腺苷酸合成酶缺失株平衡致死系统构建成功,且具有较好的免疫保护性,为深入研究以鼠伤寒沙门菌为载体的口服疫苗奠定基础。